Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione OD del NIH R24OD031956. Ringraziamo Samantha Jalbert, Jill Ralston e Cora Anderson per la loro assistenza e supporto, nonché il nostro editore e i revisori anonimi per il loro utile feedback

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le norme e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). I risultati rappresentativi sono mostrati sia per un maschio adulto di albino perfuso che non perfuso, Xenopus laevis.
1. Preparazione sperimentale 
NOTA: Se si segue il protocollo di perfusione8 prima del campionamento, andare al passaggio 2.2.
<ol><li>Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia descritta nel presente protocollo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 g/L di MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio (vedi Tabella dei materiali). Il volume deve essere superiore al volume necessario per coprire completamente gli animali da sopprimere. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia primaria inserendo lo Xenopus nella soluzione di eutanasia; L'animale rimarrà immerso per un totale di 1 h.</li>
	<li>Impostare la stazione di dissezione in modo che, subito dopo il prelievo, tutti i tessuti possano essere risciacquati in PBS refrigerato o PBS9 0,7x (a seconda delle esigenze sperimentali), controllati e tagliati sotto una luce con ingrandimento 5x (o superiore). Questa stazione deve anche consentire all'utente di sostituire tutte le pinze e le forbici o di pulirle tra un utilizzo e l'altro.</li>
	<li>Una volta che la rana è rimasta nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e controllare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzicamento del piede.</li>
	<li>Registrare i dettagli appropriati per l'animale, come specie, ceppo, sesso, età e stato di salute, nonché se è stato perfuso. Pesare lo Xenopus e prendere eventuali misure aggiuntive, come la lunghezza del muso e dello sfiato.</li>
	<li>Posiziona la rana sul dorso e fissa gli arti prossimali al corpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 2, identificare la linea alba e utilizzare una pinza per afferrarla ed estrarla dalla cavità celomica. Taglia con cura la muscolatura usando le forbici. Fai due lembi dalla parete della cavità. Taglia o appunta tutti i lembi in modo che non siano d'intralcio.</li>
	<li>Identifica il cuore che continuerà a battere. Utilizzare le forbici da dissezione per ridurre le ossa coracoidee (Figura 2) per ottenere un migliore accesso al cuore. NOTA: Se il cuore ha smesso di battere prima del prelievo, si noti che la freschezza del campione è stata compromessa.</li>
</ol>2. Campionamento
NOTA: Se l'animale è stato perfuso, andare al passaggio 2.2.
<ol><li>Identificare il pericardio sottile e tenderlo con una pinza per tessuti (Figura 3).</li>
	<li>Utilizzando la punta delle forbici per iridectomia, perforare delicatamente il pericardio, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle 3 camere del cuore.</li>
	<li>Usa una pinza per afferrare il ventricolo per l'apice, identifica il punto in cui si attacca ai padiglioni auricolari e al tronco arterioso (Figura 4) e taglialo sotto questi attacchi (Figura 5). Se necessario, tagliare il ventricolo in modo che non siano visibili tessuti dei padiglioni auricolari o del tronco arterioso e che il tessuto valvolare di colore chiaro sia ancora visibile all'interno del ventricolo. NOTA: Negli animali non perfusi, la rimozione del ventricolo può qualificarsi come eutanasia secondaria.</li>
	<li>I 3 lobi del fegato saranno visibili (Figura 6 e Figura 7). Afferrare il labbro del lobo sinistro (alla destra dell'osservatore) e sollevarlo delicatamente in modo che i dotti epatici e cistici siano visibili (Figura 8). Campionare il 1/3 inferiore del lobo sotto questi attacchi (Figura 9).</li>
	<li>Per ottenere un migliore accesso ai tessuti di una rana femmina, è utile rimuovere l'ovaio. Identificare l'ovaio che è avvolto in uno strato di peritoneo viscerale chiamato epitelio germinale. Spostare delicatamente i lobi fino a quando non si trovano sui rispettivi lati per rendere visibile l'area di attacco (Figura 10). Questi attacchi sono direttamente ventrali al rene accoppiato.</li>
