1988年、リチャードレンスキーは進化実験を始めました。彼は12個の三角フラスコにDM25として知られるグルコース制限定義増殖培地を満たしました。彼はこれらのフラスコのうち6つに、糖アラビノースを栄養素として利用できないREL606として知られる大腸菌株を接種しました。
これらの集団はA-1からA-6に指定されました。彼は他の6人に、アラビノースを利用できるREL607として知られるほぼ同一の株を接種しました。これらの祖先株、それらから進化した大腸菌は、テトラゾリウムまたはアラビノース寒天培地に播種すると区別できます。
Ara株は赤色のコロニーを形成し、Ara+系統は白色のコロニーを形成します。Lenskiは、これらのフラスコを摂氏37度の振とうインキュベーターに入れ、飽和状態まで成長させ、培地中のグルコースを排出させました。この時点で、彼は培養物の1%を各フラスコから新鮮な培地を含む12フラスコの新しいセットに移した。
これらの毎日の移動と再成長のサイクルは何十年も続いており、研究者が研究できる進化の長い歴史を生み出しています。私たちのプロトコルでは、長期進化実験(LTEE)集団が毎日どのように移動および培養されるかについて説明します。次に、汚染の兆候がないか集団を定期的にチェックし、アーカイブして、後の研究のために永続的な凍結記録を提供する方法について説明します。
私たちはしばしばこれをLTEEの化石記録と呼んでいます。LTEEで進化的変化の全体的なテンポと特徴を監視する重要な方法は、実験から集団と系統の相対的な適応度を測定することです。これらの共培養競合アッセイを実施し、結果のデータを分析して相対的な適応度値を計算する方法について説明します。
このビデオでは、これらの手順の最初と最後を示します。まず、長期進化実験の毎日の転送を示します。LTEE転送が行われる表面を、70%エタノールまたは10%漂白剤溶液で拭いて消毒します。
ブンゼンバーナーに火をつけて局所的な上昇気流を作り、ガラス製品の炎上を可能にします。オートクレーブで洗浄および滅菌された20ミリリットルのパイレックスまたはポリプロピレンビーカーで覆われた13個の50ミリリットルパイレックス三角フラスコを準備します。フラスコに目に見える破片がないか確認し、完全にきれいでないものを交換します。
6つのフラスコA-1からA-6に赤いマーカーを使用してラベルを付け、他の6つのフラスコに黒いマーカーを使用してA + 1からA + 6のラベルを付けます。最後に残ったフラスコ(空白)に、日付、月日形式、および曜日をラベル付けします。滅菌済みの10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、13本のフラスコのそれぞれに9.9ミリリットルのDM25培地を満たします。
蓋となるビーカーを取り外した後、ビーカーを交換する前に、各フラスコの口を炎上させる。各フラスコを満たす間にピペットの先端を炎上させる。前日のLTEEフラスコを振とうインキュベーターから取り出します。
濁度と色を評価するために、光にかざしてそれぞれを順番に調べます。フラスコの完全性を確認し、異物の存在を探します。滅菌フィルターチップ付きのP200マイクロピペッターを使用して、各LTEEフラスコから新鮮なDM25を含む対応するフラスコに100マイクロリットルの培養液を移します。
A-1から始めて、A + 1を転送します。その後、マイナス母集団とプラス母集団を交互に続けます。どの培養物が移されたかを追跡するには、フラスコを左にシフトしてピペッティングします。
移送中は厳格な無菌技術を守ってください。移し替えごとに新しいピペットチップを使用してください。キャッピング解除直後とリキャップ前にフラスコの口に火をつけ、各移し替えの間に70%エタノールで湿らせたキムワイプでマイクロピペッターのバレルとインジェクターを拭き取ります。
新しく接種したフラスコを摂氏37度で24時間インキュベートし、直径1インチで毎分120回転の軌道振とうを行います。前日からの培養物を摂氏4度で保管してください。これらの文化を2日間保持します。
3日前に摂氏4度で保存された古い文化をこの時点で破棄します。時刻、日付、転送番号、名前またはイニシャル、カルチャに問題があったかどうか、およびその他の関連情報を転送ログ ノートブックに入力します。大腸菌による長期進化実験の歴史の中で、さらに6 2/3世代が経過しました。
