Este trabajo fue financiado por el R24OD031956 de subvenciones OD de los NIH. Agradecemos a Samantha Jalbert, Jill Ralston y Cora Anderson por su asistencia y apoyo, así como a nuestro editor y revisores anónimos por sus útiles comentarios

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas y reglamentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IS 00001365_3) de la Escuela de Medicina de Harvard. Se muestran los resultados representativos tanto para un macho albino maduro perfundido como para un macho albino maduro no perfundido, Xenopus laevis.
1. Preparación experimental 
NOTA: Si se sigue el protocolode perfusión 8 antes de la toma de muestras, vaya al paso 2.2.
<ol><li>Asegurarse de que la institución de investigación ha aprobado la técnica de eutanasia descrita en este protocolo.</li>
	<li>Prepare una solución de 5 g/L de MS-222 (metanosulfonato de tricaína) y 5 g/L de bicarbonato de sodio (ver Tabla de Materiales). El volumen debe ser mayor que el volumen requerido para cubrir completamente a los animales que se van a sacrificar. Verifique el pH para asegurarse de que esté ≥7.</li>
	<li>Realizar la eutanasia primaria colocando el Xenopus en la solución de eutanasia; El animal permanecerá sumergido un total de 1 h.</li>
	<li>Configure la estación de disección de modo que inmediatamente después de la toma de muestras, todos los tejidos puedan enjuagarse con PBS frío o PBS9 de 0,7x (dependiendo de las necesidades experimentales), revisarse y recortarse bajo una luz de aumento de 5x (o más). Esta estación también debe permitir al usuario reemplazar todas las pinzas y tijeras o limpiarlas entre usos.</li>
	<li>Una vez que la rana ha estado en la solución durante 1 h, se ha completado la eutanasia primaria. Retire la rana y verifique la pérdida de respuesta al dolor realizando un pellizco en el pie.</li>
	<li>Registre los detalles apropiados para el animal, como la especie, la cepa, el sexo, la edad y el estado de salud, así como si fue perfundido. Pesa al Xenopus y toma cualquier medida adicional, como la longitud del hocico.</li>
	<li>Coloque la rana boca arriba y sujete las extremidades proximales al cuerpo (Figura 1).</li>
	<li>Con unas tijeras de disección, corta la piel, sube por la línea media y luego lateralmente, haciendo dos solapas.</li>
	<li>Refiriéndose a la Figura 2, identifique la línea alba y use fórceps para agarrarla y alejarla de la cavidad celómica. Corta la musculatura con cuidado con unas tijeras. Haz dos solapas fuera de la pared de la cavidad. Corta o sujeta con alfileres todas las solapas para que no estorben.</li>
	<li>Identifica el corazón que seguirá latiendo. Use tijeras de disección para reducir los huesos coracoideos (Figura 2) para obtener un mejor acceso al corazón. NOTA: Si el corazón ha dejado de latir antes de la toma de muestras, debe tenerse en cuenta que la frescura de la muestra se ha visto comprometida.</li>
</ol>2. Muestreo
NOTA: Si el animal ha sido perfundido, vaya al paso 2.2.
<ol><li>Identifique el pericardio delgado y tire de él con pinzas de tejido (Figura 3).</li>
	<li>Con la punta de las tijeras de iridectomía, perfore suavemente el pericardio, teniendo cuidado de no cortar los tejidos subyacentes. Pela el pericardio lejos de las 3 cavidades del corazón.</li>
	<li>Use fórceps para agarrar el ventrículo por el ápice, identificar dónde se une a las aurículas y al tronco arterial (Figura 4) y cortarlo por debajo de estas inserciones (Figura 5). Si es necesario, recorte el ventrículo de modo que no se vean tejidos de las aurículas o del tronco arterial, y el tejido valvular de color claro seguirá siendo visible dentro del ventrículo. NOTA: En animales no perfundidos, la extirpación del ventrículo puede calificar como eutanasia secundaria.</li>
	<li>Los 3 lóbulos del hígado serán visibles (Figura 6 y Figura 7). Agarre el labio del lóbulo izquierdo (a la derecha del espectador) y levántelo suavemente para que los conductos hepáticos y císticos sean visibles (Figura 8). Tome muestras del 1/3 inferior del lóbulo debajo de estos accesorios (Figura 9).</li>
