Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione OD del NIH R24OD031956. Ringraziamo Samantha Jalbert, Jill Ralston e Cora Anderson per la loro assistenza e supporto, nonché il nostro editore e i revisori anonimi per il loro utile feedback

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le norme e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). I risultati rappresentativi sono mostrati sia per un maschio adulto di albino perfuso che non perfuso, Xenopus laevis.
1. Preparazione sperimentale 
NOTA: Se si segue il protocollo di perfusione8 prima del campionamento, andare al passaggio 2.2.
<ol><li>Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia descritta nel presente protocollo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 g/L di MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio (vedi Tabella dei materiali). Il volume deve essere superiore al volume necessario per coprire completamente gli animali da sopprimere. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.</li>
	<li>Eseguire l'eutanasia primaria inserendo lo Xenopus nella soluzione di eutanasia; L'animale rimarrà immerso per un totale di 1 h.</li>
	<li>Impostare la stazione di dissezione in modo che, subito dopo il prelievo, tutti i tessuti possano essere risciacquati in PBS refrigerato o PBS9 0,7x (a seconda delle esigenze sperimentali), controllati e tagliati sotto una luce con ingrandimento 5x (o superiore). Questa stazione deve anche consentire all'utente di sostituire tutte le pinze e le forbici o di pulirle tra un utilizzo e l'altro.</li>
	<li>Una volta che la rana è rimasta nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e controllare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzicamento del piede.</li>
	<li>Registrare i dettagli appropriati per l'animale, come specie, ceppo, sesso, età e stato di salute, nonché se è stato perfuso. Pesare lo Xenopus e prendere eventuali misure aggiuntive, come la lunghezza del muso e dello sfiato.</li>
	<li>Posiziona la rana sul dorso e fissa gli arti prossimali al corpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 2, identificare la linea alba e utilizzare una pinza per afferrarla ed estrarla dalla cavità celomica. Taglia con cura la muscolatura usando le forbici. Fai due lembi dalla parete della cavità. Taglia o appunta tutti i lembi in modo che non siano d'intralcio.</li>
	<li>Identifica il cuore che continuerà a battere. Utilizzare le forbici da dissezione per ridurre le ossa coracoidee (Figura 2) per ottenere un migliore accesso al cuore. NOTA: Se il cuore ha smesso di battere prima del prelievo, si noti che la freschezza del campione è stata compromessa.</li>
</ol>2. Campionamento
NOTA: Se l'animale è stato perfuso, andare al passaggio 2.2.
<ol><li>Identificare il pericardio sottile e tenderlo con una pinza per tessuti (Figura 3).</li>
	<li>Utilizzando la punta delle forbici per iridectomia, perforare delicatamente il pericardio, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle 3 camere del cuore.</li>
	<li>Usa una pinza per afferrare il ventricolo per l'apice, identifica il punto in cui si attacca ai padiglioni auricolari e al tronco arterioso (Figura 4) e taglialo sotto questi attacchi (Figura 5). Se necessario, tagliare il ventricolo in modo che non siano visibili tessuti dei padiglioni auricolari o del tronco arterioso e che il tessuto valvolare di colore chiaro sia ancora visibile all'interno del ventricolo. NOTA: Negli animali non perfusi, la rimozione del ventricolo può qualificarsi come eutanasia secondaria.</li>
	<li>I 3 lobi del fegato saranno visibili (Figura 6 e Figura 7). Afferrare il labbro del lobo sinistro (alla destra dell'osservatore) e sollevarlo delicatamente in modo che i dotti epatici e cistici siano visibili (Figura 8). Campionare il 1/3 inferiore del lobo sotto questi attacchi (Figura 9).</li>