	<li>Usando le forbici, rimuovere le ovaie il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 11).</li>
	<li>Ispezionare il lobo mediale (chiamato anche lobo anteriore) del fegato e notare come si collega allo stomaco e al duodeno attraverso il mesentere e il dotto epatopancreatico (chiamato anche dotto biliare comune) (Figura 6, Figura 7 e Figura 8).</li>
	<li>Recidere il mesentere, il legamento epatoduodenale usando le forbici per iridectomia e il dotto epatopancreatico dove incontra il duodeno. Recidere la connessione del pancreas e del dotto epatopancreatico al lobo mediale del fegato in modo che non si attacchi tessuto epatico scuro (Figura 12).</li>
	<li>Afferrare lo stomaco con una pinza dentata e l'estremità superiore del pancreas con una pinza per tessuti. Con un ingrandimento di 5x, stuzzicare delicatamente il pancreas dallo stomaco (Figura 13). NOTA: Se non viene via in modo pulito, il tessuto pancreatico rimanente sarà visibile e può essere rimosso in frammenti. In alternativa, il pancreas può essere metodicamente staccato utilizzando le forbici per iridectomia e le pinze per tessuti.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 14A, identificare la vescica urinaria e rimuoverla, tagliando il più vicino possibile alla cloaca. Scartare questo fazzoletto.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 14B, identificare l'intestino crasso e tenderlo per recidere l'intestino crasso il più vicino possibile alla cloaca. Rimuovere e scartare l'intero canale alimentare, recidendo il peritoneo dove si attacca alla milza. I corpi adiposi saranno ora completamente accessibili.</li>
	<li>Separa i corpi grassi in modo che siano sui rispettivi lati. L'area sopra il rene, dove il corpo adiposo si collega al peritoneo, sarà visibile. Afferra la base del corpo grasso sinistro (alla destra dell'osservatore) e usa le forbici per tagliarlo via dal peritoneo, lasciando un piccolo margine in modo che il rene non venga danneggiato (Figura 15).</li>
	<li>Rimuovere e scartare il corpo grasso rimasto. I reni accoppiati saranno ora completamente visibili.</li>
	<li>Nelle femmine di rana o nei maschi con ovidotti vestigiali distinti, afferrare un ovidotto e tirarlo via dal rene e dalla cloaca (Figura 16). Taglia l'ovidotto dove incontra la cloaca e continua a tirarla via dal rene, tagliando tutti gli attacchi peritoneali chiari non appena diventano evidenti. Scartare questo fazzoletto.</li>
	<li>Ripetere questo processo con l'ovidotto rimanente.</li>
	<li>I reni sono ancora ricoperti da un peritoneo chiaro (retroperitoneale)10. Usa il forcipe per afferrare i reni e recidere il peritoneo alla loro estremità inferiore.</li>
	<li>Sollevare i reni dalla cavità celomica, usando le forbici per recidere il peritoneo il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 17).</li>
	<li>Con un ingrandimento 5x, tagliare il peritoneo in eccesso e qualsiasi altro tessuto rimanente (corpi adiposi, milza). Se la rana è femmina, assicurarsi che il tessuto ovarico rimanente venga rimosso (Figura 18). Se la rana è maschio, rimuovere con cautela il testicolo e verificare la presenza di un ovidotto vestigiale, che potrebbe non essere visibile senza ingrandimento (Figura 19).</li>
	<li>Rimuovi i perni dall'animale, capovolgilo sul suo ventre e riappunta gli arti dell'animale.</li>
	<li>Seleziona uno degli arti posteriori da cui campionare e appunta il piede di quell'arto.</li>
	<li>Rimuovere un lembo di pelle a mandorla da sopra il gastrocnemio/tibiofibula (Figura 20).</li>
</ol>

Protocollo standardizzato di dissezione e campionamento per organi adulti di xenopus

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Poiché questo protocollo mira a massimizzare la freschezza, alcuni campioni possono includere tessuti indesiderati. Ad esempio, il dotto epatopancreatico e alcuni mesenteri vengono campionati con il pancreas e alcuni tessuti peritoneali, ghiandole surrenali e ureteri saranno sempre campionati con i reni accoppiati.  Se la freschezza non è un problema, è possibile ottenere un campionamento più preciso utilizzando tecniche modificate.
L'aspetto e la posizione degli organi sono comparabili t...

