この研究は、NIHのODグラントR24OD031956によって支援されました。Samantha Jalbert、Jill Ralston、Cora Andersonの支援とサポート、および有益なフィードバックを提供してくださった編集者と匿名の査読者に感謝します

すべての実験は、ハーバード大学医学部のIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)の規則と規制に従って行われました。代表的な結果は、灌流された成熟したアルビノの雄と灌流されていない成熟アルビノの雄 Xenopus laevisの両方について示されています。
1. 実験の準備 
注:サンプリング前に灌流プロトコル8 に従っている場合は、ステップ2.2にスキップしてください。
<ol><li>研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死技術を承認していることを確認してください。</li>
	<li>5 g / L MS-222(メタンスルホン酸トリカイン)と5 g / L重炭酸ナトリウム( 材料の表を参照)の溶液を準備します。.容積は、安楽死させる動物を完全に覆うために必要な容積よりも大きくなければなりません。pHをチェックして、≥7であることを確認します。</li>
	<li>Xenopusを安楽死溶液に入れることにより、一次安楽死を実行します。動物は合計1時間水中に留まります。</li>
	<li>サンプリングの直後に、すべての組織をチルドPBSまたは0.7x PBS9 (実験ニーズによる)ですすぎ、チェックし、5倍(またはそれ以上)の倍率ライトでトリミングできるように、解剖ステーションを設定します。このステーションは、ユーザーがすべての鉗子とはさみを交換するか、使用の合間にきれいに拭くこともできる必要があります。</li>
	<li>カエルが溶液に1時間入ると、一次安楽死が完了します。カエルを取り除き、足をつまむことで痛みの反応の喪失を確認します。</li>
	<li>動物の種類、系統、性別、年齢、健康状態、灌流されたかどうかなど、動物の適切な詳細を記録します。 Xenopus の重量を量り、鼻の通気口の長さなどの追加の測定を行います。</li>
	<li>カエルを仰向けに置き、手足を体に近位に固定します(図1)。</li>
	<li>解剖ハサミを使用して、皮膚を切り取り、正中線を上向きに切り、次に横方向に切り込み、2つのフラップを作ります。</li>
	<li>図2を参照して、linea albaを特定し、鉗子を使用してそれをつかみ、体腔から引き離します。ハサミを使って筋肉組織を丁寧に切り取ります。キャビティ壁から2つのフラップを作ります。すべてのフラップを邪魔にならないようにカットまたはピンで留めます。</li>
	<li>まだ鼓動している心臓を特定します。解剖ハサミを使用して烏口骨を減らし(図2)、心臓へのアクセスを改善します。 注:サンプリング前に心臓の鼓動が止まった場合は、サンプルの鮮度が損なわれていることに注意する必要があります。</li>
</ol>2. サンプリング
注:動物が灌流されている場合は、手順2.2にスキップしてください。
<ol><li>細い心膜を特定し、組織鉗子でぴんと張ってください(図3)。</li>
	<li>虹彩切除術のはさみの先端を使用して、下にある組織を切らないように注意しながら、心膜に優しく穴を開けます。心膜を心臓の3つの心室から離して剥がします。</li>
	<li>鉗子を使用して心室を頂点でつかみ、心室が耳介と動脈幹に付着する場所を特定し(図4)、これらのアタッチメントの下で切断します(図5)。必要に応じて、心室をトリミングして、耳介または動脈幹からの組織が見えないようにし、明るい色の弁組織が心室内に見えるようにします。 注:灌流されていない動物では、心室の除去は二次安楽死と見なされる場合があります。</li>
	<li>肝臓の3つの葉が見えます(図6 および 図7)。左葉の唇(視聴者の右側)をつかみ、肝管と嚢胞管が見えるようにゆっくりと持ち上げます(図8)。これらのアタッチメントの下にあるローブの底部1/3をサンプリングします(図9)。</li>
	<li>雌のカエルの組織へのアクセスを改善するには、卵巣を切除することが役立ちます。胚上皮と呼ばれる内臓腹膜の層に包まれている卵巣を特定します。ローブをそれぞれの側面に来るまでゆっくりと動かして、アタッチメントの領域が見えるようにします(図10)。これらのアタッチメントは、対になった腎臓に直接腹側にあります。</li>
	<li>はさみを使用して、卵巣を傷つけずに腎臓にできるだけ近づけて卵巣を取り出します(図11)。</li>
	<li>肝臓の内側葉(前葉とも呼ばれる)を検査し、腸間膜および肝膵管(総胆管とも呼ばれる)を介して胃および十二指腸にどのように接続しているかを確認します(図6、 図7、 および図8)。</li>
	<li>腸間膜、虹彩切除ハサミを使用して肝十二指腸靭帯を切断し、十二指腸と出会う肝膵管を切断します。膵臓と肝膵管と肝臓の内側葉との接続を切断して、暗い肝臓組織が付着しないようにします(図12)。</li>
	<li>歯付き鉗子で胃をつかみ、組織鉗子で膵臓の上端をつかみます。5倍の倍率で、膵臓を胃からそっとからかいます(図13)。 注:きれいに剥がれない場合は、残りの膵臓組織が見え、断片的に摘み取ることができます。あるいは、虹彩切除術のハサミや組織鉗子を使用して、膵臓を系統的に剥離することもできます。</li>
	<li>図14Aを参照して、膀胱を特定し、それを取り外し、総排泄腔にできるだけ近づけます。このティッシュを捨ててください。</li>
	<li>図14Bを参照して、大腸を特定し、それをぴんと張って、大腸を総排泄腔にできるだけ近づけて切断します。消化管全体を取り除いて廃棄し、脾臓に付着している腹膜を切断します。太った体は完全にアクセス可能になります。</li>
	<li>脂肪体がそれぞれの側に来るように、脂肪体をからかいます。脂肪体が腹膜につながっている腎臓の上の領域が見えます。左の脂肪体の基部(視聴者の右側)をつかみ、はさみを使用して腹膜から切り取り、腎臓が損傷しないように小さなマージンを残します(図15)。</li>
	<li>残った脂肪体を取り出して捨てます。ペアになった腎臓が完全に見えるようになります。</li>
	<li>雌のカエルまたは明確な痕跡卵管を持つ雄では、卵管をつかんで腎臓と総排泄腔から引き離します(図16)。卵管が総排泄腔と出会う場所で卵管を切断し、腎臓から引き離し続け、明らかな腹膜の付着物が明らかになったら切断します。このティッシュを捨ててください。</li>
	<li>残りの卵管でこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>腎臓はまだ透明な腹膜(後腹膜)で覆われています10。鉗子を使用して腎臓をつかみ、腹膜の下端を切断します。</li>
	<li>腎臓を体腔から持ち上げ、はさみを使用して、腎臓に損傷を与えることなく、腎臓にできるだけ近い腹膜を切断します(図17)。</li>
	<li>5倍の拡大で、余分な腹膜と他の残りの組織(脂肪体、脾臓)を切り取ります。カエルが雌の場合は、残っている卵巣組織がすべて除去されていることを確認してください(図18)。カエルがオスの場合は、精巣を慎重に取り外し、拡大しないと見えない可能性のある痕跡卵管を確認します(図19)。</li>
	<li>動物からピンを取り外し、腹側にひっくり返して、動物の手足を再度ピンで固定します。</li>
	<li>サンプリングする後肢を選択し、その肢の足を固定します。</li>
	<li>腓腹筋/脛骨腓骨の上からアーモンド型の皮膚のフラップを取り除きます(図20)。</li>
</ol>

