1988년, 리처드 렌스키(Richard Lenski)는 진화 실험을 시작했다. 그는 12개의 삼각 플라스크에 DM25로 알려진 포도당 제한 정의 성장 배지를 채웠습니다. 그는 이 플라스크 중 6개에 설탕 아라비노스를 영양소로 사용할 수 없는 REL606으로 알려진 대장균 균주를 접종했습니다.
이 집단은 A-1에서 A-6으로 지정되었습니다. 그는 아라비노스를 이용할 수 있는 REL607로 알려진 거의 동일한 균주를 다른 6개에게 접종했습니다. 이 조상 균주, 그들로부터 진화 한 대장균은 테트라 졸륨 또는 아라비 노스 한천에 도금 할 때 구별 될 수 있습니다.
Ara-strain은 적색 군체를 형성하고 Ara+strain은 백색 군체를 형성합니다. Lenski는 이 플라스크를 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에 넣어 포화 상태로 성장하고 배지에서 포도당을 배출할 수 있도록 했습니다. 이 시점에서 그는 각 플라스크에서 배양액의 1%를 신선한 배지가 들어 있는 새로운 12개의 플라스크 세트로 옮겼습니다.
이러한 매일의 이동과 재성장주기는 수십 년 동안 계속되어 연구자들이 연구 할 수있는 오랜 진화의 역사를 만들어 냈습니다. 프로토콜에서는 장기 진화 실험(LTEE) 개체군이 매일 어떻게 전달되고 배양되는지 설명합니다. 그런 다음 가능한 오염 징후가 있는지 개체군을 정기적으로 확인하고 나중에 연구할 수 있도록 영구적인 동결 기록을 제공하기 위해 보관하는 방법을 설명합니다.
우리는 종종 이것을 LTEE의 화석 기록이라고 부릅니다. LTEE에서 진화적 변화의 전반적인 템포와 특성을 모니터링하는 중요한 방법은 실험에서 개체군과 균주의 상대적 적합성을 측정하는 것입니다. 이러한 공동 배양 경쟁 분석을 수행하고 결과 데이터를 분석하여 상대적 적합성 값을 계산하는 방법을 설명합니다.
이 비디오에서는 이러한 절차의 첫 번째와 마지막을 보여 드리겠습니다. 먼저, 우리는 장기 진화 실험의 일일 이전을 보여줄 것입니다. LTEE가 전달될 표면을 70% 에탄올 또는 10% 표백제 용액으로 닦아 소독합니다.
분젠 버너에 불을 붙여 지역 상승 기류를 만들고 유리 제품의 연소를 가능하게 합니다. 오토클레이빙으로 세척 및 멸균된 13밀리리터 파이렉스 또는 폴리프로필렌 비커로 캡핑된 50밀리리터 파이렉스 삼각 플라스크 20개를 준비합니다. 플라스크에 눈에 보이는 파편이 있는지 확인하고 완벽하게 깨끗하지 않은 것은 교체하십시오.
빨간색 마커를 사용하여 6개의 플라스크 A-1에서 A-6에 레이블을 붙이고 다른 6개의 플라스크에는 검은색 마커를 사용하여 A+1에서 A+6까지 레이블을 지정합니다. 공백이 될 마지막 남은 플라스크에 날짜, 월-일 형식 및 요일로 레이블을 지정합니다. 멸균된 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 13개의 플라스크 각각에 9.9밀리리터의 DM25 배지를 채웁니다.
뚜껑 역할을 하는 비커를 제거한 후 비커를 교체하기 전에 각 플라스크의 입구에 불을 붙입니다. 각 플라스크를 채우는 사이에 피펫 끝을 불태웁니다. 진탕 인큐베이터에서 전날의 LTEE 플라스크를 꺼냅니다.
탁도와 색상을 평가하기 위해 빛에 비추어 각각을 차례로 검사하십시오. 플라스크 무결성을 확인하고 이물질이 있는지 확인하십시오. 멸균 필터 팁이 있는 P200 마이크로피펫터를 사용하여 각 LTEE 플라스크에서 100마이크로리터의 배양물을 신선한 DM25가 들어 있는 해당 플라스크로 옮깁니다.
