Les infections virales sont très dynamiques, et les tests traditionnels en virologie ont une limite selon laquelle un critère d’évaluation choisi peut entraîner des informations manquantes. Le principal avantage de cette technique est qu’avec l’impédance électrique cellulaire, il est possible de suivre une infection virale et l’activité des composés antiviraux en temps réel. Eef Meyen, un technicien de laboratoire de notre laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.
Pour commencer, préparez la plaque CEI en prenant une plaque à 96 puits à électrode interdigitée. Ajouter 100 microlitres de milieu de culture de croissance à chaque puits et remplir les espaces entre les puits avec DPBS. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures.
Pour ensemencer les cellules A549, détachez-les du ballon de culture comme décrit dans le manuscrit et remettez-les en suspension dans un milieu de croissance frais. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Compter les cellules viables et les diluer dans un milieu de croissance frais pour obtenir la densité cellulaire désirée.
Après l’incubation, retirer le milieu de culture de croissance à l’aide d’une pipette multicanal de la plaque de 96 puits. Distribuer 100 microlitres de suspension cellulaire par puits. Une fois les cellules équilibrées, placez la plaque dans le dispositif CEI pour mettre en place et effectuer le test CEI.
Ouvrez le logiciel de l’appareil, puis dans le volet Collecter les données, cliquez sur Configuration pour définir une nouvelle expérience. Connectez un ordinateur portable à l’appareil ECIS. Configurez la plaque en vérifiant les impédances des puits indiquées par une couleur verte.
Dans le volet Configuration du puits, sélectionnez le type de tableau en fonction du matériel de culture utilisé et cliquez sur Mode de temps à fréquences multiples. Ensuite, démarrez la mesure en appuyant sur Démarrer. Gardez le composé sur la glace.
Faire la dilution 10 fois concentrée avec un milieu de dosage équilibré dans un tube en polypropylène de cinq millilitres, puis ajouter le composé. Dans le volet Configuration de la collecte de données, cliquez sur Pause et, une fois le point de temps actuel, retirez la plaque de 96 puits. Observer l’adhérence et la formation monocouche des cellules au microscope optique.
Ensuite, aspirez 20 microlitres de milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et ajoutez 20 microlitres de solution composée ou de véhicule dans les puits souhaités. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Pour préparer la solution virale, décongelez un flacon de bouillon de virus.
Après avoir effectué des dilutions au MOI désiré avec le milieu de dosage dans un tube en polypropylène de 15 millilitres, ajouter le stock de virus. Une fois la dilution du virus ajoutée dans les puits assignés, ajouter 100 microlitres de milieu de dosage aux puits témoins des cellules. Ensuite, décontaminez les conteneurs de virus utilisés.
Replacez la plaque dans l’appareil CEI et cliquez sur Reprendre pour continuer les mesures pendant six jours consécutifs. Pour analyser les données, cliquez sur Terminer pour terminer l’expérience et ajouter Entrer le résumé de l’expérience. Une fois la collecte de données terminée, sélectionnez OK. Sélectionnez la fréquence souhaitée dans le volet Graphique.
Assurez-vous que tous les puits sont sélectionnés dans le volet Configuration du puits et cliquez sur Fichier, puis sur Exporter les données, puis sur Données graphiques pour exporter les données sous forme de feuille de calcul. Le test CEI a montré que la cinétique d’infection dépendait fortement du type de cellule et que les cellules U87 n’étaient sensibles à l’infection par le virus Zika qu’à des MOI élevés. Les tests CEI ont également démontré une monocouche cellulaire pleinement développée à un ensemencement cellulaire élevé et ne peuvent pas se propager davantage à travers les électrodes CEI, ce qui entraîne une légère différence entre le contrôle cellulaire et le contrôle du virus.
Pour U87, un type de cellule plus grand, un ensemencement trop dense des cellules aurait pu entraîner le détachement complet de la monocouche cellulaire. Une souche représentative du virus Zika de l’African MR766 de la lignée asiatique PRVABC59 présentait des profils CEI similaires. Cependant, PRVABC59 a des propriétés induisant des effets cytopathiques légèrement plus lentes, également reflétées par les valeurs CIT50.
Les profils d’impédance de trois MOI différents des deux souches du virus Zika ont démontré que la concentration particulière du composé retardait la chute d’impédance causée par l’infection par le virus Zika. Le test CEI a révélé que l’activité antivirale dépendait des MOI et que les calculs de l’AUCN déterminaient les valeurs de CI50. Les valeurs CIT50 évaluées ont démontré des puissances composées dans la cinétique de la croissance cellulaire et de l’infection.
CEI est une technologie puissante pour évaluer et caractériser les composés contre la réplication du virus Zika en temps réel, sans marquage et de manière non invasive.
