Bu çalışma, NIH'nin OD hibe R24OD031956 tarafından desteklenmiştir. Yardımları ve destekleri için Samantha Jalbert, Jill Ralston ve Cora Anderson'a ve ayrıca yararlı geri bildirimleri için editörümüz ve anonim hakemlerimize teşekkür ederiz

Tüm deneyler Harvard Tıp Fakültesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) (IS 00001365_3) kural ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Temsili sonuçlar hem perfüze edilmiş hem de perfüze edilmemiş olgun albino erkek Xenopus laevis için gösterilmiştir.
1. Deneysel hazırlık 
NOT: Numune almadan önce perfüzyon protokolü8 takip ediliyorsa, adım 2.2'ye geçin.
<ol><li>Araştırma kurumunun bu protokolde açıklanan ötenazi tekniğini onayladığından emin olun.</li>
	<li>5 g/L MS-222 (trikain metansülfonat) ve 5 g/L sodyum bikarbonattan oluşan bir çözelti hazırlayın (bkz. Hacim, ötenazi yapılan hayvanları tamamen kaplamak için gereken hacimden daha büyük olmalıdır. ≥7 olduğundan emin olmak için pH'ı kontrol edin.</li>
	<li>Xenopus'u ötenazi çözeltisine yerleştirerek birincil ötenazi gerçekleştirin; Hayvan toplam 1 saat su altında kalacaktır.</li>
	<li>Diseksiyon istasyonunu, örneklemeden hemen sonra tüm dokular soğutulmuş PBS veya 0.7x PBS9'da (deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak) durulanabilecek, kontrol edilebilecek ve 5x (veya daha büyük) büyütme ışığı altında kesilebilecek şekilde ayarlayın. Bu istasyon aynı zamanda kullanıcının tüm forsepsleri ve makasları değiştirmesini veya kullanımlar arasında silerek temizlemesini sağlamalıdır.</li>
	<li>Kurbağa 1 saat boyunca çözelti içinde kaldıktan sonra, birincil ötenazi tamamlanmıştır. Kurbağayı çıkarın ve bir ayak çimdikleme yaparak ağrı tepkisi kaybını kontrol edin.</li>
	<li>Tür, tür, cinsiyet, yaş ve sağlık durumu gibi hayvan için uygun ayrıntıların yanı sıra perfüze edilip edilmediğini kaydedin. Xenopus'u tartın ve burun-havalandırma uzunluğu gibi ek ölçümler yapın.</li>
	<li>Kurbağayı sırt üstü yatırın ve vücudun proksimalindeki uzuvları aşağı doğru sabitleyin (Şekil 1).</li>
	<li>Diseksiyon makası kullanarak cildi kesin, orta çizgiye kadar kesin ve ardından yanal olarak iki flep yapın.</li>
	<li>Şekil 2'ye atıfta bulunarak, linea alba'yı tanımlayın ve onu kavramak ve sölomik boşluktan uzaklaştırmak için forseps kullanın. Makas kullanarak kas sistemini dikkatlice kesin. Boşluk duvarından iki kanat açın. Tüm kanatları kesin veya sabitleyin.</li>
	<li>Hala atmakta olan kalbi belirleyin. Kalbe daha iyi erişim sağlamak için korakoid kemikleri küçültmek için diseksiyon makası kullanın (Şekil 2). NOT: Numune almadan önce kalp atmayı durdurduysa, numune tazeliğinin bozulduğuna dikkat edilmelidir.</li>
</ol>2. Örnekleme
NOT: Hayvan perfüze edilmişse, adım 2.2'ye geçin.
<ol><li>İnce perikardı tanımlayın ve doku forseps ile gergin bir şekilde çekin (Şekil 3).</li>
	<li>İridektomi makasının ucunu kullanarak, alttaki dokuları kesmemeye dikkat ederek perikardı nazikçe delin. Perikard'ı kalbin 3 odasından soyun.</li>
	<li>Ventrikülü apeksten kavramak için forseps kullanın, kulak kepçelerine ve arteriyel gövdeye nerede bağlandığını belirleyin (Şekil 4) ve bu ataşmanların altından kesin (Şekil 5). Gerekirse, ventrikülü, kulak kepçelerinden veya arteriyel gövdeden hiçbir doku görünmeyecek ve ventrikül içinde açık renkli kapak dokusu görünmeye devam edecek şekilde kesin. NOT: Perfüze edilmemiş hayvanlarda, ventrikülün çıkarılması ikincil ötenazi olarak nitelendirilebilir.</li>
	<li>Karaciğerin 3 lobu görünür olacaktır (Şekil 6 ve Şekil 7). Sol lobun dudağını (izleyicinin sağında) kavrayın ve karaciğer ve kistik kanallar görünecek şekilde yavaşça kaldırın (Şekil 8). Bu ataşmanların altındaki lobun alt 1 / 3'ünü örnek alın (Şekil 9).</li>