前日のLTEE文化に問題、事故、または汚染の疑いがある場合は、それらから転送しないでください。代わりに、12の培養物のセット全体を摂氏4度で保存して、後で調べてさらに特性評価します。前日から移管し、4°Cで保管したバックアップフラスコを取り出します。
それらをベンチトップに置いて室温に温めます。各フラスコを静かに旋回させて、細胞を再懸濁します。各フラスコから新しいフラスコセット内の新鮮な培地に移し、通常どおり実験を続けます。
バックアップ カルチャを使用したことを転送ログにメモし、前日と同じ転送番号を記録します。摂氏4度で保管されたバックアップフラスコに汚染が認められた場合は、影響を受けるLTEE集団を冷凍ストックから再開する必要があります。次に、長期進化実験から2つの株または集団の相対的な適応度を測定するために使用できる共培養競合アッセイを示します。
LTEEの祖先であるREL606と607の両方と、2つの進化した集団、20, 000世代の人口A-5、REL8597;および20, 000世代の人口A + 5、REL8604を進化させる競争実験を示します。これらのアッセイでは、Ara-およびAra+競合他社の各ペアに対して6倍の複製を使用しました。使用する競合のLTEE株および/または集団の数と、競合のペアごとに実行される反復競合アッセイの数を決定します。
次のように必要な備品を準備します。復活の日、マイナス2日目には、競合他社として使用される大腸菌の菌株または集団ごとに、9.9ミリリットルのDM1000またはリソジェニーブロスLBのいずれかを含む20ミリリットルのビーカーで覆われた滅菌50ミリリットルの三角フラスコを1つ満たします。もう1つのフラスコに9.9ミリリットルの同じ培地を充填して、未接種のブランクとして機能させます。
プレコンディショニングの日、マイナス1日については、1本の試験管に9.9ミリリットルの0.85%重量/容量滅菌生理食塩水を、2組の競技者間の反復アッセイごとに9.9ミリリットルのDM25を含む2つのフラスコ、およびブランク用の9.9ミリリットルのDM25を含むもう1つのフラスコを満たします。競技開始日の0日目に、1つのフラスコに9.9ミリリットルのDM25を充填し、1つの試験管に9.9ミリリットルの滅菌生理食塩水を満たし、競技アッセイ複製ごとに1つのテトラゾリウムまたはアラビノース、またはTAプレートを準備します。もう1つのフラスコに9.9ミリリットルのDM25を入れてブランクにします。
3日間の競技を行う場合は、さらに2セットの競技用フラスコを充填します。競技最終日には、2本の試験管に9.9ミリリットルの滅菌生理食塩水を入れ、競技1回につき1枚のTAプレートを用意します。競争実験のマイナス2日目に、冷凍庫の在庫とは別に競合他社を復活させます。
競合他社の株の冷凍ストックを含むクライオバイアルを摂氏80度の冷凍庫から取り出します。バイアルを使用している間、バイアルを素敵なバケツで冷やしてください。各凍結ストックが解凍した後、それを徹底的にボルテックスして大腸菌細胞を再懸濁します。
クローンを復活させる場合は、新鮮な培地を含むフラスコに12マイクロリットルの凍結ストックを接種する。集団を復活させる場合は、120マイクロリットルの冷凍ストックを接種します。ブランク内のリバイバルフラスコを摂氏37度で一晩インキュベートし、直径1インチで毎分120回転の軌道を振る。
競技実験のマイナス1日目に、DM25で競技者を個別に事前調整します。復活した競合他社の文化を含むフラスコをインキュベーターから取り出します。各フラスコから100マイクロリットルをその競合他社の生理食塩水の試験管に移します。
希釈培養物から100マイクロリットルを新鮮なDM25を入れたフラスコに移す直前に、各希釈チューブを完全にボルテックスします。これらのプレコンディショニングフラスコのうち2つを、各反復アッセイに2つ、各競合他社に1つずつ接種します。ブランク内のプレコンディショニングフラスコを摂氏37度で24時間インキュベートします。
競技実験の0日目に、競技者とプレートを混合して初期カウントを行うことから競技を開始します。プレコンディショニングフラスコをインキュベーターから取り出します。50マイクロリットルのAra競技者を、新鮮なDM25で満たされた最初の複製競技用フラスコに移します。
すぐに50マイクロリットルのAra+競合他社を同じ競技用フラスコに移します。フラスコを静かに回転させて混ぜます。これらの手順を繰り返して、テストしていた競合他社のすべてのペアのすべての反復を結合します。
