細胞膜の電気生理学的特性を測定することによって、細胞の電気的活動を調節することが主な証明の問題は解決され得る。全細胞パッチクランプ記録は、個々の細胞内のイオン電流を研究し、さまざまな刺激に対する細胞応答を調べるための周辺技術です。全細胞パッチクランプの事前記録で最高のパフォーマンスは、多くの練習と勉強の後に達成されます。
脳解剖を開始するには、斬首された動物の頭蓋骨の上部にある皮膚を尾側から吻側まで外科用ハサミを使用して切開し、頭皮を取り除きます。次に、虹彩ハサミで矢状縫合糸に沿って頭頂間プレートを切り、後頭骨を取り除きます。骨切りを頭頂骨の下にスライドさせ、脳が露出するまでゆっくりと引き出します。
脳を露出させた後、頭を逆さまにします。脳をゆっくりと下げて、両側の三叉神経を視覚化します。次に、カストロビエホ湾曲ハサミを使用して三叉神経を切断します。
視床下部を視覚化した後、視神経を識別し、それを穏やかに切断します。次に、前頭葉の前部を切断します。脳を取り除き、スライスが得られるまですぐにスライス溶液に浸します。
脳サンプルをスライスするには、脳をろ紙の上に置き、余分な溶液を乾燥させます。次に、鋭利な切断かみそりの刃で冠状切断を行い、小脳のある脳幹を残りの組織から分離します。次に、脳のコードル部分をビブラトームの基部に接着し、0〜2°Cに冷却したスライス溶液またはaCSF溶液でスライスデバイスチャンバーを満たします。
バイブラトームチャンバーの周りにドライアイスを詰めて、手順中にスライス溶液を冷たく保ちます。かみそりの刃をビブラトームに挿入し、速度などのデバイスの切断パラメーターを3、周波数を9、フィードを250マイクロメートルに設定します。組織スライス手順の間、アクリルトランスファーピペットを使用してスライスを回収チャンバーに移し、スライス取得後の組織回収を60分間待ちます。
細胞のシーリングと記録を開始する前に、顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターの電源を入れます。aCSF溶液で顕微鏡に取り付けられた記録チャンバーを構築します。灌流ポンプを使用して、毎分2ミリリットルでaCSFを常に灌流します。
ソフトウェアの設定を確認し、実験の種類に応じて記録用の特定のプロトコルを作成します。目的の脳スライスを一度に1つずつアクリルトランスファーピペットを使用して記録チャンバーに移します。aCSF灌流中にスライスが動かないように、スライスアンカーでスライスを保持します。
スライスを記録チャンバーの中央に、液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)で配置します。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく見ることができ、記録マイクロピペットに完全に届くようにするために重要です。関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズに切り替え、63X組織レベルに焦点を合わせて、標的領域内の内因性蛍光タンパク質および細胞の形状を観察し、脳スライスの表面にキスペプチン細胞を配置した。
可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルを使用するか、関心のある領域に正方形のようなフォーマットを描画して、コンピューター画面でマークします。コンピュータのスクリーンマークは、記録ピペットの位置をセルに導くのに役立ちます。ターゲットセルの正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを電極ホルダーに導入し、内部溶液が銀電極に接触していることを確認します。
破片がマイクロピペットに入るのを防ぐために、ポリエチレンチューブを介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3ミリリットルの空気充填シリンジを使用して、マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に陽圧をかけます。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中心より下に導きます。マイクロマニピュレータのボタンを動かして、マイクロピペットのXYZ軸を目的の細胞に導きます。
焦点を調整してマイクロピペットの先端を確認し、焦点を近づけますが、スライスに近づきすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を下げ、マイクロピペットをゆっくりと焦点の合ったプレーンまで下げて、マイクロピペットの先端がスライスに突然浸透せず、細胞の表面またはターゲット領域に触れるまでゆっくりと下降するようにします。1〜3ミリリットルの空気充填シリンジで軽い陽圧を適用して、アプローチパスから破片を取り除きます。
マイクロマニピュレーターをXYZ軸上でゆっくりと動かし、マイクロピペットチップを近づけ、ターゲット細胞に触れると、加えられた圧力によってディンプルが発生します。ソフトウェアの電圧クランプモードを使用してディンプルを確立した後、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを通して1〜2秒間口から弱い短時間吸引を適用し、マイクロピペットとセルの間のシールを生成します。シールがノイズ干渉なしに約1分間機械的に安定している場合は、保持電圧を目的の細胞の最も近い生理学的静止電位に設定します。
キスペプチンの場合、視床下部ニューロンマイナス50ミリボルトが推奨されます。次に、破裂した膜がマイクロピペットを詰まらせたり、かなりの膜部分または細胞を引き付けたりしないように、細胞に密封されたマイクロピペット先端で原形質膜を破壊するために口から短時間吸引を適用します。十分な力で吸引を行うことにより、適切な全セル構成を実現できます。
使用しているシステム設定マニュアルを確認してください。細胞膜を破壊した後、電圧クランプモードでセル全体オプションを有効にし、セル全体タブを参照する自動コマンドをクリックします。セルの直列抵抗とセル全体の静電容量は自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。
次に、テキスト原稿に記載されているように、ソフトウェアで細胞生存率パラメータを確認します。実験中に直列抵抗とセル定常状態の容量を監視します。セル全体の構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します。
現在のクランプモードでの静止膜電位の変化と誘導静止膜電位変動を記録します。視床下部キスペプチンニューロンの活性に対するヒト組換え成長ホルモンの可能な効果を、全細胞パッチクランプ記録の助けを借りて研究した。ヒト組換え成長ホルモンHGHをグラム当たり20マイクログラムで投与すると、12個のAVPV / PeNキスペプチンニューロンのうち5個および記録された14個のARHキスペプチンニューロンのうち9個において休止膜電位の有意な過分極が誘導された。
AVPV/PeNキスペプチンおよびARHキスペプチン過分極ニューロンは、非応答細胞と比較して静止膜電位を有意に変化させた。HGH適用中の静止膜電位への影響は、AVPV / PeNキスペプチンニューロンで約0.9〜0.7ギガオーム、ARHキスペプチンニューロンで1.7〜1.0ギガオームの全細胞入力抵抗の有意な減少に続きました。.慎重なギガシールを介して実行される完璧な脳線と、ビーチパラメータを介したセルの領域の間に、最高の全細胞記録を達成するために必要です。
記録された細胞のマイクロピペット溶液を回収し、シングルセルRTPCRに使用し、単離された細胞の分子特性評価を可能にします。遺伝子組み換え動物の使用と組み合わせた全細胞パッチクランプ技術は、キスペプチンニューロンの定義を可能にする生殖の理解におけるブレークスルーを表し、特性を増加させ、それらは主要なモジュレーターです。