	<li>Dişi bir kurbağanın dokularına daha iyi erişim sağlamak için yumurtalığı çıkarmak faydalı olacaktır. Germinal epitel adı verilen bir viseral periton tabakasıyla sarılmış yumurtalığı tanımlayın. Bağlantı alanını görünür hale getirmek için lobları kendi yanlarına gelene kadar yavaşça kaydırın (Şekil 10). Bu ataşmanlar doğrudan eşleştirilmiş böbreğe ventraldir.</li>
	<li>Makas kullanarak, yumurtalıkları böbreklere zarar vermeden mümkün olduğunca yakın bir şekilde çıkarın (Şekil 11).</li>
	<li>Karaciğerin medial lobunu (ön lob olarak da adlandırılır) inceleyin ve mezenter ve hepatopankreatik kanal (aynı zamanda ortak safra kanalı olarak da adlandırılır) yoluyla mide ve duodenuma nasıl bağlandığını not edin (Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8).</li>
	<li>İridektomi makası kullanarak mezenteri, hepatoduodenal ligamenti ve duodenum ile birleştiği hepatopankreatik kanalı kesin. Pankreas ve hepatopankreatik kanalın karaciğerin medial lobuna bağlantısını keser, böylece koyu renkli karaciğer dokusu bağlanmaz (Şekil 12).</li>
	<li>Dişli forseps ile mideyi ve doku forseps ile pankreasın üst ucunu kavrayın. 5x büyütme altında, pankreası mideden nazikçe uzaklaştırın (Şekil 13). NOT: Temiz bir şekilde çıkmazsa, kalan pankreas dokusu görünür olacak ve parçalar halinde toplanabilir. Alternatif olarak, pankreas iridektomi makası ve doku forsepsleri kullanılarak metodik olarak ayrılabilir.</li>
	<li>Şekil 14A'ya atıfta bulunarak, idrar kesesini tanımlayın ve kloaka mümkün olduğunca yakın keserek çıkarın. Bu dokuyu atın.</li>
	<li>Şekil 14B'ye bakınca, kalın bağırsağı tanımlayın ve kalın bağırsağı kloaka mümkün olduğunca yakın kesmek için gergin bir şekilde çekin. Tüm sindirim kanalını çıkarın ve atın, dalağa bağlandığı yerdeki peritonu kesin. Şişman bedenler artık tamamen erişilebilir olacak.</li>
	<li>Şişman cisimleri kendi taraflarında olacak şekilde ayırın. Şişman cismin karın zarına bağlandığı böbrek üzerindeki alan görünür olacaktır. Sol yağ gövdesinin tabanını (izleyicinin sağında) kavrayın ve böbreğin zarar görmemesi için küçük bir kenar boşluğu bırakarak peritondan kesmek için makas kullanın (Şekil 15).</li>
	<li>Kalan yağ gövdesini çıkarın ve atın. Eşleştirilmiş böbrekler artık tamamen görünür olacaktır.</li>
	<li>Dişi kurbağalarda veya belirgin körelmiş yumurta kanallarına sahip erkeklerde, bir yumurta kanalını kavrayın ve onu böbrek ve kloakadan uzaklaştırın (Şekil 16). Yumurta kanalını kloaka ile birleştiği yerden kesin ve böbrekten uzaklaştırmaya devam edin, belirgin hale geldikçe net peritoneal ekleri kesin. Bu dokuyu atın.</li>
	<li>Bu işlemi kalan yumurta kanalı ile tekrarlayın.</li>
	<li>Böbrekler hala berrak periton (retroperitoneal) ile kaplıdır10. Böbrekleri kavramak için forseps kullanın ve peritonu alt uçlarından kesin.</li>
	<li>Böbreklere zarar vermeden peritonu mümkün olduğunca yakın kesmek için makas kullanarak böbrekleri sölomik boşluktan kaldırın (Şekil 17).</li>
	<li>5x büyütme altında, fazla peritonu ve kalan diğer dokuları (yağ gövdeleri, dalak) kesin. Kurbağa dişiyse, kalan yumurtalık dokusunun çıkarıldığından emin olun (Şekil 18). Kurbağa erkekse, testisi dikkatlice çıkarın ve büyütme olmadan görülemeyen körelmiş bir yumurta kanalı olup olmadığını kontrol edin (Şekil 19).</li>
	<li>Hayvanın pimlerini çıkarın, ventrumunun üzerine çevirin ve hayvanın uzuvlarını yeniden sabitleyin.</li>
	<li>Örnekleme için arka bacaklardan birini seçin ve o uzvun ayağını sabitleyin.</li>
	<li>Gastroknemius/tibiofibula üzerinden badem şeklinde bir deri flebi çıkarın (Şekil 20).</li>
</ol>

