著者らは、この研究に同意し、サンプルを提供してくれたすべての女性に感謝しています。

研究内容とプロトコルは、深セン中山泌尿器科病院の研究倫理委員会によって倫理的にレビューされ、承認されています。研究に参加したすべての女性(20〜40歳)は、サンプルの収集と使用についてインフォームドコンセントを提供しました。
1.病理組織の獲得
<ol><li>ティッシュ採取用のツール、つまり測定定規、ピンセット、埋め込みカセット、埋め込み紙、ティッシュバスケットを準備します。</li>
	<li>ピペルカテーテルによる標準的なアプローチを使用して収集された子宮内膜組織(緑豆よりも大きい)の量が十分であるかどうかを観察します。</li>
	<li>子宮内膜組織をホルマリンからピンセットで包埋紙に転写し、定規で子宮内膜組織の寸法を測定します。</li>
	<li>子宮内膜組織を包埋紙で包み、包埋カセットに入れます。</li>
	<li>包埋カセットをティッシュバスケットに入れて脱水します。</li>
</ol>2.組織の脱水
<ol><li>組織バスケットを脱水機の反応チャンバーに入れ( 材料表を参照)、日常的な組織脱水の手順を開始します:ホルマリンを100分間。ホルマリンを100分間。アルコール度数75%で60分。アルコール度数85%で60分。アルコール度数95%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。アルコール度数100%で60分。キシレンで35分。キシレンで20分。キシレンで20分。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスをかけます。80分間ワックスを塗る。このプロセスには約15時間かかります。</li>
	<li>組織脱水手順の最後に、脱水機の反応室を開き、組織バスケットを取り外します。</li>
</ol>3. 組織包埋
<ol><li>試料の大きさに応じて適当な包埋型を取り出し、70°Cでパラフィンワックスを充填する。</li>
	<li>ティッシュを型にすばやく入れ、ティッシュが型の中心に配置されるように慎重に調整します。</li>
	<li>金型を冷却プレートにスムーズに移動し、底のパラフィンが固まるまでティッシュをそっと押します。</li>
	<li>型の上に埋め込みカセットを置き、さらにワックスを補充します。</li>
	<li>金型を冷却プレートに置き、パラフィンが完全に固まったら、カセットを取り付けたブロックを金型から取り外します。</li>
</ol>4. 組織切片
<ol><li>ブロックをミクロトームのサンプルクリップに挿入し、ブレードをホルダーに置き、ブロックの平面とブレードの間の角度を調整し、セクションの厚さを4μmに調整し、ハンドホイールを回してスライスを開始します。</li>
	<li>ブロックからいくつかの薄い切片を切り取って、適切な組織表面を露出させます。ブラシで連続したセクションと完全なセクションを取り出します。</li>
	<li>十分な切片が切断されたら、ハンドホイールを回すのをやめ、ピンセットで前端の不適格な切片を取り除き、ピンセットとブラシでウォーターバス内の42°Cの水の表面に切片を浮かせます。</li>
	<li>切片が完全に平らになったら、剥離防止スライドで切片を選び、65°Cのスライドウォーマーに移して60分間焼きます。</li>
	<li>焼きが終わったら、スライドウォーマーからスライドガラスを取り出します。</li>
</ol>5. 免疫組織化学的染色
<ol><li>一次抗体を抗体希釈液で作業溶液に希釈します。詳しくは、 表 1 を参照してください。</li>
	<li>希釈した抗体溶液を専用の試薬ボトルに入れ、検出キットを自動IHC染色装置の試薬室に入れます( 材料表を参照)。</li>
