ウイルス感染は非常に動的であり、ウイルス学における従来のエンドポイントアッセイには、選択されたエンドポイントが情報の欠落につながる可能性があるという制限があります。この技術の主な利点は、細胞ベースの電気インピーダンスにより、ウイルス感染および抗ウイルス化合物の活性をリアルタイムで追跡することが可能であることである。この手順を実演するのは、私たちの研究室の検査技師であるEefMeyenです。
まず、電極ベースの96ウェルプレートを挟んでCEIプレートを準備します。各ウェルに100マイクロリットルの増殖培養培地を加え、ウェル間のスペースをDPBSで満たします。次に、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で4時間インキュベートします。
A549細胞を播種するには、原稿に記載されているように培養フラスコから細胞を剥離し、新鮮な増殖培地に再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。生細胞をカウントし、新鮮な増殖培地で希釈して、目的の細胞密度を取得します。
インキュベーション後、マルチチャンネルピペットで増殖培養液を96ウェルプレートから取り出します。ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。細胞が平衡化されたら、プレートをCEIデバイスに入れて、CEIアッセイをセットアップして実施します。
デバイスのソフトウェアを開き、[データの収集] ウィンドウで [セットアップ] をクリックして新しい実験を設定します。ラップトップを ECIS デバイスに接続します。緑色のウェルのインピーダンスを確認してプレートを構成します。
ウェル構成ペインで、使用する培養器具に応じてアレイタイプを選択し、複数周波数時間モードをクリックします。次に、開始を押して測定を開始します。コンパウンドを氷上に置いてください。
5ミリリットルのポリプロピレンチューブで平衡化したアッセイ培地で10倍濃縮希釈を行い、化合物を加えます。[データ収集のセットアップ] ウィンドウで [一時停止] をクリックし、現在の時点が完了したら、96 ウェル プレートを取り出します。光学顕微鏡下で細胞の接着および単層形成を観察する。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから20マイクロリットルの培地を吸引し、20マイクロリットルの化合物溶液またはビヒクルを目的のウェルに加えます。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で15分間インキュベートします。ウイルス溶液を調製するには、ウイルスストックのバイアルを解凍します。
15ミリリットルのポリプロピレンチューブのアッセイ培地で目的のMOIで希釈した後、ウイルスストックを追加します。割り当てられたウェルにウイルス希釈液を加えたら、100マイクロリットルのアッセイ培地を細胞コントロールウェルに加えます。次に、使用したウイルスコンテナを除染します。
プレートをCEIデバイスに戻し、[再開]をクリックして6日間連続して測定を続行します。データを分析するには、[完了] をクリックして実験を終了し、[実験の概要を入力] を追加します。データ収集が完了したら、 [OK] を選択します。グラフペインで目的の周波数を選択します。
[ウェル構成]ペインですべてのウェルが選択されていることを確認し、[ファイル]、[データのエクスポート]、[グラフデータ]の順にクリックして、データをスプレッドシート形式でエクスポートします。CEIアッセイは、感染動態が細胞型に大きく依存し、U87細胞が高MOIでのみジカウイルス感染の影響を受けやすいことを示しました。CEIアッセイはまた、高い細胞播種で完全に成長した細胞単層を示し、CEI電極全体にさらに広がることができず、細胞制御とウイルス制御の間にわずかな違いをもたらします。
より大きな細胞タイプであるU87の場合、細胞を高密度に播種しすぎると、細胞単層が完全に剥離した可能性があります。アジア系統PRVABC59におけるアフリカMR766の代表的なジカウイルス株は、同様のCEIパターンを示した。しかしながら、PRVABC59は、細胞変性効果誘導特性がわずかに遅く、CIT50値にも反映されている。
両方のジカウイルス株の3つの異なるMOIのインピーダンスプロファイルは、特定の化合物濃度がジカウイルス感染によって引き起こされるインピーダンス低下を遅らせることを示しました。CEIアッセイは、抗ウイルス活性がIC50値を決定するMOIおよびAUCN計算に依存することを明らかにした。評価されたCIT50値は、細胞増殖および感染の動態における化合物効力を実証した。
CEIは、ジカウイルスの複製に対する化合物をリアルタイムでラベルフリーで非侵襲的に評価および特性評価するための強力な技術です。
