Name: techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus
Uploaded: 2024-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
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この研究は、NIHのODグラントR24OD031956によって支援されました。Samantha Jalbert、Jill Ralston、Cora Andersonの支援とサポート、および有益なフィードバックを提供してくださった編集者と匿名の査読者に感謝します

すべての実験は、ハーバード大学医学部のIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)の規則と規制に従って行われました。代表的な結果は、灌流された成熟したアルビノの雄と灌流されていない成熟アルビノの雄 Xenopus laevisの両方について示されています。
1. 実験の準備 
注:サンプリング前に灌流プロトコル8 に従っている場合は、ステップ2.2にスキップしてください。
<ol><li>研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死技術を承認していることを確認してください。</li>
	<li>5 g / L MS-222(メタンスルホン酸トリカイン)と5 g / L重炭酸ナトリウム( 材料の表を参照)の溶液を準備します。.容積は、安楽死させる動物を完全に覆うために必要な容積よりも大きくなければなりません。pHをチェックして、≥7であることを確認します。</li>
	<li>Xenopusを安楽死溶液に入れることにより、一次安楽死を実行します。動物は合計1時間水中に留まります。</li>
	<li>サンプリングの直後に、すべての組織をチルドPBSまたは0.7x PBS9 (実験ニーズによる)ですすぎ、チェックし、5倍(またはそれ以上)の倍率ライトでトリミングできるように、解剖ステーションを設定します。このステーションは、ユーザーがすべての鉗子とはさみを交換するか、使用の合間にきれいに拭くこともできる必要があります。</li>
	<li>カエルが溶液に1時間入ると、一次安楽死が完了します。カエルを取り除き、足をつまむことで痛みの反応の喪失を確認します。</li>
	<li>動物の種類、系統、性別、年齢、健康状態、灌流されたかどうかなど、動物の適切な詳細を記録します。 Xenopus の重量を量り、鼻の通気口の長さなどの追加の測定を行います。</li>
	<li>カエルを仰向けに置き、手足を体に近位に固定します(図1)。</li>
	<li>解剖ハサミを使用して、皮膚を切り取り、正中線を上向きに切り、次に横方向に切り込み、2つのフラップを作ります。</li>
	<li>図2を参照して、linea albaを特定し、鉗子を使用してそれをつかみ、体腔から引き離します。ハサミを使って筋肉組織を丁寧に切り取ります。キャビティ壁から2つのフラップを作ります。すべてのフラップを邪魔にならないようにカットまたはピンで留めます。</li>
	<li>まだ鼓動している心臓を特定します。解剖ハサミを使用して烏口骨を減らし(図2)、心臓へのアクセスを改善します。 注:サンプリング前に心臓の鼓動が止まった場合は、サンプルの鮮度が損なわれていることに注意する必要があります。</li>
</ol>2. サンプリング
注:動物が灌流されている場合は、手順2.2にスキップしてください。
<ol><li>細い心膜を特定し、組織鉗子でぴんと張ってください(図3)。</li>
	<li>虹彩切除術のはさみの先端を使用して、下にある組織を切らないように注意しながら、心膜に優しく穴を開けます。心膜を心臓の3つの心室から離して剥がします。</li>
	<li>鉗子を使用して心室を頂点でつかみ、心室が耳介と動脈幹に付着する場所を特定し(図4)、これらのアタッチメントの下で切断します(図5)。必要に応じて、心室をトリミングして、耳介または動脈幹からの組織が見えないようにし、明るい色の弁組織が心室内に見えるようにします。 注:灌流されていない動物では、心室の除去は二次安楽死と見なされる場合があります。</li>
	<li>肝臓の3つの葉が見えます(図6 および 図7)。左葉の唇(視聴者の右側)をつかみ、肝管と嚢胞管が見えるようにゆっくりと持ち上げます(図8)。これらのアタッチメントの下にあるローブの底部1/3をサンプリングします(図9)。</li>
	<li>雌のカエルの組織へのアクセスを改善するには、卵巣を切除することが役立ちます。胚上皮と呼ばれる内臓腹膜の層に包まれている卵巣を特定します。ローブをそれぞれの側面に来るまでゆっくりと動かして、アタッチメントの領域が見えるようにします(図10)。これらのアタッチメントは、対になった腎臓に直接腹側にあります。</li>
	<li>はさみを使用して、卵巣を傷つけずに腎臓にできるだけ近づけて卵巣を取り出します(図11)。</li>
	<li>肝臓の内側葉(前葉とも呼ばれる)を検査し、腸間膜および肝膵管(総胆管とも呼ばれる)を介して胃および十二指腸にどのように接続しているかを確認します(図6、 図7、 および図8)。</li>
	<li>腸間膜、虹彩切除ハサミを使用して肝十二指腸靭帯を切断し、十二指腸と出会う肝膵管を切断します。膵臓と肝膵管と肝臓の内側葉との接続を切断して、暗い肝臓組織が付着しないようにします(図12)。</li>
	<li>歯付き鉗子で胃をつかみ、組織鉗子で膵臓の上端をつかみます。5倍の倍率で、膵臓を胃からそっとからかいます(図13)。 注:きれいに剥がれない場合は、残りの膵臓組織が見え、断片的に摘み取ることができます。あるいは、虹彩切除術のハサミや組織鉗子を使用して、膵臓を系統的に剥離することもできます。</li>
	<li>図14Aを参照して、膀胱を特定し、それを取り外し、総排泄腔にできるだけ近づけます。このティッシュを捨ててください。</li>
	<li>図14Bを参照して、大腸を特定し、それをぴんと張って、大腸を総排泄腔にできるだけ近づけて切断します。消化管全体を取り除いて廃棄し、脾臓に付着している腹膜を切断します。太った体は完全にアクセス可能になります。</li>
	<li>脂肪体がそれぞれの側に来るように、脂肪体をからかいます。脂肪体が腹膜につながっている腎臓の上の領域が見えます。左の脂肪体の基部(視聴者の右側)をつかみ、はさみを使用して腹膜から切り取り、腎臓が損傷しないように小さなマージンを残します(図15)。</li>
	<li>残った脂肪体を取り出して捨てます。ペアになった腎臓が完全に見えるようになります。</li>
	<li>雌のカエルまたは明確な痕跡卵管を持つ雄では、卵管をつかんで腎臓と総排泄腔から引き離します(図16)。卵管が総排泄腔と出会う場所で卵管を切断し、腎臓から引き離し続け、明らかな腹膜の付着物が明らかになったら切断します。このティッシュを捨ててください。</li>
	<li>残りの卵管でこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>腎臓はまだ透明な腹膜(後腹膜)で覆われています10。鉗子を使用して腎臓をつかみ、腹膜の下端を切断します。</li>
	<li>腎臓を体腔から持ち上げ、はさみを使用して、腎臓に損傷を与えることなく、腎臓にできるだけ近い腹膜を切断します(図17)。</li>
	<li>5倍の拡大で、余分な腹膜と他の残りの組織(脂肪体、脾臓)を切り取ります。カエルが雌の場合は、残っている卵巣組織がすべて除去されていることを確認してください(図18)。カエルがオスの場合は、精巣を慎重に取り外し、拡大しないと見えない可能性のある痕跡卵管を確認します(図19)。</li>
	<li>動物からピンを取り外し、腹側にひっくり返して、動物の手足を再度ピンで固定します。</li>
	<li>サンプリングする後肢を選択し、その肢の足を固定します。</li>
	<li>腓腹筋/脛骨腓骨の上からアーモンド型の皮膚のフラップを取り除きます(図20)。</li>
</ol>

