이 연구는 NIH의 OD 보조금 R24OD031956의 지원을 받았습니다. 도움과 지원을 아끼지 않은 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Cora Anderson과 편집자 및 익명의 피어 리뷰어에게 유용한 피드백을 주셔서 감사합니다

모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행되었습니다. 대표적인 결과는 관류된 및 관류되지 않은 성숙한 알비노 수컷 Xenopus laevis 모두에 대해 표시됩니다.
1. 실험 준비 
알림: 샘플링 전에 관류 프로토콜8 을 따르는 경우 2.2단계로 건너뜁니다.
<ol><li>연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 기술을 승인했는지 확인하십시오.</li>
	<li>5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 그 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. pH가 ≥7인지 확인하십시오.</li>
	<li>Xenopus를 안락사 용액에 넣어 1 차 안락사를 수행합니다. 동물은 총 1시간 동안 물속에 있습니다.</li>
	<li>샘플링 직후 모든 조직을 냉각 PBS 또는 0.7x PBS9 (실험 요구 사항에 따라 다름)로 헹구고 확인하고 5x(또는 그 이상) 배율 조명 아래에서 트리밍할 수 있도록 절개 스테이션을 설정합니다. 또한 이 스테이션은 사용자가 모든 집게와 가위를 교체하거나 사용 사이에 깨끗하게 닦을 수 있도록 해야 합니다.</li>
	<li>개구리가 1시간 동안 용액에 있으면 1차 안락사가 완료됩니다. 개구리를 제거하고 발 꼬집기를 실시하여 통증 반응의 소실을 확인하십시오.</li>
	<li>동물에 대한 종, 품종, 성별, 연령 및 건강 상태와 같은 적절한 세부 정보를 기록하고 관류되었는지 여부를 기록합니다. Xenopus 의 무게를 측정하고 길이와 같은 추가 측정을 수행합니다.</li>
	<li>개구리를 등에 눕히고 몸통에 근접한 팔다리를 고정합니다(그림 1).</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 피부를 뚫고 정중선을 따라 자른 다음 측면으로 두 개의 플랩을 만듭니다.</li>
	<li>그림 2를 참조하여 linea alba를 식별하고 겸자를 사용하여 잡고 coelomic cavity에서 빼냅니다. 가위를 사용하여 근육 조직을 조심스럽게 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만듭니다. 모든 플랩을 자르거나 핀으로 고정합니다.</li>
	<li>여전히 뛰고 있는 심장을 식별합니다. 절개 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 줄여 (그림 2) 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다. 알림: 샘플링 전에 심장 박동이 멈춘 경우 s의 신선도가 손상되었다는 점에 유의해야 합니다.</li>
</ol>2. 샘플링
알림: 동물이 관류된 경우 2.2단계로 건너뜁니다.
<ol><li>얇은 심낭을 확인하고 조직 겸자로 팽팽하게 당깁니다(그림 3).</li>
	<li>홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 심낭을 부드럽게 천공하고 아래 조직이 절단되지 않도록 주의합니다. 심장의 3개 방에서 심낭을 떼어냅니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 심실의 정점을 잡고 귓바퀴와 동맥 줄기에 부착되는 위치를 식별하고(그림 4), 이러한 부착물 아래를 자릅니다(그림 5). 필요한 경우 귓바퀴나 동맥줄기의 조직이 보이지 않도록 심실을 다듬고 심실 내부에서 밝은 색의 판막 조직이 계속 보이도록 합니다. 참고: 관류되지 않은 동물의 경우, 심실을 제거하는 것은 2차 안락사에 해당할 수 있습니다.</li>