A-1로 시작한 다음 A+1을 전송합니다. 그런 다음 마이너스 모집단과 플러스 모집단을 번갈아 가며 계속하십시오. 어떤 문화가 옮겨졌는지 추적하려면 플라스크를 왼쪽으로 이동하여 피펫팅을 하거나 피펫팅을 수행합니다.
이송 중 엄격한 무균 기술을 준수하십시오. 옮길 때마다 새 피펫 팁을 사용하십시오. 캡을 푼 직후와 뚜껑을 덮기 전에 플라스크의 입구에 불을 붙이고 각 이송 사이에 70% 에탄올을 적신 Kimwipe로 마이크로피펫의 배럴과 인젝터를 닦습니다.
새로 접종된 플라스크를 섭씨 37도에서 24시간 동안 1인치 직경에 걸쳐 분당 120회전의 궤도 진탕으로 배양합니다. 전날의 배양 물을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이 문화를 이틀 동안 유지하십시오.
이 시간에 3 일 전에 섭씨 4도에서 저장 된 오래된 문화를 버리십시오. 시간, 날짜, 이전 번호, 이름 또는 이니셜, 문화가 괜찮은지 여부 및 기타 관련 정보를 전송 로그 노트북에 입력합니다. 또 다른 6 2/3 세대는 대장균에 대한 장기 진화 실험의 역사에서 통과했습니다.
전날의 LTEE 문화에 문제, 사고 또는 오염이 의심되는 경우 이전하지 마십시오. 대신, 나중에 검사하고 추가 특성화를 위해 섭씨 4도에서 12개 배양 물 전체를 보관하십시오. 전날부터 옮겨 섭씨 4도에 보관한 백업 플라스크를 회수합니다.
벤치 탑에 올려 실온으로 데우십시오. 각 플라스크를 부드럽게 소용돌이 치면서 세포를 다시 일시 중단시킵니다. 각 플라스크에서 새로운 플라스크 세트의 신선한 배지로 옮기고 정상적으로 실험을 계속합니다.
백업 culture를 사용한 전송 로그를 기록하고 전날과 동일한 전송 번호를 기록합니다. 섭씨 4도에 보관된 백업 플라스크에서 오염이 발견되면 영향을 받는 LTEE 개체군을 냉동 재고에서 다시 시작해야 합니다. 다음으로, 장기 진화 실험에서 두 균주 또는 개체군의 상대적 적합성을 측정하는 데 사용할 수 있는 공동 배양 경쟁 분석을 시연할 것입니다.
우리는 LTEE 조상인 REL606과 607, 그리고 두 개의 진화된 인구, 20, 000세대의 인구 A-5, REL8597, 20, 000세대의 인구 A+5, REL8604를 진화시키는 경쟁 실험을 보여줄 것입니다. 이 분석은 Ara- 및 Ara- + 경쟁자의 각 쌍에 대해 6 배 복제를 사용했습니다. 사용할 경쟁사 LTEE 균주 및/또는 모집단의 수와 각 경쟁사 쌍에 대해 얼마나 많은 복제 경쟁 분석을 수행할 것인지 결정하십시오.
다음과 같이 필요한 물품을 준비하십시오. 부흥일, 둘째 날을 뺀 날, 경쟁자로 사용될 E.coli의 균주 또는 개체군당 9.9밀리리터의 DM1000 또는 용원성 액체, LB가 포함된 20밀리리터 비커로 덮인 멸균 50밀리리터 삼각 플라스크 1개를 채웁니다. 접종되지 않은 블랭크로 사용하기 위해 동일한 매체 9.9 밀리리터로 플라스크를 하나 더 채 웁니다.
전처리일, 1일을 뺀 날, 시험관 1개에 경쟁사당 부피당 0.85% 중량 멸균 식염수 9.9밀리리터, 경쟁사 쌍 사이에 복제 분석당 9.9밀리리터 DM25가 있는 플라스크 2개, 블랭크용 DM25 9.9밀리리터가 포함된 플라스크 1개를 더 채웁니다. 대회가 시작되는 날인 0일차에 플라스크 1개에 DM25 9.9밀리리터를 채우고, 시험관 1개에 멸균 식염수 9.9밀리리터를 채우고, 대회 분석 복제물당 테트라졸륨 또는 아라비노스 또는 TA 플레이트 1개를 준비합니다. 플라스크에 9.9밀리리터의 DM25를 하나 더 채워 블랭크로 사용합니다.
