En 1988, Richard Lenski a commencé une expérience d’évolution. Il a rempli 12 flacons d’erlenmeyer avec un milieu de croissance défini limité en glucose connu sous le nom de DM25. Il a inoculé six de ces flacons avec une souche d’E. coli connue sous le nom de REL606 qui est incapable d’utiliser le sucre arabinose comme nutriment.
Ces populations ont été désignées A-1 à A-6. Il a inoculé aux six autres une souche presque identique connue sous le nom de REL607 qui est capable d’utiliser l’arabinose. Ces souches ancestrales, les E. coli qui en sont issues, peuvent être distinguées lorsqu’elles sont plaquées sur gélose tétrazolium ou arabinose.
Les souches Ara forment des colonies rouges et les souches Ara+ forment des colonies blanches. Lenski a placé ces flacons dans un incubateur à agitation à 37 degrés Celsius, ce qui leur a permis de croître jusqu’à saturation et d’évacuer le glucose dans le milieu. À ce stade, il a transféré 1% de la culture de chacun des flacons dans un nouvel ensemble de 12 flacons contenant du milieu frais.
Ces cycles quotidiens de transfert et de repousse se poursuivent depuis des décennies, créant une longue histoire de l’évolution qui peut être étudiée par les chercheurs. Dans notre protocole, nous décrivons comment les populations de l’expérience d’évolution à long terme, ou LTEE, sont transférées et cultivées chaque jour. Ensuite, nous décrivons comment les populations sont régulièrement vérifiées pour détecter d’éventuels signes de contamination et archivées pour fournir un enregistrement congelé permanent pour une étude ultérieure.
Nous appelons souvent cela le registre fossile du LTEE, je cite. Un moyen important de surveiller le rythme global et la nature des changements évolutifs dans le LTEE consiste à mesurer les aptitudes relatives des populations et des souches issues de l’expérience. Nous décrivons comment mener ces tests de compétition de co-culture et analysons les données résultantes pour calculer les valeurs de fitness relatives.
Nous allons montrer la première et la dernière de ces procédures dans cette vidéo. Tout d’abord, nous démontrerons un transfert quotidien de l’expérience d’évolution à long terme. Désinfectez la surface sur laquelle les transferts LTEE seront effectués en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 % ou une solution d’eau de Javel à 10 %.
Allumez un brûleur Bunsen pour créer un courant ascendant local et permettre l’enflammement de la verrerie. Préparez 13 flacons Pyrex Erlenmeyer de 50 millilitres coiffés de béchers en Pyrex ou en polypropylène de 20 millilitres qui ont été lavés et stérilisés par autoclavage. Vérifiez que les flacons ne contiennent pas de débris visibles et remplacez ceux qui ne sont pas parfaitement propres.
Étiquetez six flacons A-1 à A-6 à l’aide d’un marqueur rouge, et les six autres flacons A+1 à A+6 à l’aide d’un marqueur noir. Étiqueter la dernière fiole restante, qui sera l’ébauche, avec la date, au format mois-jour, et le jour de la semaine. Remplissez chacune des 13 fioles avec 9,9 millilitres de milieu DM25 à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres.
Flammer l’embouchure de chaque fiole après avoir retiré le bécher servant de couvercle et avant de remplacer le bécher. Allumer la pointe de la pipette entre le remplissage de chaque fiole. Retirez les flacons LTEE de la veille de l’incubateur à secousses.
Examinez chacun d’eux à tour de rôle en le tenant à la lumière pour évaluer sa turbidité et sa couleur. Vérifier l’intégrité des fioles et rechercher la présence de corps étrangers. À l’aide d’une micropipette P200 munie d’un embout filtrant stérile, transférer 100 microlitres de culture de chaque fiole LTEE dans la fiole correspondante contenant du DM25 frais.
Commencez par A-1, puis transférez A+1. Après cela, continuez à alterner entre les populations moins et plus. Pour garder une trace des cultures qui ont été transférées, déplacez les flacons vers la gauche en tant que pipetage depuis ou vers elles.
Observez une technique d’asepsie stricte pendant les transferts. Utilisez une nouvelle pointe de pipette pour chaque transfert. Enflammer l’embouchure des flacons immédiatement après le débouchage et avant le rebouchuchon, et essuyer le canon et l’injecteur de la micropipette avec un Kimwipe humidifié avec de l’éthanol à 70% entre chaque transfert.
Incuber les flacons nouvellement inoculés à 37 degrés Celsius pendant 24 heures avec 120 tours par minute orbitales secouant sur un pouce de diamètre. Conservez les cultures de la veille à quatre degrés Celsius. Conservez ces cultures pendant deux jours.
Jetez les cultures plus anciennes qui ont été sauvées à quatre degrés Celsius trois jours auparavant à ce moment-là. Entrez l’heure, la date, le numéro de transfert, votre nom ou vos initiales, si les cultures étaient correctes ou non, et toute autre information pertinente dans le carnet de notes de transfert. 6 2/3 autres générations se sont écoulées dans l’histoire de l’expérience d’évolution à long terme avec E. coli.