	<li>간의 3개의 엽이 보일 것입니다(그림 6 및 그림 7). 좌엽의 입술(관찰자의 오른쪽)을 잡고 간관과 낭포관이 보이도록 부드럽게 들어 올립니다(그림 8). 이 부착물 아래에 있는 로브의 아래쪽 1/3을 샘플링합니다(그림 9).</li>
	<li>암컷 개구리의 조직에 더 잘 접근하려면 난소를 제거하는 것이 도움이 됩니다. 생식 상피(germinal epithelium)라고 하는 내장 복막층으로 둘러싸인 난소를 식별합니다. 부착 영역이 보이도록 로브가 각각의 측면에 올 때까지 로브를 부드럽게 움직입니다(그림 10). 이러한 부착물은 쌍을 이루는 신장에 직접 복부에 있습니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 난소를 손상시키지 않고 가능한 한 신장에 가깝게 제거합니다(그림 11).</li>
	<li>간의 내엽(전엽이라고도 함)을 검사하고 장간막과 간췌관(총담관이라고도 함)을 통해 위와 십이지장과 어떻게 연결되어 있는지 확인합니다(그림 6, 그림 7 및 그림 8).</li>
	<li>장간막, 간십이지장 인대를 홍채 절제술 가위를 사용하여 절단하고 십이지장과 만나는 간췌관을 절단합니다. 췌장과 간췌관과 간의 내엽 연결을 절단하여 어두운 간 조직이 부착되지 않도록 합니다(그림 12).</li>
	<li>톱니가 있는 집게로 배를 잡고 조직 집게로 췌장의 위쪽 끝을 잡습니다. 5배 확대하여 위에서 췌장을 부드럽게 떼어냅니다(그림 13). 알림: 깨끗하게 제거되지 않으면 남아 있는 췌장 조직이 보이고 조각으로 벗겨질 수 있습니다. 또는 홍채 절제술 가위와 조직 집게를 사용하여 췌장을 체계적으로 분리할 수 있습니다.</li>
	<li>그림 14A를 참조하여 방광을 식별하고 제거하고 가능한 한 배설물에 가깝게 절단합니다. 이 티슈를 버리십시오.</li>
	<li>그림 14B를 참조하여 대장을 식별하고 팽팽하게 당겨 대장을 가능한 한 배설물에 가깝게 절단합니다. 소화관 전체를 제거하고 버리고 비장에 부착되는 복막을 절단합니다. 뚱뚱한 몸은 이제 완전히 접근 할 수 있습니다.</li>
	<li>뚱뚱한 몸을 떼어내어 각자의 편에 서도록 합니다. 지방체가 복막과 연결되는 신장 위 부위가 보일 것입니다. 왼쪽 뚱뚱한 몸의 기저부(관찰자의 오른쪽)를 잡고 가위를 사용하여 복막에서 잘라내고 신장이 손상되지 않도록 작은 여백을 남깁니다(그림 15).</li>
	<li>남은 뚱뚱한 몸을 제거하고 버립니다. 이제 한 쌍의 신장이 완전히 보일 것입니다.</li>
	<li>뚜렷한 흔적 난관이 있는 암컷 개구리 또는 수컷의 경우 난관을 잡고 신장과 배설물에서 당겨 빼냅니다(그림 16). 배설물과 만나는 부분의 난관을 자르고 신장에서 계속 잡아당겨 투명한 복막 부착물이 눈에 띄면 잘라냅니다. 이 티슈를 버리십시오.</li>
	<li>나머지 난관에 대해 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>콩팥은 여전히 투명한 복막(후복막)으로 덮여 있습니다10. 겸자를 사용하여 신장을 잡고 아래쪽 끝부분의 복막을 절단합니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 복막을 손상시키지 않고 신장에 최대한 가깝게 절단하여 콩팥강에서 콩팥을 들어 올립니다(그림 17).</li>
	<li>5배 확대하여 과도한 복막과 기타 남아 있는 조직(지방체, 비장)을 잘라냅니다. 개구리가 암컷인 경우 남아 있는 난소 조직을 제거해야 합니다(그림 18). 개구리가 수컷인 경우 고환을 조심스럽게 제거하고 확대하지 않으면 보이지 않을 수 있는 흔적 난관이 있는지 확인합니다(그림 19).</li>
	<li>동물의 핀을 제거하고 복부에 뒤집은 다음 동물의 팔다리를 다시 핀합니다.</li>
	<li>샘플링할 뒷다리 중 하나를 선택하고 해당 팔다리의 발을 고정합니다.</li>
	<li>비복근/경골 비골 위에서 아몬드 모양의 피부 플랩을 제거합니다(그림 20).</li>
</ol>