Erişkin Xenopus Organları için Standardize Diseksiyon ve Örnekleme Protokolü

<ol><li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li>
<li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li>
<li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li>
<li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tadpole+tissue+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675(2017).</li>
<li>Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+Frog+%28Rana+sp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Atlas+of+Animal+Anatomy+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li>
<li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+used+in+research+and+teaching%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li>
<li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287(2023).</li>
<li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li>
<li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+%28Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+%28Silurana%29+tropicalis+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li>
<li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li>
<li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol%5BTitle%5D)+AND+%22Herpetol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkar beyan etmezler.

Bu protokol tazeliği en üst düzeye çıkarmayı amaçladığından, bazı örneklerde istenmeyen dokular bulunabilir. Örneğin, hepatopankreatik kanal ve bazı mezenterler pankreas ile örneklenir ve bazı periton dokusu, adrenal bezler ve üreterler her zaman eşleştirilmiş böbrekler ile örneklenir.  Tazelik bir endişe kaynağı değilse, modifiye teknikler kullanılarak daha hassas örnekleme elde edilebilir.
Organların görünümü ve yeri, cinsiyetler ve Xenopus türler...

Yetişkin Xenopus'un "dijital diseksiyonu" mevcut olsa da,1, yetişkin Xenopus'un tekrarlanabilir organ ve doku örneklemesi, diğer yetişkin modeller (örneğin fareler 2,3,4) için mevcut olan ayrıntılı talimatlar olmadan zor olmaya devam etmektedir. Bu makale, larvaları için şu anda mevcut olana benzer şekilde yetişkin Xenopus'un doğru ve tekrarlanabilir organ örneklemesi için net bir rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır5. Maksimum tazeliği korumak ve protokolü tüm kullanıcılar için erişilebilir kılmak için tamamlama kolaylığına vurgu yapılır.
Rana sp.6 için kapsamlı bir diseksiyon kılavuzunun yanı sıra diğer anuranlar7 için çok sayıda sınıf diseksiyon kılavuzu olmasına rağmen, şu anda Xenopus diseksiyon ve örnekleme kılavuzu mevcut değildir. Örnekleme uygulamalarına veya amfibi anatomisine aşina olmayanlar için, Xenopus ve diğer anuranlar arasındaki küçük farklılıklar, bu kaynakları tekrarlanabilir doku örneklemesi için yetersiz hale getirir.
Bu kılavuzda pek çok değerli doku dahil edilmemiştir ve hatta atılmıştır; Bu doku tazeliğini sağlamak içindir. Altı örnek, kullanıcının deneyimi veya beceri düzeyi ne olursa olsun, bu dokuların kalp atmaya başladıktan sonra bir saatten kısa sürede toplanabilmesini sağlayacak kadar sınırlıdır. Diğer birçok dokuyu toplamak için daha gelişmiş ve ayrıntılı kılavuzlar, ayrı tamamlayıcı makaleler olarak hazırlanmaktadır.
Daha az deneyimli kullanıcılar için, bu protokolün, değiştirilmesi zor olan herhangi bir hayvanı (yani, transgenikler, ileri yaştaki hayvanlar, vb.) örneklemeden önce, deney dışındaki nedenlerle ötenazi yapılan hayvanlar üzerinde denenmesi her zaman önerilir. İdeal olarak, örneklenen tüm hayvanlar sağlıklı olacak ve eğer dişiyse, son iki hafta içinde yumurtlanmamış olacaktır.