新たに接種した各競技用フラスコから100マイクロリットルを、その競合アッセイ複製用に標識された生理食塩水の試験管に移す。新しい競技用フラスコとブランクを振とうインキュベーターに入れます。一方、同じ日に、各試験管を徹底的にボルテックスし、これらの10, 000倍希釈液のうち80マイクロリットルをTAプレートにプレートします。
各プレートの底面の側面に、混合された菌株のペア、反復数、および0日目のラベルを付けて、各競合他社の初期表現を決定するために使用されることを示します。TAプレートを重力対流インキュベーターで摂氏37度で逆さまにインキュベートし、Ara-とAr+の両方の競合のコロニーが見えて区別できるようになるまでインキュベートします。一般に、これは16〜24時間以内に発生しますが、一部の進化した株ではさらに時間がかかる場合があります。
各プレート上のアラレッドとアラ+ホワイトのコロニーの数を数え、結果を記録します。3日間の競技を行う場合は、各競技の100マイクロリットルを、成長後に新しいフラスコで9.9ミリリットルの新鮮なDM25培地に移します。これらの1日目のフラスコを24時間インキュベートします。
同じ方法で別のトランスファーを実行し、2日目のフラスコを24時間インキュベートして、LTEE条件下で競合他社の3つの完全な共培養成長サイクルを完了します。コンテストの最終日である1日目または3日目に、実験の長さに応じて、最終的なカウントを設定します。競技用フラスコをインキュベーターから取り出します。
各競技用フラスコから100マイクロリットルを、その複製のための生理食塩水の最初の試験管に移します。各100倍希釈チューブをボルテックスして十分に混合し、その複製のために100マイクロリットルを生理食塩水の2番目のチューブに移します。得られたチューブは、DM25培養物の10, 000倍希釈物を含む。
10, 000倍希釈液を含む各試験管を徹底的に渦し、そのうち80マイクロリットルをTAプレート上にプレートします。各プレートの底面の側面に、混合された菌株のペア、反復数、および1日競技の場合は1日目、3日間の競技の場合は3日目にラベルを付けて、各競技者の最終的な表現を決定するために使用されることを示します。TAプレートを摂氏37度でインキュベートし、成長後のAraコロニーとAra+コロニーを数えます。
このプロトコルで提供されるExcelスプレッドシートまたはFitness RRパッケージを使用して、競合他社のひずみの相対的な適合度を計算し、結果をプロットします。長期進化実験の毎日の転送中、成長後の培養物の密度は非常に低く、多くの場合、空白のすぐ隣に培養物をかざすことによって判断する必要があります。例外は、追加の栄養源として培地中のクエン酸塩を使用するように進化し、他の集団の細胞密度の約10倍に成長する集団A-3です。
LTEE培養における光学密度の測定は、予想される増殖を監視するためにも使用できます。競合アッセイの例では、適合度の高い競合他社は、適合度の低い競合他社と比較して、時間の経過とともにその表現を増やすことが期待されます。2つの祖先株間の競合のわずか1回の複製の希釈液から成長したコロニーを有するTAプレートを調べると、3日間の競合実験の過程で比率が比較的一定に保たれることがわかります。
対照的に、A + 5の人口はREL606の祖先を急速に上回っています。そして、A-5の人口は急速にREL607の祖先を上回っています。2つの進化した集団はほぼ均等に一致しています。
赤と白のコロニーの表現は、競技の3日間でほぼ同じままです。共培養の1日後のコロニー数を使用すると、進化した集団の適応度は、大腸菌の祖先株と比較してLTEE中に60%増加したことがわかります。競技を複数日にわたって転送し続けることで、密接に一致する競技者の相対的な適応度測定の精度を向上させることができます。
しかし、2人の競技者が非常に異なるフィットネスを持っている場合、相対的なフィットネスを計算するための数日間の競技の後、両方のコロニーの適切な表現がもはやありません。ここで示す方法は、LTEEのユニークな歴史的記録を研究し、このオープンエンドの進化実験を継続するために重要です。また、新しい質問に取り組み、新しい環境を使用し、さまざまな微生物を研究する新しい進化実験を検討している他の人に出発点を提供することもできます。