성인 Xenopus 장기에 대한 표준화된 해부 및 샘플링 프로토콜

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 신선도를 극대화하는 것을 목표로 하기 때문에 일부 샘플에는 원치 않는 조직이 포함될 수 있습니다. 예를 들어, 간췌관과 일부 장간막은 췌장으로 샘플링되며, 일부 복막 조직, 부신 및 요관은 항상 쌍을 이루는 신장으로 샘플링됩니다.  신선도가 문제가 되지 않는 경우 수정된 기술을 사용하여 보다 정확한 샘플링을 얻을 수 있습니다.
장기의 모양과 위치는 <...

"성체 Xenopus"의 "디지털 해부"가 가능하지만1, 다른 성체 모델(예: 생쥐 2,3,4)에 대한 자세한 지침 없이는 성체 Xenopus의 복제 가능한 장기 및 조직 샘플링이 여전히 어렵습니다. 이 기사는 현재 유충에 대해 사용할 수 있는 것과 유사한 성인 Xenopus의 정확하고 복제 가능한 장기 샘플링을 위한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다5. 최대한의 신선도를 유지하고 모든 사용자가 프로토콜에 액세스할 수 있도록 완료의 용이성에 중점을 둡니다.
Rana sp.6에 대한 철저한 해부 가이드와 다른 anurans7에 대한 수많은 교실 해부 가이드가 있지만 현재 Xenopus 해부 및 샘플링 가이드는 사용할 수 없습니다. 샘플링 방법이나 양서류 해부학에 익숙하지 않은 사람들을 위해 Xenopus와 다른 anurans 사이의 작은 차이로 인해 이러한 리소스는 복제 가능한 조직 샘플링에 적합하지 않습니다.
많은 귀중한 조직이 포함되어 있지 않으며 현재 가이드에 버려져 있습니다. 이는 조직의 신선도를 보장하기 위한 것입니다. 6개의 샘플은 사용자의 경험이나 기술 수준에 관계없이 심장이 뛰기 시작한 후 한 시간 이내에 이러한 조직을 수집할 수 있을 만큼 충분히 제한되어 있습니다. 다른 많은 조직을 수집하기 위한 보다 고급스럽고 상세한 가이드는 별도의 동반 논문으로 준비 중입니다.
경험이 적은 사용자의 경우, 대체하기 어려운 동물(예: 형질전환, 고령 동물 등)을 샘플링하기 전에 실험 이외의 이유로 안락사되는 동물에 대해 이 프로토콜을 먼저 시도하는 것이 항상 권장됩니다. 이상적으로는 표본을 채취한 모든 동물이 건강해야 하며, 암컷인 경우 지난 2주 동안 배란이 되지 않았을 것입니다.

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy Scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for Dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus 는 100년 이상 동안 척추동물의 발달과 질병을 이해하기 위한 강력한 모델 유기체였습니다. 배아의 실험적 분석 및 해부 기술은 잘 문서화되어 있지만, 성인 Xenopus 구조 및 장기에 대한 설명과 성인과 함께 작업하는 기술은 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학과 같은 현대적인 접근 방식의 요구 사항을 고려하도록 업데이트되지 않았습니다. 세포 유형 및 유전자 중심적 관점은 배아 단계의 관찰과 성인 조직의 관찰을 대조하는 관찰을 필요로 합니다. 유충의 장기는 유충에서 성충으로의 전환을 따라 전체 구조, 형태 및 해부학적 위치에서 상당한 변화를 겪으며, 특히 대규모 변태 리모델링 중에 큰 변화를 겪습니다. 장기 식별 및 해부에 대한 강력한 표준을 수립하는 것은 서로 다른 실험실에서 수행된 연구의 결과로 얻은 데이터 세트가 일관될 수 있도록 하는 데 중요합니다. 본 프로토콜은 성인 Xenopus의 6 개 장기를 식별하여 성인 Xenopus의 심실, 간, 지방체, 췌장, 쌍 신장 및 피부의 절개 및 샘플링 방법을 보여줍니다. 보존 방법에 따라 절개된 장기는 정량적 단백질체학, 단일세포/핵 전사체학, in situ hybridization, 면역조직화학, 조직학 등에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직 샘플링을 표준화하고 성인 장기 시스템에 대한 다중 실험실 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다.

