1988年，理查德·伦斯基开始了一项进化实验。他用一种称为DM25的葡萄糖限制性定义生长培养基填充了12个锥形瓶。他用一种名为REL606的大肠杆菌菌株接种了其中六个烧瓶，该菌株无法利用糖阿拉伯糖作为营养物质。
这些人群被指定为A-1至A-6。他用一种几乎相同的菌株REL607接种了其他六个菌株，该菌株能够利用阿拉伯糖。这些祖先菌株，即从它们进化而来的大肠杆菌，当接种在四唑或阿拉伯糖琼脂上时可以区分。
Ara菌株形成红色菌落，Ara+菌株形成白色菌落。Lenski将这些烧瓶放置在37摄氏度的振荡培养箱中，使它们生长到饱和并排出培养基中的葡萄糖。此时，他将每个烧瓶中1%的培养物转移到一组含有新鲜培养基的新12个烧瓶中。
这些转移和再生的日常循环已经持续了几十年，创造了研究人员可以研究的悠久进化历史。在我们的协议中，我们描述了长期进化实验（LTEE）种群每天如何转移和培养。然后，我们描述了如何定期检查种群是否有可能的污染迹象并存档，以提供永久冷冻记录以供以后研究。
我们经常将其称为LTEE的化石记录。在LTEE中监测进化变化的整体节奏和特征的一个重要方法是通过测量实验中种群和菌株的相对适应性。我们描述了如何进行这些共培养竞争测定，并分析结果数据以计算相对适应度值。
我们将在此视频中展示这些过程中的第一个和最后一个过程。首先，我们将演示长期进化实验的日常转移。用 70% 乙醇或 10% 漂白剂溶液擦拭 LTEE 转移的表面，对进行 LTEE 转移的表面进行消毒。
点燃本生燃烧器以产生局部上升气流并使玻璃器皿燃烧。准备 13 个 50 毫升的耐热玻璃锥形瓶，上面盖有 20 毫升耐热玻璃或聚丙烯烧杯，这些烧杯经过高压灭菌和灭菌。检查烧瓶是否有可见的碎屑，并更换任何不完全干净的烧瓶。
使用红色标记标记六个烧瓶 A-1 至 A-6，使用黑色标记标记其他六个烧瓶 A+1 至 A+6。标记最后一个剩余的烧瓶，这将是空白的，日期，月日格式和星期几。使用无菌 10 毫升血清移液管用 9.9 毫升 DM25 培养基填充 13 个烧瓶中的每一个。
取下用作盖子的烧杯后，在更换烧杯之前，点燃每个烧瓶的口。在填充每个烧瓶之间点燃移液器的尖端。从振荡培养箱中取出前一天的LTEE烧瓶。
依次将每个放在灯光下以评估其浊度和颜色。检查烧瓶的完整性并寻找异物的存在。使用带有无菌过滤器吸头的P200微量移液器，将每个LTEE烧瓶中的100微升培养物转移到含有新鲜DM25的相应烧瓶中。
从 A-1 开始，然后转 A+1。之后，继续在负和加人口之间交替。为了跟踪哪些培养物被转移，将烧瓶向左移位，以便移液或移液到它们。
在转移过程中遵守严格的无菌技术。每次转移使用新鲜的移液器吸头。在开盖后和重新盖上盖子之前立即将烧瓶口点燃，并在每次转移之间用 Kimwipe 蘸有 70% 乙醇的 Kimwipe 擦拭微量移液器的桶和进样器。
将新接种的烧瓶在 37 摄氏度下孵育 24 小时，以每分钟 120 转的轨道振荡，直径为一英寸。将前一天的培养物储存在四摄氏度。将这些培养物保留两天。
丢弃三天前在四摄氏度下保存的旧培养物。在传输日志笔记本中输入时间、日期、传输号码、您的姓名或首字母缩写、区域性是否正常以及任何其他相关信息。在大肠杆菌长期进化实验的历史上，又经过了6 2/3代。
如果前一天的LTEE培养物有任何问题，事故或怀疑污染，请不要从中转移。相反，将整套 12 种培养物储存在 4 摄氏度下，以供以后检查和进一步表征。取回前一天转移并储存在四摄氏度的备用烧瓶。
将它们放在工作台上加热至室温。轻轻旋转每个烧瓶以重悬细胞。从每个烧瓶转移到一组新烧瓶中的新鲜培养基中，并正常继续实验。
在传输日志中记下您使用了备份区域性，并记录与前一天相同的传输编号。如果在储存在4摄氏度的备用烧瓶中发现污染，则必须从冷冻库存中重新开始受影响的LTEE种群。接下来，我们将展示一种共培养竞争测定法，可用于测量长期进化实验中两种菌株或群体的相对适应性。
我们将展示一个竞争实验，该实验进化了LTEE祖先REL606和607，以及两个进化的种群，20， 000代的种群A-5，REL8597;种群A + 5在20， 000代，REL8604。这些测定对每对Ara-和Ara+竞争对手使用六倍重复。确定您将使用多少个竞争对手的LTEE菌株和/或群体，以及将为每对竞争对手执行多少重复竞争测定。
准备必要的用品如下。对于复兴日，减去两天，填充一个无菌的 50 毫升锥形瓶，上面盖有 20 毫升烧杯，每株或大肠杆菌群体中加入 9.9 毫升 DM1000 或溶原肉汤 LB，将用作竞争对手。用9.9毫升相同的培养基再填充一个烧瓶，作为未接种的空白。
