ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養

ヒト脂肪由来幹細胞の単離およびin vitro増殖のための当社の外因性フリー法は、トランスレーショナルアプリケーションを検討した場合の細胞療法に関するバイオセーフティの懸念に対する答えです。当社の分離および拡張方法は、複製が簡単で、迅速で、技術的要件が低いため、すべての人に役立ちます。末梢神経修復のためのヒト脂肪幹細胞ベースの治療戦略を研究しています。

しかし、私たちの技術は、さまざまな臨床研究環境で新しい脂肪幹細胞が必要な場合に広く適用できます。より簡単な生産性を維持するために、シンプルに保ちました。無菌性は、手術室から細胞培養まで注意深く観察する必要があります。

サンプル操作やフラグメントの場合、マイクロ解剖は汚染のリスクがあります。腹部形成外科から脂肪組織サンプルを入手した後、滅菌ハサミを使用して、約1平方センチメートルの断片に切断します。メスで、各断片を細かく解剖し、10センチメートルのペトリ皿に5つの断片を分散させます。

フラグメントを取り付けるには、メスを使用してプラスチック表面に切り込みを作成し、各フラグメントをドラッグします。穏やかに、10ミリリットルの完全培養培地を加えて、それらを剥離せずにすべての断片を覆い、摂氏37度と5%二酸化炭素でペトリ皿をインキュベートします。ヒト脂肪由来幹細胞(HASC)の増殖を、細胞がコンフルエントになるまで光学顕微鏡で毎日監視します。

72時間ごとに培地を新しい完全培地と交換して細胞の破片を取り除き、最初の通過まで増殖させます。HASC培養が70〜80%のコンフルエントに達したら、滅菌ピンセットを使用してすべての組織片を取り除き、廃棄します。また、HASCがペトリ皿から外れないように、使い果たされた媒体を廃棄してください。

10ミリリットルのPBSで細胞を慎重に洗浄します。PBSを除去した後、1ミリリットルの動物を含まないトリプシンを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。光学顕微鏡で細胞の剥離を確認し、必要に応じてさらに2分間インキュベートします。

細胞の剥離を支えるには、プラスチックの表面を軽くたたきます。2ミリリットルの完全培地を加えてトリプシン作用を停止し、15ミリリットルのチューブにすべての細胞を集めます。遠心分離によって残りのトリプシンを除去する。

上清を廃棄した後、細胞を5ミリリットルの完全培地に懸濁し、細胞懸濁液を新しいT25フラスコに移します。凍結保存のために、光学顕微鏡下でセルカウンターを使用して剥離剥離細胞のアリコートを数えます。細胞を300 Gで5分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、細胞を1ミリリットル当たり10〜6細胞分の1倍の密度で凍結混合物中に懸濁し、1ミリリットルの細胞懸濁液を1つのクライオバイアルに移す。クライオバイアルを摂氏マイナス80度で、毎分1°C温度を下げる凍結容器に入れ、クライオバイアルを液体窒素に移動して長期保存します。最初のクラスターの出現では、HASCは古典的な紡錘体のような形状を示し、FBSの存在下でコントロールセルと比較して小さく、より細長いものでした。

細胞免疫表現型は、2つのサプリメントで培養されたHASC間で類似しているように見えました。HASCの80〜90%以上がCD73およびCD105で陽性であり、CD34およびCD45で発現しているのは5%未満でした。最後に、増殖アッセイは、FBSコントロールと比較して、ヒト血小板溶解液を培地に添加した場合の細胞増殖の有意な増加を明らかにしました。

最も重要なステップは、脂肪片の微小解剖とペトリ皿のメス切開によるそれらの付着です。GMPバイオセーフティ基準に関して、すぐに使用できるヒト脂肪由来幹細胞集団が得られ、治療用細胞特性を維持し、細胞増殖を促進します。