	<li>Per ottenere un migliore accesso ai tessuti di una rana femmina, è utile rimuovere l'ovaio. Identificare l'ovaio che è avvolto in uno strato di peritoneo viscerale chiamato epitelio germinale. Spostare delicatamente i lobi fino a quando non si trovano sui rispettivi lati per rendere visibile l'area di attacco (Figura 10). Questi attacchi sono direttamente ventrali al rene accoppiato.</li>
	<li>Usando le forbici, rimuovere le ovaie il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 11).</li>
	<li>Ispezionare il lobo mediale (chiamato anche lobo anteriore) del fegato e notare come si collega allo stomaco e al duodeno attraverso il mesentere e il dotto epatopancreatico (chiamato anche dotto biliare comune) (Figura 6, Figura 7 e Figura 8).</li>
	<li>Recidere il mesentere, il legamento epatoduodenale usando le forbici per iridectomia e il dotto epatopancreatico dove incontra il duodeno. Recidere la connessione del pancreas e del dotto epatopancreatico al lobo mediale del fegato in modo che non si attacchi tessuto epatico scuro (Figura 12).</li>
	<li>Afferrare lo stomaco con una pinza dentata e l'estremità superiore del pancreas con una pinza per tessuti. Con un ingrandimento di 5x, stuzzicare delicatamente il pancreas dallo stomaco (Figura 13). NOTA: Se non viene via in modo pulito, il tessuto pancreatico rimanente sarà visibile e può essere rimosso in frammenti. In alternativa, il pancreas può essere metodicamente staccato utilizzando le forbici per iridectomia e le pinze per tessuti.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 14A, identificare la vescica urinaria e rimuoverla, tagliando il più vicino possibile alla cloaca. Scartare questo fazzoletto.</li>
	<li>Facendo riferimento alla Figura 14B, identificare l'intestino crasso e tenderlo per recidere l'intestino crasso il più vicino possibile alla cloaca. Rimuovere e scartare l'intero canale alimentare, recidendo il peritoneo dove si attacca alla milza. I corpi adiposi saranno ora completamente accessibili.</li>
	<li>Separa i corpi grassi in modo che siano sui rispettivi lati. L'area sopra il rene, dove il corpo adiposo si collega al peritoneo, sarà visibile. Afferra la base del corpo grasso sinistro (alla destra dell'osservatore) e usa le forbici per tagliarlo via dal peritoneo, lasciando un piccolo margine in modo che il rene non venga danneggiato (Figura 15).</li>
	<li>Rimuovere e scartare il corpo grasso rimasto. I reni accoppiati saranno ora completamente visibili.</li>
	<li>Nelle femmine di rana o nei maschi con ovidotti vestigiali distinti, afferrare un ovidotto e tirarlo via dal rene e dalla cloaca (Figura 16). Taglia l'ovidotto dove incontra la cloaca e continua a tirarla via dal rene, tagliando tutti gli attacchi peritoneali chiari non appena diventano evidenti. Scartare questo fazzoletto.</li>
	<li>Ripetere questo processo con l'ovidotto rimanente.</li>
	<li>I reni sono ancora ricoperti da un peritoneo chiaro (retroperitoneale)10. Usa il forcipe per afferrare i reni e recidere il peritoneo alla loro estremità inferiore.</li>
	<li>Sollevare i reni dalla cavità celomica, usando le forbici per recidere il peritoneo il più vicino possibile ai reni senza danneggiarli (Figura 17).</li>
	<li>Con un ingrandimento 5x, tagliare il peritoneo in eccesso e qualsiasi altro tessuto rimanente (corpi adiposi, milza). Se la rana è femmina, assicurarsi che il tessuto ovarico rimanente venga rimosso (Figura 18). Se la rana è maschio, rimuovere con cautela il testicolo e verificare la presenza di un ovidotto vestigiale, che potrebbe non essere visibile senza ingrandimento (Figura 19).</li>
	<li>Rimuovi i perni dall'animale, capovolgilo sul suo ventre e riappunta gli arti dell'animale.</li>
	<li>Seleziona uno degli arti posteriori da cui campionare e appunta il piede di quell'arto.</li>
	<li>Rimuovere un lembo di pelle a mandorla da sopra il gastrocnemio/tibiofibula (Figura 20).</li>
</ol>