3 일간의 경쟁을 수행하는 경우 두 세트의 경쟁 플라스크를 추가로 채우십시오. 대회 마지막 날에는 두 개의 시험관에 9.9ml의 멸균 식염수를 채우고 대회 복제당 하나의 TA 플레이트를 준비합니다. 경쟁 실험에서 2 일을 뺀 날에는 냉동고 재고와 별도로 경쟁자를 부활시킵니다.
경쟁사 균주의 냉동 재고가 들어 있는 극저온 액체를 섭씨 80도 냉동고에서 꺼냅니다. 바이알을 사용하는 동안 좋은 양동이에 차갑게 보관하십시오. 각 냉동 스톡이 해동된 후 완전히 소용돌이쳐 E.coli 세포를 재현탁합니다.
클론을 되살리는 경우, 신선한 배지가 들어 있는 플라스크에 12마이크로리터의 냉동 스톡을 접종합니다. 개체군을 되살리는 경우 냉동 스톡 120마이크로리터를 접종하십시오. 1인치 직경에 걸쳐 분당 120회전의 궤도 흔들림으로 섭씨 37도에서 밤새 블랭크에서 부흥 플라스크를 배양합니다.
경쟁 실험 중 하나를 뺀 날에는 DM25에서 경쟁자를 별도로 사전 컨디셔닝합니다. 부활 한 경쟁자의 문화가 들어있는 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내십시오. 각 플라스크에서 100마이크로리터를 해당 경쟁자를 위한 식염수 시험관으로 옮깁니다.
희석된 배양물로부터 100 마이크로리터를 신선한 DM25가 있는 플라스크로 옮기기 직전에 각 희석 튜브를 완전히 소용돌이친다. 각 복제 분석에 대해 이러한 사전 컨디셔닝 플라스크 중 2개를 각 경쟁자에 대해 하나씩 접종합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 블랭크에서 예비 컨디셔닝 플라스크를 배양합니다.
경쟁 실험의 0일째에는 초기 카운트를 위해 경쟁 제품과 플레이트를 혼합하여 경쟁을 시작합니다. 인큐베이터에서 프리컨디셔닝 플라스크를 꺼냅니다. Ara-경쟁자 50마이크로리터를 신선한 DM25로 채워진 첫 번째 복제 경쟁 플라스크에 옮깁니다.
Ara+경쟁자 50마이크로리터를 동일한 경쟁 플라스크에 즉시 옮깁니다. 부드럽게 소용돌이 치면서 플라스크를 섞는다. 이 단계를 반복하여 테스트 중인 모든 경쟁 제품 쌍의 모든 반복실험을 결합합니다.
새로 접종된 각 경쟁 플라스크에서 100마이크로리터를 해당 경쟁 분석 복제를 위해 라벨링된 식염수 시험관으로 옮깁니다. 새 경쟁 플라스크와 블랭크를 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 한편, 같은 날, 각 시험관을 완전히 소용돌이 치고 TA 플레이트에 이들 10, 000 배 희석액 80 마이크로 리터를 플레이트합니다.
각 플레이트의 바닥 측면에 혼합된 한 쌍의 균주, 복제 번호 및 0일차에 라벨을 지정하여 각 경쟁자의 초기 표현을 결정하는 데 사용될 것임을 나타냅니다. 섭씨 37도의 중력 대류 인큐베이터에서 Ara-및 Ara+경쟁자의 콜로니가 보이고 구별될 때까지 TA 플레이트를 거꾸로 배양합니다. 일반적으로 이것은 16시간에서 24시간 이내에 발생하지만 일부 진화된 균주의 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다.
각 플레이트의 Ara-red 및 Ara+white 콜로니의 수를 세고 결과를 기록합니다. 3일 간의 경쟁을 수행하는 경우 각 경쟁의 100마이크로리터를 성장 후 새 플라스크에서 9.9밀리리터의 신선한 DM25 배지로 옮깁니다. 이 1일차 플라스크를 24시간 동안 배양합니다.