成体 Xenopus 器官のための標準化された解剖およびサンプリングプロトコル

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

このプロトコルは鮮度を最大限に高めることを目的としているため、サンプルによっては望ましくない組織が含まれている場合があります。たとえば、肝膵管と一部の腸間膜は膵臓でサンプリングされ、一部の腹膜組織、副腎、および尿管は常に対になった腎臓でサンプリングされます。 鮮度が問題にならない場合は、修正された技術を使用してより正確なサンプリングを実現できます。
臓器の外観と位置は、 Xenopusの性別と種間で同等です。ただし、組織の色は、動物が灌流されているかどうかによって大きく異なります。このため、灌流された動物と灌流されていない動物の両方の画像が含まれています。
このプロトコルの制約は、目的の組織の全体を最もよく表すサンプルの収集よりも、速度と再現性が優先されることです。たとえば、ここでサンプリングされた肝臓の左葉のセクションは、肝臓組織の 3 つの葉すべてを適切に表すことはできません。サンプリングにエラーがある場合、トラブルシューティングのオプションは、組織の異なるセクション間で変動する可能性の影響を受けます。例えば、肝臓の右葉、右脂肪体、または皮膚の異なる部分が、所望の組織の機能的な代替手段となるかどうかは不明である。このような場合、組織の切片を置き換える前に、研究のニーズに基づいて裁量権を行使する必要があります。
このプロトコルの別の制限は、サンプリングされる動物が重大な解剖学的欠陥または臨床的に重大な健康上の問題を抱えている場合、体腔内の臓器がここで説明したように表示されない可能性があることです。Mycobacterium spp.11,12に感染したカエルの組織に肉芽腫が見つかっており、卵巣過剰刺激症候群の以前の症例では、臓器の異常な提示につながるようです13。
この方法は実験室の Xenopusのために開発されましたが、多くの非盲腸両生類と四肢の爬虫類のこれらの器官の外観には大きな類似点があります14。このプロトコルのサンプリング部分は、ウーパールーパーやグリーンアノールなどの他のモデルに簡単に変更できます。