S’il y a des problèmes, des accidents ou des soupçons de contamination avec les cultures LTEE de la veille, ne les transférez pas. Au lieu de cela, stockez l’ensemble des 12 cultures à quatre degrés Celsius pour un examen ultérieur et une caractérisation plus approfondie. Récupérez les flacons de secours qui ont été transférés de la veille et stockés à quatre degrés Celsius.
Placez-les sur la paillasse pour les réchauffer à température ambiante. Remuer doucement chaque fiole pour remettre les cellules en suspension. Transvaser de chaque fiole dans un milieu frais dans une nouvelle série de flacons et poursuivre l’expérience normalement.
Notez dans le journal de transfert que vous avez utilisé les cultures de sauvegarde et enregistrez le même numéro de transfert que la veille. Si une contamination est constatée dans les flacons de secours entreposés à quatre degrés Celsius, les populations LTEE touchées doivent être redémarrées à partir des stocks congelés. Ensuite, nous démontrerons un test de compétition de co-culture qui peut être utilisé pour mesurer la valeur adaptative relative de deux souches ou populations de l’expérience d’évolution à long terme.
Nous montrerons une expérience de compétition qui évolue à la fois des ancêtres LTEE, REL606 et 607, et de deux populations évoluées, la population A-5 à 20 000 générations, REL8597; et la population A + 5 à 20 000 générations, REL8604. Ces tests ont utilisé une réplication sextuelle pour chaque paire d’un concurrent Ara et Ara+. Décidez combien de souches et/ou de populations LTEE concurrentes vous utiliserez et combien de tests de compétition répétés seront effectués pour chaque paire de concurrents.
Préparez les fournitures nécessaires comme suit. Pour le jour de la reprise, jour moins deux, remplissez une fiole d’erlenmeyer stérile de 50 millilitres coiffée d’un bécher de 20 millilitres avec 9,9 millilitres de DM1000 ou de bouillon de lysogénie, LB, par souche ou population d’E. coli qui sera utilisée comme concurrent. Remplir une fiole de plus avec 9,9 millilitres du même milieu pour servir d’ébauche non inoculée.
Pour le jour de préconditionnement, jour moins un, remplir un tube à essai avec 9,9 millilitres de solution saline stérile à 0,85% poids par volume par concurrent, deux flacons avec 9,9 millilitres DM25 par essai répété entre une paire de concurrents, et un autre flacon avec 9,9 millilitres de DM25 pour un blanc. Pour le jour où la compétition commence, jour zéro, remplir une fiole avec 9,9 millilitres de DM25, remplir un tube à essai avec 9,9 millilitres de solution saline stérile et préparer un tétrazolium ou une plaque d’arabinose, ou TA, par répétition d’essai de compétition. Remplissez une autre fiole avec 9,9 millilitres de DM25 pour servir de flan.
Si vous participez à une compétition de trois jours, remplissez deux autres ensembles de flacons de compétition. Pour le dernier jour de la compétition, remplissez deux tubes à essai avec 9,9 millilitres de solution saline stérile et préparez une plaque TA par répétition de compétition. Le deuxième jour d’une expérience de compétition, vous relancez les concurrents séparément des stocks de congélateurs.
Sortez les cryoflacons contenant les stocks congelés des souches concurrentes du congélateur à 80 degrés Celsius. Gardez les flacons refroidis dans un joli seau pendant leur utilisation. Après chaque décongélation du stock congelé, le vortex à fond pour remettre en suspension les cellules d’E. coli.
En cas de réactivation d’un clone, inoculer la fiole contenant le milieu frais avec 12 microlitres de bouillon congelé. Si vous revivez une population, inoculez avec 120 microlitres du stock congelé. Incuber les flacons de réveil dans l’ébauche à 37 degrés Celsius pendant la nuit avec 120 tours par minute orbitale secouant sur un pouce de diamètre.
Le jour moins celui d’une expérience de compétition, vous préconditionnez les concurrents séparément dans DM25. Sortez de l’incubateur les flacons contenant les cultures des concurrents ressuscités. Transvaser 100 microlitres de chaque fiole dans le tube à essai de solution saline pour ce concurrent.
Bien vorter chaque tube de dilution avant de transférer 100 microlitres de la culture diluée dans une fiole contenant du DM25 frais. Inoculer deux de ces flacons de préconditionnement pour chaque essai de répétition, un pour chacun des concurrents. Incuber les flacons de préconditionnement dans l’ébauche à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le jour zéro d’une expérience de compétition, vous commencez la compétition en mélangeant les concurrents et l’assiette pour les dénombrements initiaux. Sortez les flacons de préconditionnement de l’incubateur. Transvaser 50 microlitres du concurrent Ara dans le premier flacon de compétition rempli de DM25 frais.