对于预处理日，减去一天，每个竞争对手用9.9毫升每体积重量0.85%重量的无菌盐水填充一个试管，在一对竞争对手之间用9.9毫升DM25每次重复测定填充两个烧瓶，以及一个装有9.9毫升DM 25的烧瓶用于空白。在比赛开始的那一天，第0天，用9.9毫升DM25填充一个烧瓶，用9.9毫升无菌盐水填充一个试管，并准备一个四唑或阿拉伯糖，或TA板，每个比赛测定重复。再用 9.9 毫升 DM25 填充一个烧瓶作为空白。
如果您正在进行为期三天的比赛，请再装满两套比赛瓶。在比赛的最后一天，用9.9毫升无菌盐水填充两个试管，并为每个比赛重复准备一个TA板。在比赛实验的减去第二天，您将竞争对手与冷冻库存分开复活。
从 80 摄氏度的冰箱中取出含有竞争对手菌株冷冻库存的冷冻管。使用时，将小瓶放在一个漂亮的桶中冷藏。每个冷冻原液解冻后，彻底涡旋以重悬大肠杆菌细胞。
如果复活克隆，则用12微升冷冻原液接种含有新鲜培养基的烧瓶。如果恢复种群，请接种120微升冷冻库存。将复活瓶在37摄氏度的空白中孵育过夜，以每分钟120转的轨道振荡，直径为一英寸。
在比赛实验减去一天时，您在 DM25 中单独对竞争对手进行预处理。将装有复活竞争对手培养物的烧瓶从培养箱中取出。将每个烧瓶中的100微升转移到该竞争对手的盐水试管中。
在将稀释培养物中的100微升转移到装有新鲜DM 25的烧瓶之前，彻底涡旋每个稀释管。为每个重复测定接种两个这些预处理瓶，每个竞争对手一个。将预处理瓶在37摄氏度的空白中孵育24小时。
在比赛实验的第 0 天，您将竞争对手和盘子混合以进行初始计数，从而开始比赛。将预处理瓶从培养箱中取出。将 50 微升 Ara-竞争对手转移到装满新鲜 DM25 的第一个复制竞赛烧瓶中。
立即将50微升Ara+竞争对手转移到同一竞赛瓶中。轻轻旋转混合烧瓶。重复这些步骤以合并您正在测试的所有竞争对手对的所有仿行。
将每个新接种的竞赛烧瓶中的100微升转移到标记用于该竞争测定重复的盐水试管中。将新的竞赛烧瓶和空白放入振荡培养箱中。同时，在同一天，彻底涡旋每个试管，并在TA板上接种80微升这些10， 000倍稀释液。
用混合的一对菌株、重复编号和零天标记每个板底部的侧面，以指示它将用于确定每个竞争对手的初始表示。在37摄氏度的重力对流培养箱中倒置孵育TA板，直到Ara和Ara+竞争对手的菌落可见且可区分。一般来说，这发生在 16 到 24 小时内，但对于一些进化的菌株可能需要更长的时间。
计算每个平板上Ara-red和Ara+白色菌落的数量并记录结果。如果您正在进行为期三天的比赛，则在生长后将每个比赛的100微升复制到新烧瓶中的9.9毫升新鲜DM25培养基中。将这些第一天烧瓶孵育 24 小时。
以相同的方式进行另一次转移，并将日二培养瓶孵育24小时，以在LTEE条件下完成竞争对手的三个完整的共培养生长周期。在比赛的最后一天、第一天或第三天，根据实验的时长，您将进行最终计数。将竞赛烧瓶从培养箱中取出。
将每个竞赛烧瓶中的100微升转移到第一个盐水试管中进行重复。涡旋每个100倍稀释管以彻底混合，并将100微升转移到第二管盐水中以进行复制。所得试管含有 10， 000 倍稀释的 DM25 培养物。
彻底涡旋每个含有10， 000倍稀释度的试管，并将其板80微升放在TA板上。用混合的一对菌株标记每个板底部的侧面、重复编号，以及为期一天的比赛的第一天或为期三天的比赛的第三天，以表明它将用于确定每个竞争对手的最终代表。在37摄氏度下孵育TA板，并在生长后计数Ara和Ara+菌落。
使用此协议随附的 Excel 电子表格或 Fitness RR 包来计算比赛中菌株的相对适应度并绘制结果。在长期进化实验的日常转移过程中，生长后培养物的密度非常低，通常必须通过将培养物放在空白旁边来判断。例外是群体A-3，它已经进化到使用培养基中的柠檬酸盐作为额外的营养来源，并增长到其他群体细胞密度的十倍左右。
LTEE培养物中光密度的测量也可用于监测预期的生长。对于示例竞争分析，我们预计相对于不太合适的竞争对手，更合适的竞争对手会随着时间的推移增加其代表性。检查具有仅稀释两个祖先菌株之间竞争的一个重复的菌落的TA板表明，在为期三天的竞争实验过程中，该比率保持相对恒定。
相比之下，A + 5种群迅速超过了REL606祖先。A-5种群迅速超过了REL607祖先。这两个进化的种群几乎势均力敌。
在为期三天的比赛中，红色和白色殖民地的表示几乎保持不变。使用共培养一天后的菌落计数，我们发现相对于大肠杆菌的祖先菌株，在LTEE期间，进化种群的适应性增加了60%。通过继续在多天内转移比赛，我们可以提高紧密匹配的竞争对手的相对体能测量精度。
但是，当两个竞争对手的健康状况非常不同时，经过多天的比赛后，两个群体的相对适应性不再有足够的代表性。我们在这里展示的方法对于研究LTEE的独特历史记录和继续这个开放式进化实验至关重要。它们还可以为正在考虑解决新问题、使用新环境和研究不同微生物的新进化实验的其他人提供一个起点。