成体 Xenopus 器官のための標準化された解剖およびサンプリングプロトコル

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

このプロトコルは鮮度を最大限に高めることを目的としているため、サンプルによっては望ましくない組織が含まれている場合があります。たとえば、肝膵管と一部の腸間膜は膵臓でサンプリングされ、一部の腹膜組織、副腎、および尿管は常に対になった腎臓でサンプリングされます。 鮮度が問題にならない場合は、修正された技術を使用してより正確なサンプリングを実現できます。</p...

「成体のXenopusのデジタル解剖」は利用可能ですが1、成体のXenopusの複製可能な臓器および組織サンプリングは、他の成体モデル(例:マウス2,3,4)に利用可能な詳細な指示がなければ依然として困難です。この記事は、現在幼虫に利用可能なものと同様に、成虫Xenopusの正確で複製可能な臓器サンプリングのための明確なガイダンスを提供することを目的としています5。完成のしやすさに重点が置かれ、最大限の鮮度を維持し、すべてのユーザーがプロトコルにアクセスできるようにします。
Rana sp.6の徹底的な解剖ガイドや、他の無尾類7の教室解剖ガイドは多数ありますが、Xenopusの解剖とサンプリングのガイドは現在利用できません。サンプリングの実践や両生類の解剖学に詳しくない人のために説明すると、Xenopusと他の無尾類とのわずかな違いにより、これらのリソースは複製可能な組織サンプリングには最適ではありません。
多くの貴重な組織は含まれておらず、現在のガイドには廃棄されています。これは、組織の鮮度を確保するためです。6つのサンプルは、ユーザーの経験やスキルレベルに関係なく、心臓が鼓動し始めてから1時間以内にこれらの組織を収集できることを保証するのに十分な制限があります。他の多くの組織を収集するためのより高度で詳細なガイドは、個別のコンパニオンペーパーとして準備中です。
経験の浅いユーザーの場合、このプロトコルは、交換が困難な動物(トランスジェニック、高齢の動物など)をサンプリングする前に、実験以外の理由で安楽死させられる動物で最初に試みることを常にお勧めします。理想的には、サンプリングされたすべての動物が健康であり、雌の場合は過去2週間に排卵していないことが望ましい。

