Вирусные инфекции очень динамичны, и традиционные анализы конечных точек в вирусологии имеют ограничение, заключающееся в том, что выбранная конечная точка может привести к пропущенной информации. Основное преимущество этого метода заключается в том, что с помощью электрического импеданса на основе клеток можно следить за вирусной инфекцией и активностью противовирусных соединений в режиме реального времени. Эту процедуру продемонстрирует Эф Мейен, лаборант нашей лаборатории.
Для начала подготовьте пластину CEI, взяв пластину с 96 лунками на основе межпальцевого электрода. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров питательной среды для роста и заполните промежутки между лунками DPBS. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение четырех часов.
Чтобы засеять клетки A549, отделите их от колбы культуры, как описано в рукописи, и ресуспендируйте в свежей питательной среде. Перенесите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку. Подсчитайте жизнеспособные клетки и разбавьте их в свежей питательной среде, чтобы получить желаемую плотность клеток.
После инкубации удалите питательную среду с помощью многоканальной пипетки из 96-луночного планшета. Распределите 100 микролитров клеточной суспензии на лунку. Как только ячейки будут уравновешены, поместите пластину в устройство CEI, чтобы настроить и провести анализ CEI.
Откройте программное обеспечение устройства и на панели Сбор данных нажмите кнопку Настройка, чтобы задать новый эксперимент. Подключите ноутбук к устройству ECIS. Настройте пластину, проверив импедансы колодцев, как показано зеленым цветом.
На панели «Конфигурация скважины» выберите тип массива в соответствии с используемым культурологическим обеспечением и нажмите «Многочастотный режим времени». Затем начните измерение, нажав кнопку «Пуск». Держите состав на льду.
Сделайте 10-кратное концентрированное разбавление уравновешенной анализирующей средой в пятимиллилитровой полипропиленовой пробирке, а затем добавьте соединение. На панели «Настройка сбора данных» нажмите «Пауза» и, завершив текущий момент времени, выньте 96-луночную пластину. Наблюдайте за адгезией и образованием монослоя клеток под световым микроскопом.
Затем аспирируйте 20 микролитров среды из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и добавьте 20 микролитров составного раствора или носителя в нужные лунки. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 15 минут. Чтобы приготовить раствор вируса, разморозьте флакон с вирусным запасом.
После разведения при желаемом MOI с анализирующей средой в полипропиленовой пробирке объемом 15 миллилитров добавьте вирусный запас. После того, как разведение вируса добавлено в назначенные лунки, добавьте 100 микролитров анализной среды в контрольные лунки клеток. Затем обеззаразьте использованные контейнеры с вирусами.
Поместите пластину обратно в устройство CEI и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить измерения в течение шести дней подряд. Для анализа данных нажмите кнопку Готово, чтобы завершить эксперимент и добавить Введите сводку эксперимента. После завершения сбора данных нажмите кнопку ОК. Выберите нужную частоту на панели «График».
Убедитесь, что все скважины выбраны на панели «Конфигурация скважины», и нажмите «Файл», затем «Экспорт данных», а затем «Данные графика», чтобы экспортировать данные в формате электронной таблицы. Анализ CEI показал, что кинетика инфекции сильно зависела от типа клеток, и клетки U87 были восприимчивы к вирусной инфекции Зика только при высоких MOI. Анализы CEI также продемонстрировали полностью выращенный клеточный монослой при высоком засеве клеток и не может далее распространяться по электродам CEI, что приводит к небольшой разнице между клеточным контролем и вирусным контролем.
Для U87, более крупного типа клеток, слишком плотный посев клеток мог привести к полному отрыву клеточного монослоя. Репрезентативный штамм вируса Зика африканского MR766 в азиатской линии PRVABC59 демонстрировал сходные паттерны CEI. Однако PRVABC59 обладает несколько более медленными свойствами, индуцирующими цитопатический эффект, что также отражается значениями CIT50.
Профили импеданса трех различных MOI обоих штаммов вируса Зика показали, что конкретная концентрация соединения задерживает падение импеданса, вызванное инфекцией, вызванной вирусом Зика. Анализ CEI показал, что противовирусная активность зависела от расчетов MOI и AUCN, определенных значениями IC50. Оцененные значения CIT50 продемонстрировали комплексные потенции в кинетике роста клеток и инфекции.
CEI — это мощная технология для оценки и характеристики соединений, противодействующих репликации вируса Зика, в режиме реального времени, без маркировки и неинвазивным способом.