「成体のXenopusのデジタル解剖」は利用可能ですが1、成体のXenopusの複製可能な臓器および組織サンプリングは、他の成体モデル(例:マウス2,3,4)に利用可能な詳細な指示がなければ依然として困難です。この記事は、現在幼虫に利用可能なものと同様に、成虫Xenopusの正確で複製可能な臓器サンプリングのための明確なガイダンスを提供することを目的としています5。完成のしやすさに重点が置かれ、最大限の鮮度を維持し、すべてのユーザーがプロトコルにアクセスできるようにします。
Rana sp.6の徹底的な解剖ガイドや、他の無尾類7の教室解剖ガイドは多数ありますが、Xenopusの解剖とサンプリングのガイドは現在利用できません。サンプリングの実践や両生類の解剖学に詳しくない人のために説明すると、Xenopusと他の無尾類とのわずかな違いにより、これらのリソースは複製可能な組織サンプリングには最適ではありません。
多くの貴重な組織は含まれておらず、現在のガイドには廃棄されています。これは、組織の鮮度を確保するためです。6つのサンプルは、ユーザーの経験やスキルレベルに関係なく、心臓が鼓動し始めてから1時間以内にこれらの組織を収集できることを保証するのに十分な制限があります。他の多くの組織を収集するためのより高度で詳細なガイドは、個別のコンパニオンペーパーとして準備中です。
経験の浅いユーザーの場合、このプロトコルは、交換が困難な動物(トランスジェニック、高齢の動物など)をサンプリングする前に、実験以外の理由で安楽死させられる動物で最初に試みることを常にお勧めします。理想的には、サンプリングされたすべての動物が健康であり、雌の場合は過去2週間に排卵していないことが望ましい。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus は、100年以上にわたり、脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。胚の実験的分析および解剖技術は十分に文書化されていますが、成体の Xenopus の構造と器官の説明は、成体と協力するための技術とともに、定量的プロテオミクスやシングルセルトランスクリプトミクスなどの最新のアプローチの要件を考慮に入れて更新されていません。細胞型および遺伝子中心の視点では、胚期と成体組織での観察を対照的に行う必要があります。幼虫の臓器は、幼虫から成虫への移行全体にわたって、特に大規模な変態リモデリング中に、全体的な構造、形態、および解剖学的位置に大きな変化を遂げます。臓器の同定と解剖のための強固な基準を確立することは、異なる研究所で実施された研究から得られたデータセットの一貫性を確保するために重要です。現在のプロトコルでは、成人の Xenopusの6つの臓器を特定し、心臓の解剖とサンプリングの方法を実証しています 心臓室、肝臓、脂肪体、膵臓、対になった腎臓、および成人 のXenopusの皮膚。保存方法にもよりますが、解剖した臓器は、定量的プロテオミクス、単一細胞/核トランスクリプトミクス、 in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学などに使用できます。このプロトコルは、組織サンプリングを標準化し、成体臓器系のマルチラボ調査を促進することを目的としています。

