我々は、ソフトウェア開発と議論のためのジェレミーCapouladeために特定のオリビエ​​·ブランで、Lenneとベルトランラボのすべてのメンバーに感謝します。我々はまた、技術的なサポートのためにPI​​CsL-IBDMイメージング施設、特にクロード·モレッティとブライスDetailleurに感謝します。 この作品はCNRSから（P.-FLおよびVBに）のATIP補助金によって支えられ、Labexは（P.-FLおよびVBに）補助金を通知し、（VBに）サノフィ·アベンティスからの助成金。私たちは、（「INVESTISSEMENTS D&#39;アベニール」と呼んで、ANR-10-INSB-04から01）アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュでサポートされているフランス·バイオイメージングインフラストラクチャを認めている。

1。シート光と検出経路の設定 図1は、光学セットアップの一般的なスキームを提供します。 <ol><li>光学テーブル上の顕微鏡とレーザーを配置し、固定します。 </li><li>レーザーの488 nmの、561 nmおよび対応するダイクロイックミラーを持つ405 nmのを兼ね備えています。ダイクロイックミラーの後、レーザーが正確に共同揃えなければならない。レーザ波長は、ダイクロイックミラー、及び光学フィルタの選択は、実験で使用される特定の蛍光標識の吸収スペクトルから決定されることに留意されたい。 </li><li>音響光学チューナブルフィルタ（AOTF）を配置します。 AOTFの周波数とパワーを調整するためにサプライヤが提供するテストシートを使用してください。よく揃うと、レーザパワーの約90％はパワーメータにより測定される最大同調で送信される。 AOTFを不要にする可能性が、いくつかのレーザは、完全にソフトウェアによって制御することができることに留意されたい。 </li><li>プレイスと修正望遠鏡。望遠鏡は、照明対物レンズの後開口部の直径よりも等しいか大きい幅にビームを拡大つのレンズから構成されていることに留意されたい。最小焦点距離を持つレンズは最初に来るべきです。 </li><li>場所、近いシリンドリカルレンズの背面開口部に上方向の光路をもたらす潜望鏡を整列させ、固定します。潜望鏡の2ミラーは、その長軸が完全に展開されたビームを反射するために、ミラーの傾きに敷設されているような方法で実装されていることに注意してください。 </li><li>次の潜望鏡出口にシリンドリカルレンズを配置します。シリンドリカルレンズが一方向にビームを集束し、それによって光シートを形成し、他の方向にコリメート残すことに留意されたい。 </li><li>照明対物レンズを用いて得られる光シートに再び焦点を合わせる。照明対物レンズの像焦点が検出目的のオブジェクト焦点と一致する必要があることに注意してください。ビームを投影長距離の画面（例えば壁）に。光シートの画面シャープな輪郭に取得するために、照射ビーム軸に沿って照明の目的を移動します。 </li><li>顕微鏡（キューブ）内に貯留場所にクワッドライン（405/488/561/638）発光フィルタを配置します。 </li><li>顕微鏡出力ポートでEMCCDカメラを配置します。 </li><li>顕微鏡ステージに掘削穴にネジで顕微鏡のステージ上の最初の手動の平行移動ステージを固定します。キュベットは、検出対物レンズの下にセンタリングされるように、並進ステージのエッジが、離れて顕微鏡ステージの中心から約2cmに配置しなければならないことに留意されたい。 </li><li>最初の1に第2の手動移動ステージを固定します。 2ステージの方向は（XとYの変換）に対して垂直でなければならない。 </li><li>前の2つのステージの上部にZピエゾステージを固定します。電動ステージではなく、圧電ステージの使用できることに注意してください。 </li><li>キュベットholdeを修正しました。rはステージの上部にある（ 図2参照）。キュベットは、このように互いに垂直である、照明経路及び検出経路の交点に配置される。 </li></ol> 2。シート光を確認する<ol><li>蛍光性溶液でガラスキュベットに充填し、二つの光路の交差点に試料ホルダー上に置きます。シート光は、このように表示されている。これは、水平にあり、対称/検出対物レンズに対して中心。 </li><li>シリンドリカルレンズを取り外し、光シートの厚さを測定するための画像を取得する。光シートの厚さは照明対物レンズ（NA = 0.3で約3〜4程度）の開口数（NA）に依存していることに注意してください。与えられたレンズには、光シートの厚みがスリットで逆アパーチャに入射するビームのサイズを減少させることによって増加させることができることに留意されたい。