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy Scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for Dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus , yüz yılı aşkın bir süredir omurgalı gelişimini ve hastalıklarını anlamak için güçlü bir model organizma olmuştur. Embriyonun deneysel analizi ve diseksiyon teknikleri iyi belgelenmiş olsa da, yetişkin Xenopus yapılarının ve organlarının tanımları, yetişkinlerle çalışma teknikleriyle birlikte, kantitatif proteomik ve tek hücreli transkriptomik gibi modern yaklaşımların gereksinimlerini dikkate alacak şekilde güncellenmemiştir. Hücre tipi ve gen merkezli bakış açıları, embriyonik aşamalarda yetişkin dokulardakilerle zıt gözlemler gerektirir. Larva organları, larvadan yetişkine geçiş boyunca, özellikle büyük metamorfoz yeniden şekillenmesi sırasında, genel yapılarında, morfolojilerinde ve anatomik konumlarında önemli değişikliklere uğrar. Organ tanımlama ve diseksiyon için sağlam standartlar oluşturmak, farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen veri kümelerinin tutarlı olmasını sağlamak için çok önemlidir. Bu protokol, yetişkin Xenopus'taki altı organı tanımlayarak, yetişkin Xenopus'un kalp ventrikülü, karaciğer, yağ gövdesi, pankreas, eşleştirilmiş böbrek ve cildin diseksiyonu ve örneklenmesi için yöntemleri göstermektedir. Koruma yöntemlerine bağlı olarak, diseke edilen organlar kantitatif proteomik, tek hücreli/çekirdekli transkriptomik, in situ hibridizasyon, immünohistokimya, histoloji vb. için kullanılabilir. Bu protokol, doku örneklemesini standardize etmeyi ve erişkin organ sistemlerinin çok laboratuvarlı araştırmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Şekil 1'den Şekil 20'ye kadar kullanılarak ve bu protokolün tüm adımlarını izleyerek, kalp ventrikülü, karaciğerin sol lobu, pankreas, sol yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve bir deri flebi ötenaziden sonraki bir saat içinde temiz bir şekilde eksize edildi. Bu süre içinde numuneler, Şekil 21'de gösterildiği gibi görünecek şekilde durulanır ve kesilir.
<p class="jove_content b=iglegend" fo:keep-t...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Standardizing Tissue Sampling in Proteomics and Immunochemistry Research at JoVE.com

Yazar Spotlight: Proteomik ve İmmünokimya Araştırmalarında Doku Örneklemesinin Standardizasyonu

Bu makale, yetişkin Xenopus'ta hızlı ve kolay bir şekilde erişilebilen altı önemli ve çeşitli organı örneklemek için bir kılavuz sunmaktadır: kalp ventrikülü, karaciğer lobu, pankreas, yağ cisimleri, eşleştirilmiş böbrekler ve cilt.

Erişkin Xenopus'ta Altı Önemli Organı Hızlı Örnekleme Teknikleri

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Bu çalışmadan önce, hızlı amfibi perfüzyonu için bir protokol geliştirdim. Bu protokol, dokularda aşırı miktarda kan bulunmasının istenmediği proteomik ve immünokimya gibi araştırmalar için numune almadan önce kullanılmalıdır. Mevcut birçok diyagram ve diğer yardımcı araçlar olmasına rağmen, şu anda yetişkin ksenopustan dokuların hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl çıkarılacağına dair kapsamlı bir kılavuz bulunmamaktadır.Standartlaştırılmış örnekleme tekniklerine sahip olmanın, laboratuvarların dokuları kolayca paylaşmasına olanak sağlayacağını umuyoruz. Bu, özellikle biyogüvenlik endişeleri veya nakliye kısıtlamaları nedeniyle hayvanların ithalat ve ihracatının mümkün olmadığı durumlarda avantajlıdır.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

933 Görüntüleme.  Harvard Medical School. Bu çalışmadan önce, hızlı amfibi perfüzyonu için bir protokol geliştirdim. Bu protokol, dokularda aşırı miktarda kan bulunmasının istenmediği proteomik ve immünokimya gibi araştırmalar için numune almadan önce kullanılmalıdır. Mevcut birçok diyagram ve diğer yardımcı araçlar olmasına rağmen, şu anda yetişkin ksenopustan dokuların hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl çıkarılacağına dair kapsamlı bir kılavuz bulunmamaktadır.Standartlaştırı...

Video: Yazar Spotlight: Proteomik ve İmmünokimya Araştırmalarında Doku Örneklemesinin Standardizasyonu

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gelişim Biyolojisi

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Kimya

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording<em&gt; Xenopus</em&gt; Sinir-kas Co-kültürlerin

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Nörobilim

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Kullanılarak hücresiz Deneyi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyo Nükleer Boyut Yönetmeliğin Mekanizmaları Eğitim için ayıklar

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Biyoloji

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Yetişkin Xenopus tropicalis Kalbinde Apikal Rezeksiyon Modeli

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

Erişkin Xenopus'ta Altı Önemli Organı Hızlı Örnekleme Teknikleri

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

İlköğretim nöron değerlendirilmesi

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Kullanılarak hücresiz Deneyi

Kullanımı

Yetişkin Xenopus tropicalis Kalbinde Apikal Rezeksiyon Modeli