	<li>スライドを特殊なカバータイルで覆われたスライドホルダーに置き、装置の実験反応コンパートメントに挿入します。</li>
	<li>スライド上の試薬と実験情報が自動的に認識されたら、[ 開始 ]ボタンをクリックして免疫組織化学染色を開始します。実験は約3時間続きます。</li>
</ol>6.スライドの脱水と密封
<ol><li>免疫組織化学的染色後、スライドホルダーを取り出し、特殊なカバータイルをはがし、染色したスライドをスライドホルダーに入れ、スライドに残っている染料をきれいな水で洗い流します。</li>
	<li>スライドホルダーを自動カバースリッパ( 材料表を参照)に移し、脱水および密封手順を選択して実行します。</li>
	<li>脱水と密封後にスライドを取り出します。</li>
</ol>7.スキャニングスライド
<ol><li>スライドをパノラマ病理画像スキャナーのスライドラック( 材料表を参照)に置き、パノラマ病理画像スキャン用の機器スライドスキャンコンパートメントに置きます。スキャンには2分かかります。 図 1 を参照してください。</li>
</ol>8. 画像の解析
<ol><li>画像をインポート<ol><li>病理画像解析ソフト( 資料表参照)を開き、新規フォルダを作成します。分析する免疫組織化学的画像をインポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>組織分類器の構築<ol><li>複数の組織と空白の注釈をマークして、組織と空白領域をそれぞれ識別するための分類器をトレーニングおよび確立します。</li>
		<li>リアルタイムチューニングを使用して、マーク注釈中にソフトウェアの認識能力をリアルタイムで観察します。認識がタイムリーでない場合は、注釈をメモし、組織認識が正確になるまで再度トレーニングします。</li>
	</ol></li>
	<li>ビルド分析アルゴリズム<ol><li>実験の種類に応じて、ソフトウェアで標準アルゴリズム(マルチプレックスIHC)を選択します。</li>
		<li>典型的なネガティブピクセルとポジティブピクセルを選択して、セル認識の色パラメータを設定します。 これに基づいて、核、細胞質、および細胞膜のパラメータを設定し、画像に最適なパラメータが見つかるまで、細胞認識状況をリアルタイムで観察します。</li>
		<li>正の細胞認識閾値を設定し、適切な閾値が調整されるまでリアルタイムに認識状況を観察します。</li>
		<li>アルゴリズムで組織分類器を選択し、組織分類器で組織部分をチェックして、組織に基づいて細胞を識別します。この時点で、解析アルゴリズムの確立は完了です。</li>
	</ol></li>
	<li>画像解析の実行<ol><li>解析エリアを選択します。確立されたアルゴリズムを使用して画像を解析します。</li>
	</ol></li>
	<li>ソフトウェア解析が終了したら、組織認識、陰性および陽性の細胞認識など、画像認識が正確かどうかを手動で確認します。</li>
	<li>画像認識が正確でない場合は、アルゴリズムとパラメーターのしきい値を再度調整し、成功するまで画像解析を再実行します。解析結果をエクスポートします。 図 1 を参照してください。</li>
	<li>他の免疫細胞も、上記の手順に従って分析できます(図1を参照)。さまざまな子宮内膜免疫マーカー(CD56 + uNK細胞、Foxp3 + Treg、CD68 +マクロファージ、CD163 + M2マクロファージ、CD1a + DCおよびCD8 + T細胞25,26)の実際の発現に応じて、さまざまな分析パラメーターを設定します。</li>
	<li>ソフトウェアの計算を通じて、子宮内膜免疫細胞の割合を取得します( 表2を参照)。これを使用して、反復流産患者の子宮内膜内のさまざまな免疫細胞のレベルを評価します。</li>
</ol>