	<li>Para obtener un mejor acceso a los tejidos de una rana hembra, es útil extirpar el ovario. Identifica el ovario que está envuelto en una capa de peritoneo visceral llamada epitelio germinal. Mueva suavemente los lóbulos hasta que estén de sus lados respectivos para hacer visible el área de inserción (Figura 10). Estas uniones son directamente ventrales al riñón pareado.</li>
	<li>Con unas tijeras, extraiga los ovarios lo más cerca posible de los riñones sin dañarlos (Figura 11).</li>
	<li>Inspeccione el lóbulo medial (también llamado lóbulo anterior) del hígado y observe cómo se conecta con el estómago y el duodeno a través del mesenterio y el conducto hepatopancreático (también llamado conducto biliar común) (Figura 6, Figura 7 y Figura 8).</li>
	<li>Cortar el mesenterio, el ligamento hepatoduodenal con unas tijeras de iridectomía, así como el conducto hepatopancreático donde se une con el duodeno. Cortar la conexión del páncreas y el conducto hepatopancreático con el lóbulo medial del hígado para que no quede tejido hepático oscuro adherido (figura 12).</li>
	<li>Agarre el estómago con pinzas dentadas y el extremo superior del páncreas con pinzas de tejido. Con un aumento de 5x, separe suavemente el páncreas del estómago (Figura 13). NOTA: Si no se desprende limpiamente, el tejido pancreático restante será visible y se puede cortar en fragmentos. Alternativamente, el páncreas se puede separar metódicamente con tijeras de iridectomía y pinzas de tejido.</li>
	<li>Refiriéndose a la Figura 14A, identifique la vejiga urinaria y retírela, cortando lo más cerca posible de la cloaca. Deseche este pañuelo.</li>
	<li>Refiriéndose a la Figura 14B, identifique el intestino grueso y tire de él para cortar el intestino grueso lo más cerca posible de la cloaca. Retire y deseche todo el canal alimentario, cortando el peritoneo donde se une al bazo. Los cuerpos gordos ahora serán completamente accesibles.</li>
	<li>Separa los cuerpos gordos para que estén de lado respectivo. El área sobre el riñón, donde el cuerpo graso se conecta con el peritoneo, será visible. Agarre la base del cuerpo graso izquierdo (a la derecha del espectador) y utilice unas tijeras para cortarlo del peritoneo, dejando un pequeño margen para que el riñón no se dañe (Figura 15).</li>
	<li>Retire y deseche el cuerpo graso restante. Los riñones emparejados ahora serán completamente visibles.</li>
	<li>En ranas hembras o machos con oviductos vestigiales distintos, agarre un oviducto y retírelo del riñón y la cloaca (Figura 16). Corte el oviducto donde se une con la cloaca y continúe separándolo del riñón, cortando cualquier unión peritoneal clara a medida que se haga evidente. Deseche este pañuelo.</li>
	<li>Repita este proceso con el oviducto restante.</li>
	<li>Los riñones todavía están cubiertos con un peritoneo transparente (retroperitoneal)10. Use fórceps para agarrar los riñones y cortar el peritoneo en su extremo inferior.</li>
	<li>Levantar los riñones fuera de la cavidad celómica, usando tijeras para cortar el peritoneo lo más cerca posible de los riñones sin dañarlos (Figura 17).</li>
	<li>Con un aumento de 5x, corte el exceso de peritoneo y cualquier otro tejido restante (cuerpos grasos, bazo). Si la rana es hembra, asegúrese de que se haya eliminado cualquier resto de tejido ovárico (Figura 18). Si la rana es macho, retire con cuidado el testículo y verifique si hay un oviducto vestigial, que puede no ser visible sin aumento (Figura 19).</li>
	<li>Retira los alfileres del animal, colócalo sobre su ventrum y vuelve a sujetar las extremidades del animal.</li>
	<li>Seleccione cualquiera de las extremidades traseras para tomar muestras y sujetar el pie de esa extremidad.</li>
	<li>Retire un colgajo de piel en forma de almendra sobre el gastrocnemio/tibioperoné (Figura 20).</li>
</ol>