蛍光ミクロスフェアが斧を測定するために使用できることに注意してください顕微鏡のIALと横の解像度。 </li><li>実験を開始する前に、シリンドリカルレンズを戻す。 </li></ol> 3℃の取り付け虫胚 以下のステップを図3に描かれている。 <ol><li> 10×20×1mmのガラススライドの一部をカットするダイヤモンドマーキングペンを使用してください。 </li><li>水中の5％のバクト寒天を準備し、それを沸騰し、60℃でヒーターブロックでそれを維持する</li><li>スライドの切断片の片面にポリ-L-リジンの50μl加え、それを乾燥させます。 </li><li>ベンチで顕微鏡スライドを配置し、それを修正する。 </li><li>固定スライドとスライドの切断片を並置し、上部の溶融寒天の一滴を追加します。薄い寒天パッドを得るために、別のきれいな顕微鏡スライドを使用した寒天を絞る。 </li><li>寒天パッドが一番上のスライドを削除する前に乾燥することができます。 </li><li>約3ミリメートルOの過剰を残すために、固定スライドの側面にある寒天パッドをカットF寒天、ゆっくりと一定のスライドを削除します。 </li><li>寒天上のポリ-L-リジンの50μLを追加し、完全に乾燥させます。 </li><li>時計皿にM9培地で妊娠ワームを置く。 </li><li>胚を解放するために、メスと外陰部のレベルでワームをカット。 </li><li>両眼の下で、目的の段階で胚を識別し、マイクロキャピラリーピペットを使用してそれらを集める。 </li><li>スライドの切断片から突出したポリ-L-リジンでコーティングされた寒天の一部に胚を置きます。ただ、次のスライドの国境に胚を置きます。彼らは十分に安定していませんので、寒天の境界に胚を配置しないでください。胚は、ポリ-L-リジン層の上に固執するように優しく、液体を除去します。 </li><li>素早く乾燥を避けるために、胚を合わせます。 </li><li>プラスチックシャーレ中のカットのスライドを置き、ゆっくりとスライドをカバーするM9培地を追加します。 </li><li>卵がまだ寒天上に立ち往生している両眼の下に確認してください。 </李&gt; </ol> Cの 4。録音虫の開発<ol><li>試料ホルダーの前の準備（カットスライド、寒天プラス胚）を固定し、キュベット内に配置します。 図4に、自家製のホルダーを説明し、 図5は、観測コンテキストでキュベットの図を示している。 </li><li>圧電ステージにキュベットを修正します。 </li><li>明視野照明と胚の位置を特定します。 </li><li> AOTF、カメラと圧電ステージを制御するホームメイドのソフトウェアを起動します。例えば细としてそのフリーソフトウェア、なお、使用することもできる。 </li><li>レーザ線と電源（AOTF）を選択します。 </li><li>シリンドリカルレンズと照明レンズを支持3方向ステージを用いて光シートの位置を調整します。最も明るい信号を得るために、横方向（X）に沿ってステージを移動します。目を取得するために、光シートのZ位置、縦位置（Y）を調整対雑音比E最良の信号。光学シート焦点の位置は、光路長差を補正するために、1つの胚から別に調整する必要があり得ることに留意されたい。 </li><li>タイムラプス画像を取得するために、2つの画像、並びに、取得する画像の数、レーザパワーとの間の時間を得るため、露光時間を選択する。 2色取得のために、第二のレーザ線を選択します。二つのカラー画像を連続して取得される。 </li><li> AZスタックを取得するために、また、2つのスライス間の距離、および開始と圧電の位置と終了位置を選択します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、Cのin vivoイメージングのための光シート顕微鏡の簡単なセットアップについて説明します虫の胚。レーザは、ビームエキスパンダ、コリメーション及び集束レンズを含む光学シートを作成し、揃えるために必要な光学素子は、容易に光学ベンチ上に取り付けることができる。検出経路とカメラ用正立顕微鏡との組み合わせでは、これは、セットアップの簡単な解決策光シート顕微鏡を提供します。 このジオメトリは、サンプル環境が簡単になります。生体試料は、保持された位置決め及び機械部品の小さなセットによって移動されるガラスキュベット内に配置される。シート照明顕微鏡が機能を区画した広視野手法であるように、単一の軸電動移動が3D画像に必要です。これは、単一の走査要素への同期の要求を制限し、ソフトウェア開発を容易にする。 iSPIM 6私たちの直立幾何と比較したリューは、検出用の高NAの対物レンズを使用することができる。