그림 1에서 그림 20을 활용하고 이 프로토콜의 모든 단계를 따름으로써, 심실, 간의 좌엽, 췌장, 좌측 지방체, 한 쌍의 신장 및 피부 피판이 안락사 후 한 시간 이내에 깨끗하게 절제되었습니다. 이 시간 내에 샘플은 그림 21과 같이 나타나도록 헹구고 다듬습니다.
<img alt="Figure 1"...

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저자 스포트라이트: 단백질체학 및 면역화학 연구에서 조직 샘플링 표준화

이 기사는 빠르고 쉽게 접근할 수 있는 성인 Xenopus 의 6가지 중요하고 다양한 장기(심실, 간엽, 췌장, 지방체, 쌍을 이루는 신장 및 피부)를 샘플링하기 위한 가이드를 제공합니다.

성인 Xenopus에서 6개의 중요한 장기를 빠르게 샘플링하는 기술

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

이 작업에 앞서, 저는 신속한 양서류 관류를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 조직에 과도한 양의 혈액이 존재하는 것이 바람직하지 않은 단백질체학 및 면역화학과 같은 연구를 위해 샘플링하기 전에 사용해야 합니다. 많은 다이어그램과 기타 보조 도구를 사용할 수 있지만 현재 성인 이종이포에서 조직을 빠르고 안정적으로 절개하는 방법에 대한 포괄적인 가이드는 없습니다.우리는 표준화된 샘플링 기술을 통해 실험실에서 조직을 쉽게 공유할 수 있기를 바랍니다. 이는 생물 보안 문제나 운송 제약으로 인해 동물을 수입 및 수출할 수 없는 상황에서 특히 유리합니다.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

830 조회수.  Harvard Medical School. 이 작업에 앞서, 저는 신속한 양서류 관류를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 조직에 과도한 양의 혈액이 존재하는 것이 바람직하지 않은 단백질체학 및 면역화학과 같은 연구를 위해 샘플링하기 전에 사용해야 합니다. 많은 다이어그램과 기타 보조 도구를 사용할 수 있지만 현재 성인 이종이포에서 조직을 빠르고 안정적으로 절개하는 방법에 대한 포괄적인 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 단백질체학 및 면역화학 연구에서 조직 샘플링 표준화

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

연구

발생학

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

화학

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경 근육 공동 문화

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

신경과학

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

생물학

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

성인 Xenopus tropicalis 심장의 정점 절제 모델

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

의학

Blood Perfusion in African Clawed Frogs for transcriptomics and proteomics(전사체학 및 단백질체학을 위한 아프리카 발톱 개구리의 혈액 관류)

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol in Xenopus, aimed at a consistent and drastic reduction of blood within all tissues, is defined. Perfusion is carried out by inserting a needle directly into the ventricle of the heart and pumping heparinized phosphate-buffered saline (PBS) through the vascular system. The procedure can be completed in approximately 10 min per animal. The blood is dominated by a few highly abundant proteins and cell types, creating numerous issues as these proteins mask most other molecules and cell types of interest. The reproducible characterization of adult Xenopus tissues with quantitative proteomics and single-cell transcriptomics will benefit from applying this protocol prior to organ sampling. The protocols for tissue sampling are defined in companion papers. These procedures are aimed at the standardization of practices across Xenopus of different sex, age, and health status, specifically X. laevis and X. tropicalis.

저자 스포트라이트: Xenopus의 효과적인 빠른 혈액 관류  

Presented here is an effective rapid blood perfusion protocol to prepare tissue samples from African clawed frogs for transcriptomics and proteomics studies.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

성인 Xenopus에서 6개의 중요한 장기를 빠르게 샘플링하는 기술

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줄기 세포처럼

개발에 미세 주입을 대상으로 기술

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서

에서 차 신경 발생 평가

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

사용

성인 Xenopus tropicalis 심장의 정점 절제 모델

Xenopus의 효과적인 급속 관류