免疫組織化学的に染色された子宮内膜組織の画像解析

<ol>
	<li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss:+a+committee+opinion.">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li><li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss.">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).</li><li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3,+CD4,+CD8,+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss.">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li><li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells.">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li><li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+percentage+of+CD3(+)T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss.">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li><li>Faas, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy.">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li><li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+CD56++natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage:+a+histomorphometric+study.">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure:+establishment+of+a+reference+range.">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF.">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li><li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage.">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li><li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients.">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li><li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy.">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li><li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).</li><li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model.">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).</li></ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルは、RM患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。ここでは、RM患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、6つの子宮内膜免疫マーカーが検出されました。
黄体中期の受容性子宮内膜は、着床と妊娠を成功させるための鍵です27,28。?...

不定育症(RM)とは、2回以上連続して妊娠ができない病気で、近年、臨床医から注目されている複雑な疾患です。出産可能年齢の女性におけるRMの発生率は1%〜5%です1。以前の研究の結果は、免疫因子がRM2,3,4,5の病因と密接に関連していることを示しています。母体と胎児の界面における免疫ホメオスタシスの維持は、胚の着床と発育に必要です。子宮内膜免疫細胞は、栄養膜浸潤の促進、螺旋動脈のリモデリング、胎盤の発達への寄与など、この恒常性を維持するためにいくつかの調節的役割を果たします6,7,8,9。
RMの女性における子宮内膜免疫細胞の異常は以前に報告されています。結果は、高密度の子宮ナチュラルキラー細胞(uNK)とRM10,11,12の発生との間に密接な関連があることを示しています。RMの女性の子宮内膜では、生児出産の女性と比較して、マクロファージの数の増加が報告されています13。制御性T細胞(Treg)は、胚に対する母体の免疫寛容に関与しており、RM患者の脱落膜ではそのレベルと機能が低下している14。細胞傷害性T細胞(CTL)と樹状細胞(DC)も妊娠の免疫調節に関与しています15,16。したがって、黄体期中期の局所子宮内膜免疫細胞の包括的な定量分析は、RMの病因をよりよく理解するのに役立ちます。子宮内膜免疫細胞の定量分析のためのいくつかの現在の方法は、複数のマーカーで免疫細胞を正確に標識できるフローサイトメトリーを使用しています17,18。しかし、フローサイトメトリーは新鮮な組織にしか実施できないため、臨床応用は限られています。新鮮な組織を得ることは、大量の過剰腫瘍が利用可能である場合にのみ実行可能ですが、子宮内膜ではまれに発生します。免疫組織化学は、組織の形態をその場でよく観察でき、さまざまな免疫細胞を標識することもできますが、従来の免疫組織化学的手法では免疫細胞の定量分析を行うことができません。
従来の免疫組織化学実験と比較して、子宮内膜内の免疫細胞の定量的免疫組織化学的分析は重要な臨床的意義を持っています。IHC強度スコアリングは、通常、病理学的診断および研究において4段階評価または強弱でランク付けされます19,20,21。しかし、この半定量的手法は主観的であり、非常に不正確であり、観察者内および観察者間の有意な変動性を示している22。考えられる解決策の1つは、デジタル画像解析23,24で貴重な機械学習の応用です。定量的な測定を行うことで、子宮組織内の免疫細胞の浸潤、分布、密度をより正確に評価することができます。この定量的情報は、月経周期中およびさまざまな病理学的状態における免疫細胞集団の動的変化を解明するのに役立ちます。全体として、免疫組織化学を通じて子宮内膜の免疫細胞を定量的に分析する能力は、子宮の免疫微小環境に関する貴重な洞察を提供します。
したがって、プロトコルは、デジタル免疫組織化学画像分析プラットフォームを開発および検証して、 RM患者の黄体中期にuNK細胞、Treg、マクロファージ、DC、細胞傷害性T細胞などの子宮内膜免疫細胞を定量的に分析します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

反復流産(RM)患者の子宮内膜免疫微小環境を評価するために、黄体中期の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するためのデジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。すべての子宮内膜サンプルは、月経周期の黄体中期に収集されました。パラフィン包埋子宮内膜組織を厚さ4 μmのスライドに切片化し、CD56+ uNK細胞、Foxp3+ Treg、CD163+ M2マクロファージ、CD1a+ DC、CD8+ T細胞などの子宮内膜免疫細胞を検出するために免疫組織化学(IHC)染色を実施しました。パノラマスライドはデジタルスライドスキャナーでスキャンし、定量分析には市販の画像解析システムを使用しました。子宮内膜免疫細胞の割合は、子宮内膜細胞全体の免疫細胞数を割って算出しました。市販の画像解析システムを用いることで、従来の画像解析では解析が困難または不可能であった子宮内膜免疫細胞の定量的評価を簡便かつ正確に解析することが可能となりました。この方法論は、免疫細胞間の相互作用を含む子宮内膜微小環境、およびさまざまな生殖不全患者の不均一性を定量的に特徴付けるために適用できます。子宮内膜免疫細胞の定量的評価のためのプラットフォームは、RM患者の診断と治療にとって重要な臨床的意義を持つ可能性があります。