Sebbene sia disponibile la "dissezione digitale di Xenopus adulto" 1, il campionamento replicabile di organi e tessuti di Xenopus adulto rimane impegnativo senza le istruzioni dettagliate disponibili per altri modelli adulti (ad es. topi 2,3,4). Questo articolo mira a fornire una guida chiara per un campionamento accurato e replicabile degli organi di Xenopus adulti, simile a quello attualmente disponibile per le loro larve5. L'accento è posto sulla facilità di completamento per mantenere la massima freschezza e rendere il protocollo accessibile a tutti gli utenti.
Sebbene esista una guida completa alla dissezione per Rana sp.6, così come numerose guide alla dissezione in classe per altri anuri7, attualmente non è disponibile alcuna guida alla dissezione e al campionamento di Xenopus. Per coloro che non hanno familiarità con le pratiche di campionamento o l'anatomia degli anfibi, le piccole differenze tra Xenopus e altri anuri rendono queste risorse non ottimali per il campionamento di tessuti replicabili.
Molti tessuti preziosi non sono inclusi e sono addirittura scartati nella presente guida; Questo per garantire la freschezza dei tessuti. Sei campioni sono abbastanza limitati da garantire che questi tessuti possano essere raccolti in meno di un'ora dopo che il cuore inizia a battere, indipendentemente dall'esperienza o dal livello di abilità dell'utente. Guide più avanzate e dettagliate per la raccolta di molti altri tessuti sono in preparazione come documenti di accompagnamento separati.
Per gli utenti meno esperti, si raccomanda sempre di tentare questo protocollo sugli animali sottoposti a eutanasia per motivi diversi dalla sperimentazione prima di campionare qualsiasi animale difficile da sostituire (ad esempio, transgenici, animali di età avanzata, ecc.). Idealmente, tutti gli animali campionati saranno sani e, se femmine, non saranno stati ovulati nelle ultime due settimane.

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy Scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for Dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus è stato un potente organismo modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre cento anni. Mentre le tecniche sperimentali di analisi e dissezione dell'embrione sono state ben documentate, le descrizioni delle strutture e degli organi di Xenopus adulto, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti, non sono state aggiornate per prendere in considerazione i requisiti di approcci moderni come la proteomica quantitativa e la trascrittomica a singola cellula. Le prospettive gene-centrici e del tipo cellulare richiedono osservazioni contrastanti negli stadi embrionali con quelle nei tessuti adulti. Gli organi della larva subiscono cambiamenti significativi nella loro struttura complessiva, morfologia e posizione anatomica lungo tutta la transizione larvale verso l'adulto, in particolare durante il rimodellamento della metamorfosi massiva. Stabilire standard solidi per l'identificazione e la dissezione degli organi è fondamentale per garantire che i set di dati risultanti dagli studi eseguiti in diversi laboratori possano essere coerenti. Il presente protocollo identifica sei degli organi dello Xenopus adulto, dimostrando i metodi per la dissezione e il campionamento del ventricolo cardiaco, del fegato, del corpo adiposo, del pancreas, del rene accoppiato e della pelle dello Xenopus adulto. A seconda dei metodi di conservazione, gli organi sezionati possono essere utilizzati per la proteomica quantitativa, la trascrittomica di singole cellule/nuclei, l'ibridazione in situ , l'immunoistochimica, l'istologia, ecc. Questo protocollo mira a standardizzare il campionamento dei tessuti e a facilitare le indagini multi-laboratorio dei sistemi di organi adulti.

