霊長類IPSCは有用ですが、倫理的および技術的な問題のために入手が困難なことがよくあります。このプロトコルは、霊長類IPSCの生成と維持への最もアクセスしやすいパスを提供します。IPSCの主要な供給源としての尿中細胞の使用は、特別な技術なしで完全に非侵襲的な方法で得ることができるため、大きな利点があります。
手順を実演するのは、ヴォルフガングM.S.研究所の博士課程の学生であるジェシカ・ラドマーです。まず、尿を含むチューブを400Gで10分間遠心分離します。次に、上清を注意深く吸引し、チューブ内に約1ミリリットルを残し、ペレットを再懸濁します。
アムホテリシンを含む10ミリリットルの尿洗浄バッファーを加えて細胞を洗浄し、血清学的ピペットを使用して懸濁液を注意深く混合します。遠心分離後、上清を注意深く吸引し、チューブ内に約0.2ミリリットル未満を残します。細胞ペレットを、最初に処理された尿50ミリリットルあたりアムホテリシンを含む1ミリリットルの一次尿培地に再懸濁します。
ゼラチンを除去し、1ミリリットルの懸濁液をゼラチンコーティングされた12ウェルプレートのウェルに加える。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。基底膜マトリックスコーティングされた12穴プレートを調製するために、1ウェルあたり500マイクロリットルの基底膜マトリックスを添加する。
プレートを動かして液体を分配し、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、基底膜マトリックスを900マイクロリットルのREMC培地と交換し、使用するまで摂氏37度で保存します。方程式を使用して、5の感染の多重度に必要なセンダイウイルスの量を計算します。
仙台再プログラミングキットのコンポーネントを摂氏37度で焼き戻した水浴ですばやく解凍します。合計100マイクロリットルのREMC培地をチューブに入れてから、計算量のセンダイウイルスを加えて混合します。原稿に記載されているように尿中細胞を解離した後、セルカウンターを使用して細胞を数え、所望の数の細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。
遠心分離によりペレットを得、調製したセンダイウイルス混合物100マイクロリットルに再懸濁する。懸濁液感染のために摂氏37度で1時間チューブをインキュベートします。インキュベート後、細胞懸濁液を基底膜マトリックスコーティングした12穴プレートに播種する前に合計1ミリリットルとなるようにREMCを添加する。
形質導入後、5日目にPSC生成培地に切り替えて人工多能性幹細胞(IPSC)コロニーが発達するまで2日おきに培地を交換する。IPSCコロニーが凝集塊継代に十分な大きさになったら、培養細胞から培地を吸引し、500マイクロリットルのDPBSで細胞を注意深く洗浄します。DPBSを除去した後、500マイクロリットルの0.5ミリモルEDTAをウェルに加え、2〜5分間インキュベートします。
コロニーが剥離し始めるまで顕微鏡下で細胞を注意深く観察する。コロニーの端が剥がれ始め、細胞間の隙間が見えたら、EDTAを取り外し、500マイクロリットルのDPBSを慎重に追加します。DPBSを吸引し、P-1000ピペットを使用して500マイクロリットルのPSC培養液でウェルを洗い流します。
ピペットを上下に動かして、コロニーを適切なサイズの塊に分散させます。コンフルエント性、播種細胞の所望の密度およびIPSCクローンの好みに応じて、細胞凝集塊懸濁液の1/10〜1/50を新しいウェルに移す。プレートをゆっくりと数回前後に動かして、塊をウェル内に均等に分散させます。
プレートを摂氏30度で少なくとも37分間インキュベートして、塊を付着させます。コロニーが継代に十分な大きさになるまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。単離後、尿とともに排泄された扁平上皮細胞および様々なより小さな丸い細胞が見られる。
最初の接着増殖細胞が見られ、これらの細胞は継代可能な大きなコロニーに成長する。2つの異なる細胞型が見られ、1つは上皮様表現型を有し、もう1つは細長い形状を有するより間葉系様表現型を示す。最初の継代後、尿中細胞は単層として成長します。
IPSCの生成中に、いくつかの接着細胞が見られ、これらの細胞は形態学的変化を示し始め、細胞の再プログラミングを示します。さらに、コロニーを形成する細胞は、典型的な胚性幹細胞形態を示す。生成されたすべてのIPSCは、明確なエッジを持つ密集した細胞を特徴とする、典型的な胚性幹細胞様コロニー形態を共有しています。
免疫細胞化学は、ゴリラIPSCにおける多能性関連マーカーの発現を試験するために使用されました。さらに、フローサイトメトリー分析は、分析されたオランウータンIPSCがTRA-1-60に対して陽性であることを示しました。さらに、ゴリラIPSCは、内胚葉、中胚葉、外胚葉の系統に分化することができます。
分化した細胞数の増加と境界の完全性と均一性の喪失は、IPSC品質が低いことを示しています。対照的に、明確な境界、タイトな細胞パッケージング、および目立つ核小体は、高品質のIPSCを意味します。コロナの変動性のため、霊長類IPSCを健康に保つには、分裂率、継代タイミング、凝集塊サイズなどのクローン固有の条件を最適化する必要があります。
確立されたIPSCの品質管理として、マーカー遺伝子発現のチェックに加えて、in vitro EV分化などの直接的または間接的な分化誘導によって効力を検証できます。
