As infecções virais são altamente dinâmicas, e os ensaios tradicionais de desfecho em virologia têm uma limitação de que um desfecho escolhido pode levar à perda de informações. A principal vantagem dessa técnica é que, com a impedância elétrica baseada em células, é possível acompanhar uma infecção viral e a atividade de compostos antivirais em tempo real. Quem demonstrará esse procedimento será Eef Meyen, técnico de laboratório do nosso laboratório.
Para começar, prepare a placa CEI pegando uma placa de 96 poços à base de eletrodo interdigitado. Adicione 100 microlitros de meio de cultura de crescimento a cada poço e preencha os espaços entre os poços com DPBS. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.
Para semear as células A549, retire-as do frasco de cultura descrito no manuscrito e ressuspenda-as em meio de crescimento fresco. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros. Contar as células viáveis e diluí-las em meio de crescimento fresco para obter a densidade celular desejada.
Após a incubação, retirar o meio de cultura de crescimento com uma pipeta multicanal da placa de 96 poços. Dispense 100 microlitros de suspensão celular por poço. Uma vez que as células estejam equilibradas, coloque a placa no dispositivo CEI para configurar e conduzir o ensaio CEI.
Abra o software do dispositivo e, no painel Coletar Dados, clique em Configuração para definir um novo experimento. Conecte um laptop ao dispositivo ECIS. Configure a placa verificando as impedâncias dos poços conforme indicado por uma cor verde.
No painel Configuração de Poço, selecione o tipo de matriz de acordo com o cultureware usado e clique em Modo de tempo de Frequência Múltipla. Em seguida, inicie a medição pressionando Iniciar. Mantenha o composto no gelo.
Faça a diluição 10 vezes concentrada com um meio de ensaio equilibrado em um tubo de polipropileno de cinco mililitros e, em seguida, adicione o composto. No painel Configuração da Coleta de Dados, clique em Pausar e, depois de concluir o ponto de tempo atual, retire a placa de 96 poços. Observar a aderência e formação de monocamada das células ao microscópio de luz.
Em seguida, aspirar 20 microlitros de meio de cada poço usando uma pipeta multicanal, e adicionar 20 microlitros de solução composta ou veículo nos poços desejados. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Para preparar a solução de vírus, descongele um frasco de estoque de vírus.
Depois de fazer diluições no MOI desejado com meio de ensaio em um tubo de polipropileno de 15 mililitros, adicione o estoque de vírus. Uma vez que a diluição do vírus é adicionada nos poços designados, adicione 100 microlitros de meio de ensaio aos poços de controle celular. Em seguida, descontamine os recipientes de vírus empregados.
Coloque a placa de volta no dispositivo CEI e clique em Retomar para continuar as medições por seis dias consecutivos. Para analisar os dados, clique em Concluir para encerrar o experimento e adicionar Enter Experiment Summary. Quando a coleta de dados for concluída, selecione OK. Selecione a frequência desejada no painel Gráfico.
Verifique se todos os poços estão selecionados no painel Configuração de Poço e clique em Arquivo e, em seguida, em Exportar Dados, seguido por Dados do Gráfico para exportar os dados em um formato de planilha. O ensaio CEI mostrou que a cinética da infecção era altamente dependente do tipo celular, e as células U87 eram suscetíveis apenas à infecção pelo vírus Zika em MOIs elevados. Os ensaios CEI também demonstraram uma monocamada celular totalmente crescida na semeadura celular alta e não pode se espalhar mais através dos eletrodos CEI, levando a uma pequena diferença entre o controle celular e o controle do vírus.
Para U87, um tipo de célula maior, semear células muito densamente pode ter levado ao desprendimento completo da monocamada celular. Uma cepa representativa do vírus Zika do MR766 africano na linhagem asiática PRVABC59 exibiu padrões CEI semelhantes. No entanto, PRVABC59 tem propriedades indutoras de efeito citopático ligeiramente mais lentas, também refletidas pelos valores de CIT50.
Os perfis de impedância de três MOIs diferentes de ambas as cepas do vírus Zika demonstraram que a concentração particular do composto atrasou a queda de impedância causada pela infecção pelo vírus Zika. O ensaio CEI revelou que a atividade antiviral foi dependente dos cálculos MOI e AUCN determinados IC50. Os valores de CIT50 avaliados demonstraram potências compostas na cinética de crescimento celular e infecção.
O CEI é uma tecnologia poderosa para avaliar e caracterizar compostos contra a replicação do vírus Zika de forma em tempo real, sem rótulos e não invasiva.