Protocolo estandarizado de disección y muestreo para órganos adultos de Xenopus

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Como este protocolo tiene como objetivo maximizar la frescura, algunas muestras pueden incluir tejidos no deseados. Por ejemplo, el conducto hepatopancreático y parte del mesenterio se muestrean con el páncreas, y parte del tejido peritoneal, las glándulas suprarrenales y los uréteres siempre se muestrearán con los riñones emparejados.  Si la frescura no es una preocupación, se puede lograr un muestreo más preciso utilizando técnicas modificadas.
La apariencia y ubicación de los ór...

Aunque la "disección digital" de Xenopus adultoestá disponible 1, el muestreo replicable de órganos y tejidos de Xenopus adulto sigue siendo un desafío sin las instrucciones detalladas disponibles para otros modelos adultos (por ejemplo, ratones 2,3,4). Este artículo tiene como objetivo proporcionar una guía clara para el muestreo preciso y replicable de órganos de Xenopus adulto similar a lo que está disponible actualmente para sus larvas5. Se hace hincapié en la facilidad de finalización para mantener la máxima frescura y hacer que el protocolo sea accesible para todos los usuarios.
Aunque existe una guía de disección completa para Rana sp.6, así como numerosas guías de disección en el aula para otros anuros7, actualmente no se dispone de una guía de disección y muestreo de Xenopus. Para aquellos que no están familiarizados con las prácticas de muestreo o la anatomía de los anfibios, las pequeñas diferencias entre Xenopus y otros anuros hacen que estos recursos no sean óptimos para el muestreo de tejidos replicables.
Muchos tejidos valiosos no están incluidos e incluso se descartan en la presente guía; Esto es para garantizar la frescura de los tejidos. Seis muestras son lo suficientemente limitadas como para garantizar que estos tejidos se puedan recolectar en menos de una hora después de que el corazón comience a latir, independientemente de la experiencia o el nivel de habilidad del usuario. Se están preparando guías más avanzadas y detalladas para recolectar muchos otros tejidos como documentos complementarios separados.
Para los usuarios menos experimentados, siempre se recomienda que este protocolo se pruebe primero en los animales que se sacrifican por razones distintas a la experimentación antes de tomar muestras de cualquier animal que sea difícil de reemplazar (es decir, transgénicos, animales de edad avanzada, etcétera). Lo ideal es que todos los animales muestreados estén sanos y, si son hembras, no hayan ovulado en las últimas dos semanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus ha sido un poderoso organismo modelo para comprender el desarrollo y las enfermedades de los vertebrados durante más de cien años. Si bien las técnicas experimentales de análisis y disección del embrión han sido bien documentadas, las descripciones de las estructuras y órganos de Xenopus adultos, junto con las técnicas para trabajar con adultos, no se han actualizado para tener en cuenta los requisitos de enfoques modernos como la proteómica cuantitativa y la transcriptómica de una sola célula. Las perspectivas centradas en el tipo de célula y en los genes requieren observaciones contrastantes en las etapas embrionarias con las de los tejidos adultos. Los órganos de la larva experimentan cambios significativos en su estructura general, morfología y ubicación anatómica a lo largo de la transición de larva a adulto, sobre todo durante la remodelación masiva de la metamorfosis. Establecer estándares sólidos para la identificación y disección de órganos es crucial para garantizar que los conjuntos de datos resultantes de los estudios realizados en diferentes laboratorios puedan ser coherentes. El presente protocolo identifica seis de los órganos en el Xenopus adulto, demostrando métodos para la disección y la toma de muestras del ventrículo cardíaco, el hígado, el cuerpo graso, el páncreas, el riñón emparejado y la piel del Xenopus adulto. Dependiendo de los métodos de preservación, los órganos disecados se pueden utilizar para proteómica cuantitativa, transcriptómica de células individuales/núcleos, hibridación in situ , inmunohistoquímica, histología, etcétera. Este protocolo tiene como objetivo estandarizar el muestreo de tejidos y facilitar las investigaciones multilaboratorio de los sistemas de órganos adultos.

Al utilizar la Figura 1 a la Figura 20 y seguir todos los pasos de este protocolo, el ventrículo cardíaco, el lóbulo izquierdo del hígado, el páncreas, los cuerpos grasos izquierdos, los riñones emparejados y un colgajo de piel se extirparon limpiamente dentro de una hora después de la eutanasia. Dentro de este tiempo, las muestras se enjuagan y recortan para que aparezcan, como se muestra en la Figura 21.
<p class="jove_...

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Autor destacado: Estandarización del muestreo de tejidos en la investigación en proteómica e inmunoquímica

Este artículo presenta una guía para tomar muestras de seis órganos significativos y diversos en Xenopus adultos a los que se puede acceder rápida y fácilmente: el ventrículo cardíaco, el lóbulo hepático, el páncreas, los cuerpos grasos, los riñones emparejados y la piel.

Técnicas para la toma rápida de muestras de seis órganos cruciales en Xenopus adulto

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Antes de este trabajo, desarrollé un protocolo para la perfusión rápida de anfibios. Este protocolo debe utilizarse antes de la toma de muestras para investigaciones como la proteómica y la inmunoquímica, donde la presencia de cantidades excesivas de sangre en los tejidos no es deseable. Aunque hay muchos diagramas y otras ayudas disponibles, actualmente no existen guías completas sobre cómo diseccionar tejidos de xenopus adultos de manera rápida y confiable.Esperamos que contar con técnicas de muestreo estandarizadas permita a los laboratorios compartir tejidos fácilmente. Esto es especialmente ventajoso en situaciones en las que la importación y exportación de animales no es posible debido a preocupaciones de bioseguridad o limitaciones de envío.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

822 vistas.  Harvard Medical School. Antes de este trabajo, desarrollé un protocolo para la perfusión rápida de anfibios. Este protocolo debe utilizarse antes de la toma de muestras para investigaciones como la proteómica y la inmunoquímica, donde la presencia de cantidades excesivas de sangre en los tejidos no es deseable. Aunque hay muchos diagramas y otras ayudas disponibles, actualmente no existen guías completas sobre cómo diseccionar tejidos de xenopus adultos de manera rápida y confiable.Esperamos que conta...

Video: Autor destacado: Estandarización del muestreo de tejidos en la investigación en proteómica e inmunoquímica

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Investigación

Biología

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Técnicas de muestreo de sangre no terminal en los conejillos de Indias

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Técnicas para la toma rápida de muestras de seis órganos cruciales en Xenopus adulto

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Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Técnicas de Imagen Ca^{2 +} Señalización en el esperma humano

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos

Gavage adultos de pez cebra

Los trasplantes faciales en

La

La reconstitución de la degradación de β-catenina en

Técnicas de muestreo de sangre no terminal en los conejillos de Indias

La cuantificación de fenotipos en Orofacial

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