Protocollo standardizzato di dissezione e campionamento per organi adulti di xenopus

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Poiché questo protocollo mira a massimizzare la freschezza, alcuni campioni possono includere tessuti indesiderati. Ad esempio, il dotto epatopancreatico e alcuni mesenteri vengono campionati con il pancreas e alcuni tessuti peritoneali, ghiandole surrenali e ureteri saranno sempre campionati con i reni accoppiati.  Se la freschezza non è un problema, è possibile ottenere un campionamento più preciso utilizzando tecniche modificate.
L'aspetto e la posizione degli organi sono comparabili t...

Sebbene sia disponibile la "dissezione digitale di Xenopus adulto" 1, il campionamento replicabile di organi e tessuti di Xenopus adulto rimane impegnativo senza le istruzioni dettagliate disponibili per altri modelli adulti (ad es. topi 2,3,4). Questo articolo mira a fornire una guida chiara per un campionamento accurato e replicabile degli organi di Xenopus adulti, simile a quello attualmente disponibile per le loro larve5. L'accento è posto sulla facilità di completamento per mantenere la massima freschezza e rendere il protocollo accessibile a tutti gli utenti.
Sebbene esista una guida completa alla dissezione per Rana sp.6, così come numerose guide alla dissezione in classe per altri anuri7, attualmente non è disponibile alcuna guida alla dissezione e al campionamento di Xenopus. Per coloro che non hanno familiarità con le pratiche di campionamento o l'anatomia degli anfibi, le piccole differenze tra Xenopus e altri anuri rendono queste risorse non ottimali per il campionamento di tessuti replicabili.
Molti tessuti preziosi non sono inclusi e sono addirittura scartati nella presente guida; Questo per garantire la freschezza dei tessuti. Sei campioni sono abbastanza limitati da garantire che questi tessuti possano essere raccolti in meno di un'ora dopo che il cuore inizia a battere, indipendentemente dall'esperienza o dal livello di abilità dell'utente. Guide più avanzate e dettagliate per la raccolta di molti altri tessuti sono in preparazione come documenti di accompagnamento separati.
Per gli utenti meno esperti, si raccomanda sempre di tentare questo protocollo sugli animali sottoposti a eutanasia per motivi diversi dalla sperimentazione prima di campionare qualsiasi animale difficile da sostituire (ad esempio, transgenici, animali di età avanzata, ecc.). Idealmente, tutti gli animali campionati saranno sani e, se femmine, non saranno stati ovulati nelle ultime due settimane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus è stato un potente organismo modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre cento anni. Mentre le tecniche sperimentali di analisi e dissezione dell'embrione sono state ben documentate, le descrizioni delle strutture e degli organi di Xenopus adulto, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti, non sono state aggiornate per prendere in considerazione i requisiti di approcci moderni come la proteomica quantitativa e la trascrittomica a singola cellula. Le prospettive gene-centrici e del tipo cellulare richiedono osservazioni contrastanti negli stadi embrionali con quelle nei tessuti adulti. Gli organi della larva subiscono cambiamenti significativi nella loro struttura complessiva, morfologia e posizione anatomica lungo tutta la transizione larvale verso l'adulto, in particolare durante il rimodellamento della metamorfosi massiva. Stabilire standard solidi per l'identificazione e la dissezione degli organi è fondamentale per garantire che i set di dati risultanti dagli studi eseguiti in diversi laboratori possano essere coerenti. Il presente protocollo identifica sei degli organi dello Xenopus adulto, dimostrando i metodi per la dissezione e il campionamento del ventricolo cardiaco, del fegato, del corpo adiposo, del pancreas, del rene accoppiato e della pelle dello Xenopus adulto. A seconda dei metodi di conservazione, gli organi sezionati possono essere utilizzati per la proteomica quantitativa, la trascrittomica di singole cellule/nuclei, l'ibridazione in situ , l'immunoistochimica, l'istologia, ecc. Questo protocollo mira a standardizzare il campionamento dei tessuti e a facilitare le indagini multi-laboratorio dei sistemi di organi adulti.

Utilizzando le Figure 1 e 20 e seguendo tutti i passaggi di questo protocollo, il ventricolo cardiaco, il lobo sinistro del fegato, il pancreas, i corpi adiposi sinistri, i reni accoppiati e un lembo di pelle sono stati asportati in modo pulito entro un'ora dall'eutanasia. Entro questo periodo, i campioni vengono risciacquati e tagliati in modo che appaiano, come mostrato nella Figura 21.
<p class="jove_content b=iglegend" fo:ke...

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Autore in primo piano: Standardizzazione del campionamento tissutale nella ricerca in proteomica e immunochimica

Questo articolo presenta una guida per il campionamento di sei organi significativi e diversi in Xenopus adulto a cui è possibile accedere rapidamente e facilmente: il ventricolo cardiaco, il lobo del fegato, il pancreas, i corpi adiposi, i reni accoppiati e la pelle.

Tecniche per il campionamento rapido di sei organi cruciali in Xenopus adulto

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Prima di questo lavoro, ho sviluppato un protocollo per la perfusione rapida degli anfibi. Questo protocollo dovrebbe essere utilizzato prima del campionamento per ricerche come la proteomica e l'immunochimica, dove la presenza di quantità eccessive di sangue nei tessuti è indesiderabile. Sebbene siano disponibili molti diagrammi e altri ausili, attualmente non ci sono guide complete su come sezionare i tessuti dello xenopus adulto in modo rapido e affidabile.Ci auguriamo che avere tecniche di campionamento standardizzate consenta ai laboratori di condividere facilmente i tessuti. Ciò è particolarmente vantaggioso in situazioni in cui l'importazione e l'esportazione di animali non è possibile a causa di problemi di biosicurezza o vincoli di spedizione.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

813 Views.  Harvard Medical School. Prima di questo lavoro, ho sviluppato un protocollo per la perfusione rapida degli anfibi. Questo protocollo dovrebbe essere utilizzato prima del campionamento per ricerche come la proteomica e l'immunochimica, dove la presenza di quantità eccessive di sangue nei tessuti è indesiderabile. Sebbene siano disponibili molti diagrammi e altri ausili, attualmente non ci sono guide complete su come sezionare i tessuti dello xenopus adulto in modo rapido e affidabile.Ci auguriamo che avere t...

Video: Autore in primo piano: Standardizzazione del campionamento tissutale nella ricerca in proteomica e immunochimica

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

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Biologia

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non terminale Tecniche di prelievo di sangue in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.