図1から図20を利用し、このプロトコルのすべてのステップに従うことにより、心室、肝臓の左葉、膵臓、左脂肪体、対になった腎臓、および皮膚のフラップを安楽死から1時間以内にきれいに切除しました。この時間内に、図21に示すように、サンプルが現れるようにサンプルをすすぎ、トリミングします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig1.JPG"> 図1:ピン留めされたXenopus。 成熟したメスのX.tropicalisが各手足に固定されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig1large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig2.jpg"> 図2:腹壁。X. tropicalisの雌の腹側皮膚はフラップに切断され、白杖線と烏口骨が見えるようにします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig3.JPG"> 図3:心膜に囲まれた心臓。 心室の頂点は心膜を通してつかまれます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig3large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig4.JPG"> 図4:心室と動脈幹。灌流されたX悶骨の心室がつかまれ、動脈幹への付着を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig4large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig5.JPG"> 図5:ハート図。 心臓の関連する構造の図で、心室をサンプリングする場所を示す破線が付いています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig5large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig6.JPG"> 図6:肝膵臓図。 肝臓、膵臓、および関連臓器の3つの葉の図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig6large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig7.JPG"> 図7:肝膵臓器官。 灌流されたアルビノのX.laevisオスで、肝臓、膵臓、および関連臓器の3つの葉がラベル付けされています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig7large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig8.JPG"> 図8:嚢胞管と肝管。肝臓の左葉が持ち上げられ、灌流されたX.laevisの嚢胞管と肝管が見えます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig8large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig9.JPG"> 図9:肝臓のサンプリング。灌流されていないX.tropicalisの左肝葉は、肝管の付着物の下で切断されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig9large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig10.JPG"> 図10:卵巣の付着。卵巣葉がそれぞれの側にあるため、胚上皮から腹膜壁(腎臓の上)までの連続性が見えます。2 本の白い破線は、これらのアタッチメントを切断する場所を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig10large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig11.JPG"> 図11:卵巣の除去。灌流されていないX.laevisの卵巣は、対になった腎臓から引き離されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig11large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig12.JPG"> 図12:間膜切開。灌流されていないX. laevisの体腔内、心臓室と肝臓の左葉のサンプリング、および卵巣の摘出後。白い破線は肝膵靭帯と管を切断する場所を示し、緑の破線は肝臓の内側葉から膵臓を切断する場所を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig12large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig13.jpg"> 図13:膵臓のサンプリング。 灌流されていないX.laevisの膵臓が胃から摘み取られています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig14.JPG"> 図14:臓器摘出。 (A)灌流されていないX.laevisの膀胱は、それを切る場所を示す破線で総排泄腔から引き離されます。(B)灌流されていないX.laevisの大腸は、総排泄腔から引き離されており、どこで切断するかを示す破線が付いています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig14large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig15.JPG"> 図15:脂肪体サンプリング。 対になった腎臓の上端にある腹膜に付着した脂肪体は、体腔から引き出され、それらを切断する場所を示す破線で引き出されます。このアタッチメントに隣接して、このオスのX.tropicalisは1つの精巣と一対の明確な痕跡卵管を持っていることに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig15large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig16.JPG"> 図16:卵管の取り外し。 灌流されたX. laevisの卵管は、対になった腎臓から引き離され、透明な腹膜が見えるようになります。破線は腹膜を切開する場所を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig16large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig17.JPG"> 図17:腎臓のサンプリング。 灌流されていないX. laevisの対になった腎臓は、体腔から持ち上げられています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig17large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig18.jpg"> 図18:腎臓 のトリミング。 (A)灌流されていない雌の X. laevisの対になった腎臓と関連する腹膜器官の腹側図。(B)関連する臓器が切除されたが、腹膜組織が残っている同じ腎臓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig18large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig19.JPG"> 図19:精巣の除去。 灌流されていないX. tropicalisの対になった腎臓と1つの精巣を切除します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig19large.JPG" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig20.jpg"> 図20:スキンサンプリング。 (A)X.tropicalisの右脚で、サンプリングする皮膚の領域を示す破線が付いています。(B)脛骨腓骨の上に皮膚サンプルを切除したX.tropicalisの右脚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig20large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 21" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66489/66489fig21.jpg"> 図21:臓器サンプリングの代表的な結果。灌流および灌流されていないアルビノX.laevisから採取した心室、肝臓、膵臓、脂肪体、対腎臓、および皮膚のサンプル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66489/66489fig21large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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著者スポットライト:プロテオミクスおよび免疫化学研究における組織サンプリングの標準化(英語)

この記事では、成人 のXenopus で迅速かつ簡単にアクセスできる6つの重要で多様な臓器(心室、肝葉、膵臓、脂肪体、対になった腎臓、皮膚)をサンプリングするためのガイドを提供します。

成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

この研究に先立ち、私は迅速な両生類灌流のためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、プロテオミクスや免疫化学など、組織に過剰な量の血液が存在することが望ましくない研究のためにサンプリングする前に利用する必要があります。利用可能な多くの図やその他の補助がありますが、現在のところ、成体の異種から組織を迅速かつ確実に解剖する方法についての包括的なガイドはありません。標準化されたサンプリング技術により、ラボ間で組織を簡単に共有できるようになることを願っています。これは、バイオセキュリティの懸念や輸送上の制約により動物の輸出入が不可能な状況で特に有利です。

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

813 ビュー.  Harvard Medical School. この研究に先立ち、私は迅速な両生類灌流のためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、プロテオミクスや免疫化学など、組織に過剰な量の血液が存在することが望ましくない研究のためにサンプリングする前に利用する必要があります。利用可能な多くの図やその他の補助がありますが、現在のところ、成体の異種から組織を迅速かつ確実に解剖する方法?...

ビデオ: 著者スポットライト:プロテオミクスおよび免疫化学研究における組織サンプリングの標準化(英語)

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

生物学

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

モルモットにおける非ターミナル採血テクニック

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.