바이러스 감염은 매우 역동적이며 바이러스학의 전통적인 종점 분석은 선택한 종말점이 정보를 놓칠 수 있다는 한계가 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 세포 기반 전기 임피던스를 사용하여 바이러스 감염 및 항 바이러스 화합물의 활성을 실시간으로 추적 할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 실험실 기술자 인 Eef Meyen이 될 것입니다.
시작하려면 interdigitated 전극 기반 96웰 플레이트를 사용하여 CEI 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 성장 배양 배지를 추가하고 웰 사이의 공간을 DPBS로 채웁니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 배양합니다.
A549 세포를 시드하려면 원고에 설명된 대로 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 생존 가능한 세포를 세고 신선한 성장 배지에 희석하여 원하는 세포 밀도를 얻습니다.
배양 후, 96 웰 플레이트로부터 다채널 피펫으로 성장 배양 배지를 제거한다. 웰 당 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 분주하십시오. 세포가 평형을 이루면 플레이트를 CEI 장치에 넣어 CEI 분석을 설정하고 수행합니다.
기기의 소프트웨어를 열고 데이터 수집 패널에서 설정을 클릭하여 새 실험을 설정합니다. 랩톱을 ECIS 장치에 연결합니다. 녹색으로 표시된 웰의 임피던스를 확인하여 플레이트를 구성합니다.
Well Configuration 창에서 사용된 cultureware에 따라 배열 유형을 선택하고 Multiple Frequency time mode를 클릭합니다. 그런 다음 시작을 눌러 측정을 시작합니다. 화합물을 얼음 위에 보관하십시오.
5밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 평형 분석 배지로 10배 농축 희석한 다음 화합물을 추가합니다. 데이터 콜렉션 설정 분할창에서 일시정지를 클릭하고 현재 시점을 완료한 후 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 광학 현미경으로 세포의 부착 및 단층 형성을 관찰합니다.
다음에, 다채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 20 마이크로리터의 배지를 흡인하고, 원하는 웰에 20 마이크로리터의 화합물 용액 또는 비히클을 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 15분 동안 배양합니다. 바이러스 용액을 준비하려면 바이러스 스톡이 담긴 바이알을 해동합니다.
15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 분석 배지로 원하는 MOI로 희석한 후 바이러스 스톡을 추가합니다. 할당된 웰에 바이러스 희석액이 추가되면 100마이크로리터의 분석 배지를 세포 대조군 웰에 추가합니다. 그런 다음 사용된 바이러스 용기의 오염을 제거합니다.
플레이트를 CEI 장치에 다시 놓고 재개를 클릭하여 연속 6일 동안 측정을 계속합니다. 데이터를 분석하려면 마침을 클릭하여 실험을 종료하고 실험 요약 입력을 추가합니다. 데이터 수집이 완료되면 확인을 선택합니다. 그래프 창에서 원하는 주파수를 선택합니다.
Well Configuration(웰 구성) 창에서 모든 웰이 선택되어 있는지 확인하고 File(파일), Export Data(데이터 내보내기), Graph Data(그래프 데이터)를 차례로 클릭하여 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보냅니다. CEI 분석은 감염 동역학이 세포 유형에 크게 의존하고 U87 세포가 높은 MOI에서만 지카 바이러스 감염에 취약하다는 것을 보여주었습니다. CEI 분석은 또한 높은 세포 파종에서 완전히 성장한 세포 단층을 입증했으며 CEI 전극 전체에 더 이상 퍼질 수 없어 세포 제어와 바이러스 제어 사이에 약간의 차이가 있습니다.
더 큰 세포 유형인 U87의 경우 세포를 너무 조밀하게 파종하면 세포 단층이 완전히 분리될 수 있습니다. 아시아 계통 PRVABC59에서 아프리카 MR766의 대표적인 지카 바이러스 균주는 유사한 CEI 패턴을 나타내었다. 그러나 PRVABC59는 약간 느린 세포 변성 효과 유도 특성을 가지며 CIT50 값에도 반영됩니다.
두 지카 바이러스 균주의 세 가지 다른 MOI의 임피던스 프로파일은 특정 화합물 농도가 지카 바이러스 감염으로 인한 임피던스 강하를 지연시킨다는 것을 입증했습니다. CEI 분석은 항바이러스 활성이 MOI 및 AUCN 계산에 따라 결정된 IC50 값에 의존적이라는 것을 밝혀냈습니다. 평가된 CIT50 값은 세포 성장 및 감염의 동역학에서 복합 효능을 입증했습니다.
CEI는 지카 바이러스 복제에 대한 화합물을 실시간, 무표지 및 비침습적 방식으로 평가하고 특성화하는 강력한 기술입니다.