Utilizzando le Figure 1 e 20 e seguendo tutti i passaggi di questo protocollo, il ventricolo cardiaco, il lobo sinistro del fegato, il pancreas, i corpi adiposi sinistri, i reni accoppiati e un lembo di pelle sono stati asportati in modo pulito entro un'ora dall'eutanasia. Entro questo periodo, i campioni vengono risciacquati e tagliati in modo che appaiano, come mostrato nella Figura 21.
<p class="jove_content b=iglegend" fo:ke...

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Autore in primo piano: Standardizzazione del campionamento tissutale nella ricerca in proteomica e immunochimica

Questo articolo presenta una guida per il campionamento di sei organi significativi e diversi in Xenopus adulto a cui è possibile accedere rapidamente e facilmente: il ventricolo cardiaco, il lobo del fegato, il pancreas, i corpi adiposi, i reni accoppiati e la pelle.

Tecniche per il campionamento rapido di sei organi cruciali in Xenopus adulto

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Prima di questo lavoro, ho sviluppato un protocollo per la perfusione rapida degli anfibi. Questo protocollo dovrebbe essere utilizzato prima del campionamento per ricerche come la proteomica e l'immunochimica, dove la presenza di quantità eccessive di sangue nei tessuti è indesiderabile. Sebbene siano disponibili molti diagrammi e altri ausili, attualmente non ci sono guide complete su come sezionare i tessuti dello xenopus adulto in modo rapido e affidabile.Ci auguriamo che avere tecniche di campionamento standardizzate consenta ai laboratori di condividere facilmente i tessuti. Ciò è particolarmente vantaggioso in situazioni in cui l'importazione e l'esportazione di animali non è possibile a causa di problemi di biosicurezza o vincoli di spedizione.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

836 Views.  Harvard Medical School. Prima di questo lavoro, ho sviluppato un protocollo per la perfusione rapida degli anfibi. Questo protocollo dovrebbe essere utilizzato prima del campionamento per ricerche come la proteomica e l'immunochimica, dove la presenza di quantità eccessive di sangue nei tessuti è indesiderabile. Sebbene siano disponibili molti diagrammi e altri ausili, attualmente non ci sono guide complete su come sezionare i tessuti dello xenopus adulto in modo rapido e affidabile.Ci auguriamo che avere t...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

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Biologia dello sviluppo

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Chimica

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Neuroscienze

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologia

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Un modello di resezione apicale nel cuore adulto di Xenopus tropicalis

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

Medicina

Perfusione sanguigna nelle rane artigliate africane per trascrittomica e proteomica

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol in Xenopus, aimed at a consistent and drastic reduction of blood within all tissues, is defined. Perfusion is carried out by inserting a needle directly into the ventricle of the heart and pumping heparinized phosphate-buffered saline (PBS) through the vascular system. The procedure can be completed in approximately 10 min per animal. The blood is dominated by a few highly abundant proteins and cell types, creating numerous issues as these proteins mask most other molecules and cell types of interest. The reproducible characterization of adult Xenopus tissues with quantitative proteomics and single-cell transcriptomics will benefit from applying this protocol prior to organ sampling. The protocols for tissue sampling are defined in companion papers. These procedures are aimed at the standardization of practices across Xenopus of different sex, age, and health status, specifically X. laevis and X. tropicalis.

Autore in primo piano: Perfusione sanguigna rapida efficace in Xenopus  

Presented here is an effective rapid blood perfusion protocol to prepare tissue samples from African clawed frogs for transcriptomics and proteomics studies.

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Tecniche per il campionamento rapido di sei organi cruciali in Xenopus adulto

Trascrizione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cellule staminali simil-

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da

La valutazione primaria neurogenesi in

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

L'impiego di

Un modello di resezione apicale nel cuore adulto di Xenopus tropicalis

Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus