В 1988 году Ричард Ленски начал эволюционный эксперимент. Он наполнил 12 колб Эрленмейера определенной питательной средой с ограниченным содержанием глюкозы, известной как DM25. Он инокулировал шесть из этих колб штаммом E.coli, известным как REL606, который не может использовать сахарную арабинозу в качестве питательного вещества.
Эти группы населения были обозначены как от A-1 до A-6. Он привил остальным шести почти идентичный штамм, известный как REL607, который способен использовать арабинозу. Эти предковые штаммы, E.coli, которые произошли от них, можно отличить при нанесении на агар из тетразолия или арабинозы.
Штаммы Ara образуют красные колонии, а штаммы Ara+ образуют белые колонии. Ленски поместил эти колбы в встряхивающий инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию, что позволило им вырасти до насыщения и исчерпать глюкозу в среде. На этом этапе он перенес 1% культуры из каждой колбы в новый набор из 12 колб, содержащих свежую среду.
Эти ежедневные циклы переноса и отрастания продолжались десятилетиями, создавая долгую историю эволюции, которая может быть изучена исследователями. В нашем протоколе мы описываем, как популяции долгосрочного эволюционного эксперимента, или LTEE, переносятся и культивируются каждый день. Затем мы описываем, как популяции регулярно проверяются на наличие возможных признаков загрязнения и архивируются, чтобы обеспечить постоянную замороженную запись для последующего изучения.
Мы часто называем это, цитирую, летописью окаменелостей LTEE. Важным способом мониторинга общего темпа и характера эволюционных изменений в LTEE является измерение относительной приспособленности популяций и штаммов из эксперимента. Мы описываем, как проводить эти анализы соревнований по совместной культуре и анализировать полученные данные для расчета относительных значений приспособленности.
В этом видео мы покажем первую и последнюю из этих процедур. Во-первых, мы продемонстрируем ежедневную передачу долгосрочного эволюционного эксперимента. Продезинфицируйте поверхность, на которой будет осуществляться передача LTEE, протерев ее либо 70%-ным этанолом, либо 10%-ным раствором отбеливателя.
Зажгите горелку Бунзена, чтобы создать локальный восходящий поток и включить воспламенение стеклянной посуды. Подготовьте 13 50-миллилитровых колб Pyrex Erlenmeyer, укупоренных 20-миллилитровыми стаканами Pyrex или полипропилена, которые были вымыты и стерилизованы автоклавированием. Проверьте колбы на наличие видимого мусора и замените те, которые не совсем чистые.
Пометьте шесть колб от A-1 до A-6 красным маркером, а остальные шесть колб от A+1 до A+6 — черным маркером. Пометьте последнюю оставшуюся колбу, которая будет пустой, датой в формате месяц-день и день недели. Наполните каждую из 13 колб 9,9 миллилитрами среды DM25 с помощью стерильной серологической пипетки объемом 10 миллилитров.
Поджигайте горлышко каждой колбы после снятия стакана, служащего крышкой, и перед заменой стакана. Зажгите наконечник пипетки между наполнением каждой колбы. Извлеките колбы LTEE предыдущего дня из встряхивающего инкубатора.
Осмотрите каждый по очереди, поднеся его к свету, чтобы оценить его мутность и цвет. Проверьте целостность колбы и найдите наличие посторонних предметов. Используя микропипеттор P200 со стерильным фильтрующим наконечником, перенесите 100 микролитров культуры из каждой колбы LTEE в соответствующую колбу, содержащую свежий DM25.
Начните с А-1, затем переведите А+1. После этого продолжайте чередование минусовых и плюсовых популяций. Чтобы отслеживать, какие культуры были перенесены, сдвигайте колбы влево, как пипетка от них или к ним.
Соблюдайте строгую асептическую технику во время переносов. Используйте свежий наконечник пипетки для каждого переноса. Зажгите горлышки колб сразу после снятия крышки и перед повторным укупоркой, а также протрите ствол и инжектор микропипетки салфеткой Kimwipe, смоченной 70% этанолом между каждой передачей.
Инкубируйте только что инокулированные колбы при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов со скоростью 120 оборотов в минуту, встряхивая орбиту диаметром в один дюйм. Храните культуры предыдущего дня при температуре четыре градуса по Цельсию. Сохраняют эти культуры в течение двух дней.
Откажитесь от старых культур, которые были сохранены при четырех градусах Цельсия три дня назад в это время. Введите время, дату, номер перевода, свое имя или инициалы, были ли в порядке региональные параметры, а также любую другую соответствующую информацию в записной книжке журнала переводов. Прошло еще 6 2/3 поколений в истории многолетнего эволюционного эксперимента с E.coli.
Если есть какие-либо проблемы, несчастные случаи или подозрения на загрязнение культурами LTEE предыдущего дня, не переносите от них. Вместо этого храните весь набор из 12 культур при температуре четыре градуса Цельсия для последующего изучения и дальнейшей характеристики. Извлеките резервные колбы, которые были перенесены накануне, и храните их при четырех градусах Цельсия.
Положите их на столешницу, чтобы они прогрелись до комнатной температуры. Аккуратно перемешайте каждую колбу, чтобы ресуспендировать клетки. Переложите из каждой колбы в свежую среду в новый набор колб и продолжайте эксперимент в обычном режиме.
Отметьте в журнале передачи, что вы использовали резервные языки и региональные параметры, и запишите тот же номер передачи, что и накануне. Если загрязнение отмечено в резервных колбах, хранящихся при температуре четыре градуса Цельсия, то пораженные популяции LTEE должны быть перезапущены из замороженных запасов. Далее мы продемонстрируем анализ конкуренции кокультур, который можно использовать для измерения относительной приспособленности двух штаммов или популяций из долгосрочного эволюционного эксперимента.
Мы покажем конкурентный эксперимент, который развивает как предков LTEE, REL606 и 607, так и две эволюционировавшие популяции: популяцию A-5 в 20 000 поколений, REL8597, и популяцию A+5 в 20 000 поколений, REL8604. В этих анализах использовалась шестикратная репликация для каждой пары конкурентов Ara и Ara +. Решите, сколько конкурирующих штаммов LTEE и/или популяций вы будете использовать и сколько повторных анализов конкуренции будет выполнено для каждой пары конкурентов.
Подготовьте необходимые расходные материалы следующим образом. В день пробуждения, день минус два, наполните одну стерильную 50-миллилитровую колбу Эрленмейера, укупоренную 20-миллилитровым стаканом, 9,9 миллилитрами 1000 немецких марок или лизогенного бульона, LB, на штамм или популяцию кишечной палочки, которая будет использоваться в качестве конкурента. Наполните еще одну колбу 9,9 миллилитрами той же среды, чтобы она служила неинокулированной заготовкой.
В день предварительного кондиционирования, день минус один, заполните одну пробирку 9,9 миллилитрами стерильного физиологического раствора 0,85% веса на объем на каждого конкурента, две колбы с 9,9 миллилитрами DM25 на повторный анализ между парой конкурентов и еще одну колбу с 9,9 миллилитрами DM25 для заготовки. В день начала соревнований, в нулевой день, наполните одну колбу 9,9 миллилитрами DM25, заполните одну пробирку 9,9 миллилитрами стерильного физиологического раствора и подготовьте одну тетразолию или арабинозу, или планшет ТА для повторения конкурсного анализа. Наполните еще одну колбу 9,9 миллилитрами DM25, чтобы она служила заготовкой.
Если вы проводите трехдневное соревнование, наполните два дополнительных комплекта соревновательных колб. В последний день соревнований заполните две пробирки 9,9 миллилитрами стерильного физиологического раствора и подготовьте по одной тарелке ТА на каждую соревновательную реплику. В день минус два соревновательного эксперимента вы оживляете конкурентов отдельно от морозильных запасов.
Извлеките криовиалы, содержащие замороженные запасы конкурирующих штаммов, из морозильной камеры при температуре 80 градусов по Цельсию. Держите флаконы охлажденными в красивом ведре во время их использования. После того, как каждый замороженный бульон оттает, тщательно перемешайте его, чтобы ресуспендировать клетки E.coli.
Если вы оживляете клона, привите колбу, содержащую свежую среду, 12 микролитрами замороженного бульона. Если вы возрождаете популяцию, привите 120 микролитров замороженного поголовья. Инкубируйте колбы пробуждения в заготовке при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи со скоростью 120 оборотов в минуту, встряхивая орбиту диаметром в один дюйм.
В день, минус один соревновательного эксперимента, вы заранее подготавливаете участников отдельно в DM25. Достаньте из инкубатора колбы с культурами оживших конкурентов. Переведите 100 микролитров из каждой колбы в пробирку с физиологическим раствором для этого конкурента.
Тщательно перемешайте каждую пробирку для разбавления непосредственно перед тем, как перелить 100 микролитров из разбавленной культуры в колбу со свежим DM25. Инокулируйте две из этих колб предварительного кондиционирования для каждого повторного анализа, по одной для каждого из конкурентов. Инкубируйте колбы предварительного кондиционирования в заготовке при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.
В нулевой день соревновательного эксперимента вы начинаете соревнование, смешивая конкурентов и тарелку для начальных подсчетов. Достаньте колбы для предварительного кондиционирования из инкубатора. Перелейте 50 микролитров Ara-конкурента в первую колбу для повторения конкурса, наполненную свежим DM25.
Немедленно перелейте 50 микролитров Ara+конкурента в ту же соревновательную колбу. Перемешайте колбу, осторожно помешивая. Повторите эти шаги, чтобы объединить все реплики всех пар конкурентов, которых вы тестировали.
Перенесите 100 микролитров из каждой вновь инокулированной соревновательной колбы в пробирку с физиологическим раствором, помеченным для репликации этого соревновательного анализа. Поместите новые соревновательные колбы и заготовку в встряхивающий инкубатор. Между тем, в тот же день тщательно перемешайте каждую пробирку и нанесите 80 микролитров этих 10 000-кратных разведений на планшеты ТА.
Пометьте нижнюю часть каждой пластины парой штаммов, которые были смешаны, номером репликации и нулевым днем, чтобы указать, что он будет использоваться для определения первоначального представления каждого конкурента. Инкубируйте тарелки ТА вверх ногами в гравитационном конвекционном инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию до тех пор, пока колонии конкурентов Ara-, и Ara + не станут видимыми и различимыми. Как правило, это происходит в течение 16-24 часов, но для некоторых развившихся штаммов это может занять больше времени.
Подсчитайте количество колоний Ara-red и Ara + white на каждой пластине и запишите результаты. Если вы проводите трехдневное соревнование, перенесите 100 микролитров каждой реплики соревнований в 9,9 миллилитров свежей среды DM25 в новую колбу после роста. Инкубируйте эти колбы первого дня в течение 24 часов.
Таким же образом выполните еще один перенос и инкубируйте колбы второго дня в течение 24 часов, чтобы завершить три полных цикла роста совместной культуры конкурентов в условиях LTEE. В последний день соревнований, в первый или третий день, в зависимости от продолжительности вашего эксперимента, вы подведете окончательные подсчеты. Достаньте из инкубатора соревновательные колбы.
Переведите 100 микролитров из каждой соревновательной колбы в первую пробирку с физиологическим раствором для повторения. Вкрутите каждую 100-кратную пробирку для разбавления, чтобы тщательно перемешать ее, и перенесите 100 микролитров во вторую пробирку физиологического раствора для повторения. Полученные пробирки содержат 10 000-кратные разведения культур DM25.
Тщательно перемешайте каждую пробирку, содержащую 10 000-кратное разведение, и поместите 80 микролитров на планшет ТА. Пометьте нижнюю часть каждой пластины парой штаммов, которые были смешаны, номером репликации и первым днем для однодневного соревнования или третьим днем для трехдневного соревнования, чтобы указать, что он будет использоваться для определения окончательного представления каждого участника. Инкубируйте тарелки TA при 37 градусах Цельсия и подсчитайте колонии Ara- и Ara + после роста.
Используйте электронную таблицу Excel, поставляемую с этим протоколом, или пакет Fitness RR, чтобы рассчитать относительную пригодность штаммов в вашем соревновании и построить график результатов. Во время ежедневных переносов долгосрочного эволюционного эксперимента плотность культур после роста очень низкая, и о ней часто приходится судить, держа культуру рядом с заготовкой. Исключением является популяция A-3, которая эволюционировала, чтобы использовать цитрат в среде в качестве дополнительного источника питательных веществ и растет примерно в десять раз по сравнению с другими популяциями.
Измерения оптической плотности в культурах LTEE также могут быть использованы для мониторинга ожидаемого роста. В примере анализа конкуренции мы ожидаем, что более подходящий конкурент со временем увеличит свое представительство по сравнению с менее подходящим конкурентом. Изучение планшетов ТА с колониями, выращенными из разведений только одной реплики конкуренции между двумя штаммами-предками, показывает, что соотношение остается относительно постоянным в течение трехдневного эксперимента по конкуренции.
Напротив, популяция A+5 быстро вытесняет предка REL606. И популяция A-5 быстро вытесняет предка REL607. Две эволюционировавшие популяции почти равны.
Изображения красных и белых колоний остаются почти неизменными в течение трех дней соревнований. Используя подсчет колоний после одного дня совместной культуры, мы обнаруживаем, что приспособленность эволюционировавших популяций увеличилась на 60% во время LTEE по сравнению с предковыми штаммами E.coli. Продолжая переносить соревнования на несколько дней, мы можем повысить точность измерений относительной физической подготовки для участников, которые точно совпадают.
Но когда два конкурента имеют очень разную физическую форму, после многодневного соревнования уже нет адекватного представления обеих колоний для расчета относительной пригодности. Методы, которые мы демонстрируем здесь, имеют решающее значение для изучения уникальной исторической записи LTEE и для продолжения этого открытого эволюционного эксперимента. Они также могут послужить отправной точкой для тех, кто рассматривает новые эволюционные эксперименты, которые решают новые вопросы, используют новые среды и изучают различные микроорганизмы.