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy Scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for Dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus は、100年以上にわたり、脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。胚の実験的分析および解剖技術は十分に文書化されていますが、成体の Xenopus の構造と器官の説明は、成体と協力するための技術とともに、定量的プロテオミクスやシングルセルトランスクリプトミクスなどの最新のアプローチの要件を考慮に入れて更新されていません。細胞型および遺伝子中心の視点では、胚期と成体組織での観察を対照的に行う必要があります。幼虫の臓器は、幼虫から成虫への移行全体にわたって、特に大規模な変態リモデリング中に、全体的な構造、形態、および解剖学的位置に大きな変化を遂げます。臓器の同定と解剖のための強固な基準を確立することは、異なる研究所で実施された研究から得られたデータセットの一貫性を確保するために重要です。現在のプロトコルでは、成人の Xenopusの6つの臓器を特定し、心臓の解剖とサンプリングの方法を実証しています 心臓室、肝臓、脂肪体、膵臓、対になった腎臓、および成人 のXenopusの皮膚。保存方法にもよりますが、解剖した臓器は、定量的プロテオミクス、単一細胞/核トランスクリプトミクス、 in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学などに使用できます。このプロトコルは、組織サンプリングを標準化し、成体臓器系のマルチラボ調査を促進することを目的としています。

図1から図20を利用し、このプロトコルのすべてのステップに従うことにより、心室、肝臓の左葉、膵臓、左脂肪体、対になった腎臓、および皮膚のフラップを安楽死から1時間以内にきれいに切除しました。この時間内に、図21に示すように、サンプルが現れるようにサンプルをすすぎ、トリミングします。
<p class="jove_conte...

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著者スポットライト:プロテオミクスおよび免疫化学研究における組織サンプリングの標準化(英語)

この記事では、成人 のXenopus で迅速かつ簡単にアクセスできる6つの重要で多様な臓器(心室、肝葉、膵臓、脂肪体、対になった腎臓、皮膚)をサンプリングするためのガイドを提供します。

成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

この研究に先立ち、私は迅速な両生類灌流のためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、プロテオミクスや免疫化学など、組織に過剰な量の血液が存在することが望ましくない研究のためにサンプリングする前に利用する必要があります。利用可能な多くの図やその他の補助がありますが、現在のところ、成体の異種から組織を迅速かつ確実に解剖する方法についての包括的なガイドはありません。標準化されたサンプリング技術により、ラボ間で組織を簡単に共有できるようになることを願っています。これは、バイオセキュリティの懸念や輸送上の制約により動物の輸出入が不可能な状況で特に有利です。

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Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

844 ビュー.  Harvard Medical School. この研究に先立ち、私は迅速な両生類灌流のためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、プロテオミクスや免疫化学など、組織に過剰な量の血液が存在することが望ましくない研究のためにサンプリングする前に利用する必要があります。利用可能な多くの図やその他の補助がありますが、現在のところ、成体の異種から組織を迅速かつ確実に解剖する方法?...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

発生生物学

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

化学

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

神経科学

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

の用法<em&gt; ex vivoで</em&gt;全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

生物学

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

成人 アフリカツメガ エル心臓の頂端切除モデル

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

医学

トランスクリプトミクスとプロテオミクスのためのアフリカツメガエルの血液灌流

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol in Xenopus, aimed at a consistent and drastic reduction of blood within all tissues, is defined. Perfusion is carried out by inserting a needle directly into the ventricle of the heart and pumping heparinized phosphate-buffered saline (PBS) through the vascular system. The procedure can be completed in approximately 10 min per animal. The blood is dominated by a few highly abundant proteins and cell types, creating numerous issues as these proteins mask most other molecules and cell types of interest. The reproducible characterization of adult Xenopus tissues with quantitative proteomics and single-cell transcriptomics will benefit from applying this protocol prior to organ sampling. The protocols for tissue sampling are defined in companion papers. These procedures are aimed at the standardization of practices across Xenopus of different sex, age, and health status, specifically X. laevis and X. tropicalis.

著者スポットライト:Xenopusにおける効果的な迅速血液灌流  

Presented here is an effective rapid blood perfusion protocol to prepare tissue samples from African clawed frogs for transcriptomics and proteomics studies.

アフリカツメガエルにおける効果的な急速な血液灌流

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

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要約

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幹細胞様

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック

の胚性血管新生の可視化と定量分析

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析法

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録

でプライマリ神経発生を評価します

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

の用法

成人アフリカツメガエル心臓の頂端切除モデル

アフリカツメガエルにおける効果的な急速な血液灌流

成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

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幹細胞様

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック

の胚性血管新生の可視化と定量分析

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録

でプライマリ神経発生を評価します

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

の用法

成人 アフリカツメガ エル心臓の頂端切除モデル

アフリカツメガエルにおける効果的な急速な血液灌流

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロプローブキャピラリー電気泳動質量分析法

成人アフリカツメガエル心臓の頂端切除モデル