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

著者スポットライト:子宮内膜免疫細胞の定量的評価のためのプロトコルによる生殖免疫学の進歩 

免疫組織化学とデジタル画像解析に基づく子宮内膜免疫細胞の定量的検出のためのプラットフォーム

Currently, it is challenging to stabilize the analysis within a certain range. It is also difficult to maintain the quality control of the experiment. Our research can help the patients with abnormal endometrial sensitivity in immune to find the cause of reproductive failure.The local proportion of immune cells in the endometrial can be stably and repeatedly detected. Our findings may promote the research progress of the endometrial sensitivity evaluation in patients with repeated implantation failure.

子宮内膜免疫細胞を定量的に評価し、人為的な操作ミスによる不安定性を低減するために、免疫組織化学の自動検出とデジタル定量評価システムを用いた子宮内膜免疫細胞のデジタル定量分析プラットフォームを構築しました。不振流産(RM)患者の子宮内膜免疫細胞を着床時に定量的に解析するために、免疫組織化学画像解析プラットフォームを確立しました。すべての子宮内膜組織は、月経...

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ここでは、着床期間中に反復流産した患者の子宮内膜免疫細胞を定量的に分析するために、デジタル免疫組織化学画像解析プラットフォームが開発され、検証されました。

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

現状では、一定範囲内で解析を安定させることが課題となっています。また、実験の品質管理を維持することも困難です。私たちの研究は、免疫の異常な子宮内膜感受性を持つ患者が生殖不全の原因を見つけるのに役立ちます。子宮内膜における免疫細胞の局所的な割合を安定して繰り返し検出することができます。本研究成果は、着床不全を繰り返す患者における子宮内膜感受性評価の研究の進展を促進する可能性があります。

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

759 ビュー.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. 現状では、一定範囲内で解析を安定させることが課題となっています。また、実験の品質管理を維持することも困難です。私たちの研究は、免疫の異常な子宮内膜感受性を持つ患者が生殖不全の原因を見つけるのに役立ちます。子宮内膜における免疫細胞の局所的な割合を安定して繰り返し検出することができます。本研究成果は、着床不全を繰り返す患者におけ?...

ビデオ: 著者スポットライト:子宮内膜免疫細胞の定量的評価のためのプロトコルによる生殖免疫学の進歩 

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze endometrial immune cells during the mid-luteal phase. All endometrium samples were collected during the mid-luteal phase of the menstrual cycle. Paraffin-embedded endometrial tissues were sectioned into 4 &#181;m thick slides, and immunohistochemistry (IHC)staining was carried out for detecting endometrial immune cells, including CD56+ uNK cells, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 macrophages, CD1a+ DCs, and CD8+ T cells. The panoramic slides were scanned using a digital slide scanner and a commercial image analysis system was used for quantitative analysis. The percentage of endometrial immune cells was calculated by dividing the number of immune cells in the total endometrial cells. Using the commercial image analysis system, quantitative evaluation of endometrial immune cells, which are difficult or impossible to analyze with conventional image analysis, could be easily, and accurately analyzed. This methodology can be applied to quantitatively characterize the endometrium microenvironment, including interaction between immune cells, and its heterogeneity for different reproductive failure patients. The platform for quantitative evaluation of endometrial immune cells may be of important clinical significance for the diagnosis and treatment of RM patients.

Here, a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze the endometrial immune cells of patients with recurrent miscarriages in the window of implantation.

生物学

Dehydration of Human Endometrial Tissue for Sectioning

To begin, use tweezers to transfer the endometrial tissue from the formalin onto the embedding paper. With a ruler, measure the dimensions of the endometrial tissue. Now wrap the tissue in the embedding paper and place it into an embedding cassette.Transfer the cassette into the tissue basket for dehydration. To dehydrate the endometrial tissue, place the tissue basket in the reaction chamber of the dehydrator and initiate the procedure for routine tissue dehydration. Once the dehydration is complete, open the reaction chamber of the dehydrator and remove the tissue basket.