동일한 방식으로 또 다른 이식을 수행하고 24시간 동안 2일차 플라스크를 배양하여 LTEE 조건 하에서 경쟁자의 3개의 완전한 공동 배양 성장 주기를 완료합니다. 대회 마지막 날인 1일차 또는 3일차에는 실험 기간에 따라 최종 카운트를 위해 플레이트를 작성하게 됩니다. 인큐베이터에서 경쟁 플라스크를 꺼냅니다.
각 경쟁 플라스크에서 100마이크로리터를 해당 복제를 위한 식염수의 첫 번째 시험관으로 옮깁니다. 각 100배 희석 튜브를 소용돌이하여 완전히 혼합하고 100마이크로리터를 해당 복제를 위해 식염수의 두 번째 튜브로 옮깁니다. 생성 된 튜브에는 DM25 배양 물의 10, 000 배 희석액이 들어 있습니다.
10, 000배 희석액이 들어 있는 각 시험관을 완전히 소용돌이치고 TA 플레이트에 80마이크로리터를 플레이트합니다. 각 플레이트의 바닥 면에 혼합된 균주 쌍, 반복 횟수, 1일 대회의 경우 1일차, 3일 대회의 경우 3일차에 라벨을 붙여 각 경쟁자의 최종 표현을 결정하는 데 사용될 것임을 나타냅니다. TA 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하고 성장 후 Ara- 및 Ara+ 콜로니를 계산합니다.
이 프로토콜과 함께 제공된 Excel 스프레드시트 또는 Fitness RR 패키지를 사용하여 경쟁에서 균주의 상대적 적합성을 계산하고 결과를 도표화합니다. 장기 진화 실험의 일상적인 이동 동안, 성장 후 문화의 밀도는 매우 낮으며 종종 공백 바로 옆에 문화를 들고 판단해야합니다. 예외는 배지에서 구연산염을 추가 영양원으로 사용하도록 진화하고 다른 개체군의 세포 밀도의 약 10배까지 성장하는 개체군 A-3입니다.
LTEE 배양에서 광학 밀도를 측정하여 예상 성장을 모니터링할 수도 있습니다. 경쟁 분석의 예의 경우, 우리는 더 적합하지 않은 경쟁자에 비해 시간이 지남에 따라 더 적합한 경쟁자가 그 표현을 증가시킬 것으로 예상합니다. 두 조상 균주 간의 경쟁을 단 한 번의 복제물로 희석하여 성장한 콜로니가 있는 TA 플레이트를 조사한 결과, 3일간의 경쟁 실험 과정에서 비율이 비교적 일정하게 유지됨을 알 수 있습니다.
대조적으로, A+5 모집단은 REL606 조상을 빠르게 능가합니다. 그리고 A-5 인구는 REL607 조상을 빠르게 능가합니다. 진화된 두 개체군은 거의 균등하게 일치합니다.
빨간색과 흰색 식민지의 표현은 대회 3 일 동안 거의 동일하게 유지됩니다. 공동 배양 하루 후의 식민지 수를 사용하여 진화된 개체군의 적합성이 대장균의 조상 균주에 비해 LTEE 동안 60% 증가했음을 발견했습니다. 여러 날에 걸쳐 대회를 계속 전송함으로써 밀접하게 일치하는 경쟁자에 대한 상대적 체력 측정의 정밀도를 향상시킬 수 있습니다.
그러나 두 경쟁자가 매우 다른 체력을 가지고 있는 경우 상대적 체력을 계산하기 위해 여러 날에 걸친 경쟁 후에 더 이상 두 식민지를 적절하게 표현할 수 없습니다. 여기서 우리가 보여주는 방법은 LTEE의 독특한 역사적 기록을 연구하고 이 개방형 진화 실험을 계속하는 데 중요합니다. 그들은 또한 새로운 질문을 다루고, 새로운 환경을 사용하고, 다른 미생물을 연구하는 새로운 진화 실험을 고려하는 다른 사람들에게 출발점을 제공할 수 있습니다.