Transférer immédiatement 50 microlitres du concurrent Ara+ dans le même ballon de compétition. Mélanger la fiole en remuant doucement. Répétez ces étapes pour combiner toutes les répliques de toutes les paires de concurrents que vous testiez.
Transférer 100 microlitres de chaque fiole de compétition nouvellement inoculée dans le tube à essai de solution saline étiquetée pour cette répétition d’essai de compétition. Placez les nouveaux flacons de compétition et les flans dans l’incubateur à secousses. Pendant ce temps, le même jour, vortex soigneusement chaque tube à essai et plaquer 80 microlitres de ces dilutions 10 000 fois sur des plaques TA.
Étiquetez le côté du fond de chaque plaque avec la paire de souches qui ont été mélangées, le numéro de répétition et le jour zéro pour indiquer qu’il sera utilisé pour déterminer la représentation initiale de chaque concurrent. Incuber les plaques TA à l’envers dans un incubateur à convection gravitaire à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies des concurrents Ara et Ara+ soient visibles et distinguables. Généralement, cela se produit dans les 16 à 24 heures, mais cela peut prendre plus de temps pour certaines souches évoluées.
Comptez le nombre de colonies Ara-rouge et Ara+blanc sur chaque plaque et notez les résultats. Si vous effectuez une compétition de trois jours, transférez 100 microlitres de chaque compétition répliqués à 9,9 millilitres de milieu DM25 frais dans une nouvelle fiole après croissance. Incuber ces flacons du premier jour pendant 24 heures.
Effectuez un autre transfert de la même manière et incuber les flacons du deuxième jour pendant 24 heures pour compléter trois cycles complets de croissance de co-culture des concurrents dans des conditions LTEE. Le dernier jour de la compétition, le premier ou le troisième jour, selon la durée de votre expérience, vous ferez un carton pour le décompte final. Sortez les flacons de compétition de l’incubateur.
Transférer 100 microlitres de chaque fiole de compétition dans le premier tube à essai de solution saline pour cette répétition. Vortex chaque tube de dilution 100 fois pour bien le mélanger et transférer 100 microlitres dans le deuxième tube de solution saline pour cette répétition. Les tubes résultants contiennent des dilutions 10 000 fois des cultures DM25.
Vortex chaque tube à essai contenant une dilution de 10 000 fois complète et plaque 80 microlitres de celui-ci sur une plaque TA. Étiquetez le côté du fond de chaque plaque avec la paire de souches qui ont été mélangées, le numéro de répétition et le premier jour pour une compétition d’un jour ou le troisième jour pour une compétition de trois jours pour indiquer qu’il sera utilisé pour déterminer la représentation finale de chaque concurrent. Incuber les plaques TA à 37 degrés Celsius et compter les colonies Ara- et Ara+ après croissance.
Utilisez la feuille de calcul Excel fournie avec ce protocole, ou le package Fitness RR, pour calculer la valeur adaptative relative des souches de votre compétition et tracer les résultats. Pendant les transferts quotidiens de l’expérience d’évolution à long terme, la densité des cultures après la croissance est très faible et doit souvent être jugée en tenant une culture juste à côté d’un blanc. L’exception est la population A-3 qui a évolué pour utiliser le citrate dans le milieu comme source de nutriments supplémentaire et croît à environ dix fois la densité cellulaire des autres populations.
Les mesures de la densité optique dans les cultures LTEE peuvent également être utilisées pour surveiller la croissance attendue. Pour les exemples de tests de concurrence, nous nous attendons à ce qu’un concurrent plus en forme augmente sa représentation au fil du temps, par rapport à un concurrent moins en forme. L’examen des plaques TA avec des colonies issues de dilutions d’une seule réplique de la compétition entre les deux souches ancêtres montre que le rapport reste relativement constant au cours d’une expérience de compétition de trois jours.
En revanche, la population A+5 dépasse rapidement l’ancêtre REL606. Et la population A-5 surpasse rapidement l’ancêtre REL607. Les deux populations évoluées sont presque égales.
Les représentations de colonies rouges et blanches restent presque les mêmes pendant les trois jours de la compétition. En utilisant le nombre de colonies après une journée de co-culture, nous constatons que les capacités des populations évoluées ont augmenté de 60% au cours de la LTEE par rapport aux souches ancestrales d’E. coli. En continuant à transférer les compétitions sur plusieurs jours, nous pouvons améliorer la précision des mesures de condition physique relative pour les concurrents qui sont étroitement assortis.
Mais lorsque deux concurrents ont des conditions physiques très différentes, il n’y a plus de représentation adéquate des deux colonies après une compétition de plusieurs jours pour calculer la condition physique relative. Les méthodes que nous démontrons ici sont essentielles pour étudier le dossier historique unique du LTEE et pour poursuivre cette expérience d’évolution ouverte. Ils peuvent également fournir un point de départ pour d’autres qui envisagent de nouvelles expériences d’évolution qui abordent de nouvelles questions, utilisent de nouveaux environnements et étudient différents micro-organismes.