切片作成のためのヒト子宮内膜組織の脱水

Human Endometrial Tissue Embedding and Sectioning for Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

To begin, select an appropriate embedding mold that matches the size of the dehydrated endometrial specimen. Fill it with paraffin wax, heated at 70 degrees Celsius. Immediately place the dehydrated human endometrial tissue in the mold.Use forceps to carefully adjust the tissue, to ensure it is placed centrally. Now, transfer the mold to the cooling plate and gently press the tissue with tweezers as the paraffin at the bottom solidifies. Place the embedded cassette over the mold, and top it with more wax.Then place the mold back on the cooling plate. Once the paraffin has solidified completely, remove the block and its attached cassette from the mold. For sectioning, insert the block onto the sample clip of the microtome.Place the blade into the holder and adjust the angle between the blocks plane and the blade. Now adjust the thickness of the section to four micrometers. Then turn the hand wheel to start slicing.Cut thin sections from the block to expose the appropriate tissue surface. Use the brush to gather the continuous and complete sections. Once enough sections have been obtained, use tweezers to remove the unqualified sections at the front.With a brush, transfer the sections into a warm water bath, heated to 42 degrees Celsius. When the sections have fully flattened out, use anti detachment slides to lift them. Next, bake them in a slide warmer at 65 degrees Celsius for over 60 minutes before removing.

ヒト子宮内膜組織の包埋と切片化による免疫組織化学およびデジタル画像解析

Tissue Immunohistochemical Staining of Sectioned Human Endometrial Tissue

To begin, transfer the diluted antibody solution into a special reagent bottle. Insert the detection kit into the reagent compartment of an automatic immunohistochemical standing instrument. Next, set the slides with the sectioned endometrial tissue on a slide holder and cover them with a special cover tile.Then insert the holder into the experimental reaction compartment of the instrument. Once the instrument automatically recognizes the information on the reagent and slide, press the start button to initiate the immunohistochemical staining. After staining, take out the slide holder.Put the stained slide into the slide holder to wash off any remaining dye with clean water. Now, place the slide holder onto an automated cover slipper and run the dehydration and sealing procedure. Remove the slides once dehydration and sealing are complete.

切片化されたヒト子宮内膜組織の組織免疫組織化学的染色

Tissue Scanning and Image Analysis of Immunohistochemically Stained Human Endometrium

To start, place the slides with the immunohistochemically stained endometrial sections on the slide rack of a panoramic pathological image scanner. Then, place the rack in the instrument's slide scanning compartment to initiate scanning. Once scanning is complete, launch the image analysis software and create a new folder.Import the images that require analysis. To build a tissue classifier, mark several tissues along with a blank annotation to establish a classifier that identifies the tissue and blank areas. Use realtime tuning to observe the software's recognition capacity during the mark annotation.To build an analysis algorithm, select the standard multiplex IHC algorithm in the software and choose the negative and positive pixels to set the color parameters of cell recognition. Establish the parameters of the nucleus, cytoplasm, and cell membrane until the optimal parameters for the image are found. Now, set the positive cell recognition threshold and optimize it until an appropriate threshold is obtained.Next, select the tissue classifier in the algorithm. Check the tissue part within it to identify cells based on tissues. Select the analysis area and then use the established algorithm to analyze the images.Once the analysis is complete, manually check the accuracy of tissue recognition, negative and positive recognition. If the image recognition is inaccurate, adjust the algorithm and parameter thresholds again. Run the image analysis until it is successful.Then, export the results of the analysis. Set the different analysis parameters according to the expression of different endometrial immune markers. Use the software to calculate the proportion of endometrial immune cells.Following calculation, use the values to assess the levels of various immune cells in the endometrium of patients with recurrent miscarriage. Different immune cells were immunohistochemically stained based on their individual expression of different markers. The brown stain represents the positive immune cells and the blue represents the nucleus.Different immune cells were expressed in women with recurrent miscarriages. CD56 cells appear to be predominant at 16.76%with CD1a and Foxp3 cells making up 0.11 to 0.12%of the immune cell population.