成体ゼブラフィッシュにおける静脈内注射の最適化

私たちの研究では、ゼブラフィッシュモデルを活用してヒトの血液疾患を研究し、白血病などの疾患の新規バイオマーカー、治療標的、治療法の特定に焦点を当てています。ゼブラフィッシュのユニークな利点を活用することで、血液疾患の根底にある分子メカニズムを探求し、患者の転帰を改善するための革新的な治療戦略を開発することを目指しています。成魚のゼブラフィッシュへの静脈注射は、そのサイズが小さく、血管系が複雑なため、困難です。

私たちは、成魚のゼブラフィッシュに物質や細胞を正確かつ効率的に送達するために、最適化されたIV注入法を開発しました。心臓内注射や眼窩後注射と比較して、ここで紹介するIV法は、魚の生存率と細胞の生着性が向上しました。この方法により、成魚のゼブラフィッシュは非ターム研究に利用しやすくなります。

新しいモデルのいくつかの限界を克服し、改良されたIV技術は、疾患モデルと薬物スクリーニングの精度を向上させ、新しい治療法の進歩に役立ちます。まず、安楽死させたmpo:EGFPトランスジェニックゼブラフィッシュを解剖台に置きます。ゼブラフィッシュを解剖して腎臓の骨髄を分離します。

次に、腎臓骨髄を細胞懸濁液が入った1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。懸濁液をピペットで動かして、腎臓骨髄細胞を解凝集します。細胞懸濁液を40μmのナイロン製セルストレーナーでろ過します。

次に、細胞を500Gで8分間遠心分離し、上清を廃棄してから、ペレットを500マイクロリットルの細胞懸濁液培地に再懸濁します。自動セルカウンターを使用して、10マイクロリットルのアリコートで細胞をカウントします。ハミルトンシリンジを75%エタノールで3〜4回よく洗います。

次に、シリンジを超純水で3〜4回すすぎ、すべてのエタノール残留物が除去されていることを確認します。ゼブラフィッシュに麻酔を施した後、運動の減少と反射反応の喪失により、麻酔の深さを確認します。魚の背側を上にして、頭を左に向けて、清潔なdでamp ティッシュペーパーを注入するために安定させます。

ハミルトンシリンジをしっかりと握り、針を尾静脈に対して約45度に傾けます。.キャスパーゼブラフィッシュの場合は、半透明の体を通して容器の見える部分を目指します。針を血管にそっと挿入し、mpo:EGFPトランスジェニックゼブラフィッシュから単離した2マイクロリットルの全腎髄細胞を投与します。

注入後、綿棒で注入部位に10秒間やさしく圧力をかけ、出血を抑えます。注入したゼブラフィッシュを顕微鏡で観察し、容器内のGFPシグナルを確認します。注入したゼブラフィッシュを、滅菌したばかりの魚の水で10分間回復させます。

次に、魚を静的なタンクに移します。静脈内注射法は、43匹中41匹の魚にGFPシグナルが見られるという最高の成功率をもたらしました。後眼窩法では37匹中3匹の魚でしかGFPが検出されず、心臓内法では40匹中11匹で成功を示しました。

静脈内注射法は、注射された魚の生存率が高く、特に眼窩後法や心臓内法と比較して細胞線量が多くなりました。GFPシグナルは、移植後3日目という早い時期に静脈注射された魚で検出されましたが、眼窩後および心臓内法ではGFPシグナルの開始が遅れていることが示されました。17日目までに、静脈内注射された魚は腎臓骨髄で最も顕著なGFPシグナルを示しました。

腎髄のフローサイトメトリーでは、静脈内注射された魚で約18%のGFP陽性細胞が示され、ドナーの腎臓髄のGFPレベルと一致する細胞は10の3倍でした。対照的に、心臓内法と眼窩後法では、それぞれ5%と2%のGFP陽性細胞が示されました。