Viral enfeksiyonlar oldukça dinamiktir ve virolojideki geleneksel son nokta testleri, seçilen bir son noktanın kaçırılmış bilgilere yol açabileceği konusunda bir sınırlamaya sahiptir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre bazlı elektriksel empedans ile, viral bir enfeksiyonu ve antiviral bileşiklerin aktivitesini gerçek zamanlı olarak takip etmenin mümkün olmasıdır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir laboratuvar teknisyeni olan Eef Meyen olacaktır.
Başlamak için, CEI plakasını interdijitasyonlu elektrot tabanlı 96 kuyu plakası alarak hazırlayın. Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre büyüme kültürü ortamı ekleyin ve kuyular arasındaki boşlukları DPBS ile doldurun. Ardından, plakayı dört saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
A549 hücrelerini tohumlamak için, onları el yazmasında açıklandığı gibi kültür şişesinden ayırın ve taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Canlı hücreleri sayın ve istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için taze büyüme ortamında seyreltin.
İnkübasyondan sonra, büyüme kültürü ortamını 96 kuyucuk plakasından çok kanallı bir pipetle çıkarın. Kuyu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. Hücreler dengelendikten sonra, CEI testini kurmak ve yürütmek için plakayı CEI cihazına yerleştirin.
Cihazın yazılımını açın ve yeni bir deneme ayarlamak için Veri Topla bölmesinde Kurulum'u tıklayın. ECIS cihazına bir dizüstü bilgisayar bağlayın. Kuyucukların empedanslarını yeşil renkle gösterildiği gibi kontrol ederek plakayı yapılandırın.
Kuyu Yapılandırması bölmesinde, kullanılan kültür yazılımına göre dizi türünü seçin ve Çoklu Frekans zaman moduna tıklayın. Ardından, Başlat'a basarak ölçümü başlatın. Bileşiği buz üzerinde tutun.
Beş mililitrelik bir polipropilen tüpte dengelenmiş bir tahlil ortamı ile 10 kat konsantre seyreltme yapın ve ardından bileşiği ekleyin. Veri Toplama Kurulumu bölmesinde, Duraklat'ı tıklatın ve geçerli saat noktasını tamamladıktan sonra 96 kuyu plakasını çıkarın. Işık mikroskobu altında hücrelerin yapışmasını ve tek katmanlı oluşumunu gözlemleyin.
Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyudan 20 mikrolitre ortam aspire edin ve istenen kuyucuklara 20 mikrolitre bileşik çözelti veya araç ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 15 dakika boyunca inkübe edin. Virüs çözeltisini hazırlamak için, bir şişe virüs stoğunu çözün.
15 mililitrelik bir polipropilen tüpte tahlil ortamı ile istenen MOI'de seyreltme yaptıktan sonra, virüs stoğu ekleyin. Atanan kuyucuklara virüs seyreltmesi eklendikten sonra, hücre kontrol kuyucuklarına 100 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Ardından, kullanılan virüs kaplarını dekontamine edin.
Plakayı tekrar CEI cihazına yerleştirin ve ölçümlere art arda altı gün boyunca devam etmek için Sürdür'e tıklayın. Verileri analiz etmek üzere Son'u tıklayarak denemeyi sonlandırın ve Deneme Özetini Gir'i ekleyin. Veri toplama tamamlandıktan sonra Tamam'ı seçin. Grafik bölmesinde istediğiniz frekansı seçin.
Kuyu Yapılandırması bölmesinde tüm kuyucukların seçildiğinden emin olun ve verileri elektronik tablo biçiminde dışa aktarmak için Dosya'ya, ardından Verileri Dışa Aktar'a ve ardından Grafik Verileri'ne tıklayın. CEI testi, enfeksiyon kinetiğinin hücre tipine büyük ölçüde bağımlı olduğunu ve U87 hücrelerinin sadece yüksek MOI'lerde Zika virüsü enfeksiyonuna duyarlı olduğunu göstermiştir. CEI testleri ayrıca yüksek hücre tohumlamasında tamamen büyümüş bir hücre tek katmanlı olduğunu gösterdi ve CEI elektrotlarına daha fazla yayılamadı, bu da hücre kontrolü ile virüs kontrolü arasında hafif bir farka yol açtı.
Daha büyük bir hücre tipi olan U87 için, hücrelerin çok yoğun bir şekilde tohumlanması, hücre tek katmanının tamamen ayrılmasına yol açmış olabilir. Asya soyu PRVABC59'daki Afrika MR766'nın temsili bir Zika virüsü suşu benzer CEI kalıpları sergiledi. Bununla birlikte, PRVABC59, CIT50 değerleri tarafından da yansıtılan biraz daha yavaş sitopatik etki indükleyici özelliklere sahiptir.
Her iki Zika virüsü suşunun üç farklı MOI'sinin empedans profilleri, belirli bileşik konsantrasyonunun Zika virüsü enfeksiyonunun neden olduğu empedans düşüşünü geciktirdiğini göstermiştir. CEI testi, antiviral aktivitenin MOI ve AUCN hesaplamalarının IC50 değerlerini belirlemesine bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Değerlendirilen CIT50 değerleri, hücre büyümesi ve enfeksiyonun kinetiğinde bileşik potansiyelleri göstermiştir.
CEI, Zika virüsü replikasyonuna karşı bileşikleri gerçek zamanlı, etiketsiz ve invaziv olmayan bir şekilde değerlendirmek ve karakterize etmek için güçlü bir teknolojidir.
