このプロトコルは興味の遺伝子の人間の第一次T細胞をtransducing簡単であり、GNPの迎合的なプロセスを記述する。この特定の技術は、現在多くの学術センターで利用可能な高価なクローズドシステム製造プラットフォームを使用することなく、費用対効果が高く、GNPに準拠するように設計されています。この方法は、血液悪性腫瘍に取り組むためのパラダイムシフトとなっているCAR-T細胞を含むがこれに限定されない遺伝子改変細胞療法の生成に適用できる可能性があります。
ドナー血液の白血球アフェレーシス後に採取した細胞からPBMCを単離するには、試薬とサンプルの比率を1:2に維持しながら、ブレーキをオフにした状態で室温で30分間、混合物を800 Gで遠心分離することにより、サンプルの多糖類ベースの密度勾配遠心分離を行います。次に、マイクロピペットを使用して、PBMCを清潔な50ミリリットルのチューブに集めます。遠心分離により細胞をPBSで2回洗浄します。
洗浄した細胞を完全な造血培地に再懸濁する前に。得られた細胞のうち約2,000万個を活性化するには、細胞200万個ごとに10マイクロリットルのT細胞刺激試薬を添加します。次に、組換えヒトインターロイキン-2を1ミリリットルあたり20単位で添加した後、溶液を穏やかに混合し、6ウェルプレートに移します。
ウイルス形質導入を行う前に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。3日目に、細胞培養液を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、完全に混合します。チューブを室温で300Gで10分間遠心分離し、活性化試薬を除去します。
上清を完全に廃棄し、細胞を数える前にペレットを1ミリリットルの完全な培地に再懸濁します。24ウェルプレートでウェルあたり50万個の細胞をプレーティングできる濃度になるように、完全培地を使用して細胞懸濁液量を調整します。組換えヒトインターロイキン-7および組換えヒトインターロイキン-15を適切な濃度で細胞に添加します。
別のチューブで、使用する最終的なウイルス量を考慮して、所望の量のベクトフシン-1をOpti-MEM培地に添加します。この混合物を濃縮ウイルスと1対1の比率で混合し、完全に混合します。次に、得られたウイルスを含む混合物を細胞に加えます。
必要に応じて、完全培地を使用して各ウェルの総容量を400マイクロリットルに調整します。プレートに蓋をした後、パラフィンフィルムで密封し、1000g、32°Cで2時間遠心分離します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。
翌日、各ウェルから細胞を集めて50ミリリットルのチューブに引き込みます。次に、細胞を400G、室温で5分間遠心分離します。上清を慎重に除去した後、細胞をカウントする前に、ペレットを1ミリリットルの完全な培地に完全に再懸濁します。
次に、100万個/ミリリットルになるように培地で細胞濃度を調整し、ヒト組換えインターロイキン-7およびヒト組換えインターロイキン-15をそれぞれ155単位および290単位/ミリリットルで添加してから細胞を培養します。目的の細胞数に達したら、細胞を回収して50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。上清を除去した後、ペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁して細胞をカウントします。
再度遠心分離した後、上清を完全に廃棄し、50%HSAおよび40%HBSSからなる凍結保存液に、クライオバイアルあたり1,000万細胞/ミリリットルの濃度でペレットを再懸濁します。0.9ミリリットルの細胞懸濁液を必要な数のクライオバイアルに移し、各クライオバイアルに10%ジメチルスルホキシドを添加します。クライオバイアルを氷上に置き、凍結保存のために制御された速度の冷凍庫にすばやく移します。
次に、凍結保存されたサンプルを監視対象の液体窒素タンクに移し、長期保存します。形質導入効率を評価するには、500マイクロリットルのFACSバッファーを蛍光活性化セルソーティングまたはFACSチューブ内のサンプルに添加します。試料を400G、室温で5分間遠心分離した後、ピペットで上清を完全に廃棄します。
ペレットをFACS緩衝液中のCD3の1〜5希釈溶液に再懸濁します。サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で30分間インキュベートしてから、前述のように遠心分離します。次に、上清を完全に廃棄した後、FACS緩衝液中の7-AADの1〜20希釈溶液にペレットを再懸濁する。
この混合物をボルテックスしてから、暗所の氷上で10分間インキュベートします。最後に、200マイクロリットルのFACSバッファーを添加し、フローサイトメーターを使用してサンプルの分析に進みます。形質導入細胞の生存率解析により、14日目に、7-AAD陽性細胞を除外した後、細胞の95%以上がCD3陽性で生存していることが明らかになり、T細胞の活性化と増殖が成功したことが示されました。
CD3陽性集団内の形質導入効率は、形質導入されていない細胞と比較して58.7%と測定され、形質導入細胞は0.51%の形質導入効率を示しました形質導入細胞を4日目から14日目まで増殖させ、2日ごとに継代培養すると、細胞は25倍に増殖しました。この製品は、さまざまな品質管理テストを受け、設定されたすべての基準を満たしており、さらなる使用に適していることを示しています。手順全体は、厳密に無菌技術で実行する必要があります。
そして、最も厄介なステップは形質導入プロセスで、特定の総量を維持するために添加するすべての試薬を考慮する必要があります。