水平面内の対物レンズとのSPIMのセットアップに比べて、サンプルの取り付けや胚の一連の撮影が容易になります。要するに、この技術の実装が簡単であり、光学系にはほとんど専門知識を用いて達成することができる。これは、より高い速度と減少し、光毒性は低く、軸方向の分解能の欠点の利点と共焦点顕微鏡への安価な代替である。 また、Cをマウントするための簡単で再現性のある方法を開発しましたこのシステムを用いたin vivoイメージングのための線虫胚 。取付手順は高速で（15分）、日常の実験のために適している。 Cの虫イメージング 、この単純な設定の利点は、少なくとも2倍量である：TOTOイメージングにおいて （i）は回転せずに可能であるため、3D再構成が簡単です。 （ii）のサンプル実装が容易であり、複数の胚を順次撮像することができる同じスライド上。我々は細胞分裂や細胞形状の変化を観察するのに十分な時間分解能でタイムラプス映画の例を示した。 Cを勉強するシート光顕微鏡の力エレガンスの発達はまた、最近、他6,7,8によって示されている。したがって、この技術は、C.の形態形成およびパターニングを研究するために非常に有用であろう虫胚 。 このシステムはまた、他のモデル生物の発達を分析するために使用することができますか？これは、認識することが重要であるような小さなC.及び透明生物用シート照明顕微鏡法の実装虫は、ショウジョウバエの胚のようなより大きな生物ほど厳しくなる。 ショウジョウバエのTOTO撮影では 、通常、回転、マルチビュー再構成9、10が必要です。共線励起の対物レンズとの2側面から励起はまたattenuatによって生じる影の影響を軽減することができます光11のイオン。しかし、ここで紹介する設定はまだ低い漂白および低光毒性で、 ショウジョウバエの胚の画像1の側に適合されている。このセットアップはまた、ホヤやゼブラフィッシュなどの画像小さな透明の胚にとって有用である可能性があります。

生物の形成および整形は、細胞運動、細胞形状の変化、細胞分裂および細胞分化を含む。これらのプロセスの進行と調整を理解することは、3次元機能と細胞内分解能で高速な画像処理ツールが必要です。これらのインビボイメージング機能を備えた技法の中でも、光学シート照明顕微鏡法は、単一/選択的平面照明顕微鏡法と呼ばれる低毒性効果および1,2低い光退色を製造する独特の利点を有する。 シート照明顕微鏡法では、試料は光学切片を行う光シートにより側面から照明される。照明経路及び検出経路は、互いに直交する光シートは、検出対物レンズの物体焦点面と一致するように整列される。サンプルは、2つのパスの交点に配置されているndは3Dイメージングを可能にするように検出軸に沿って移動させることができる。関心のある面が照明されると、この面の全ての点が同時に検出されるのみ。これは、有意に取得速度を増加させ、共焦点顕微鏡3と比較して、光退色、並びに光毒性を低減する。 具体的には、シート照明顕微鏡は、セットアップと整列するには簡単です。2次元画像化のために、何のスキャンは、検出部のため、また照明部のためでもない必要ありません。能力をセクショニングを有する広視野技術として、三次元イメージングは​​、試料を保持するステージ、単一の軸移動することによって得ることができる。 ここでは、CのTOTOイメージングでのために簡単なシート光顕微鏡とその実装の ​​設定までを提示虫胚℃で虫の胚は、生体内のIMA に住むのに適しているそれらの透明性、不変系統とステレオタイプセル位置4,5にエージング。開発した光シートのセットアップは、検出のための標準的な正立顕微鏡に基づいています。以下に示すプロトコルが構築し、位置合わせ励起モジュール/パスをテストし、シート光を特徴づけると3Dイメージングのためのサンプルをマウントする方法について説明します。また、蛍光マーカーを発現する種々の菌株のセットアップで取得タイムラプスムービーの例を示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

高速かつ低毒性のイメージング技術は、 全体として生物の発生を研究するための前提条件である。細胞下解像度の3D映像を提供しながら、シート光ベースの顕微鏡は、共焦点顕微鏡に比べて、光退色と光毒性の影響を低減します。ここでは、正立顕微鏡と光シートを生成するための光学機械要素の小さなセットで構成されている光シートベースの顕微鏡のセットアップを提示する。プロトコルは、構築顕微鏡を整列させ、シート光を特徴付ける方法について説明します。また、C.のトトイメージングで方法を実装する方法の詳細単純な観察 ​​室を使用して、胚エレガンス 。この方法は、開発の数時間にわたる3D二色タイムラプスムービーのキャプチャを可能にする。これは、細胞形状の追跡を容易にする細胞分裂及び長期間にわたってタンパク質をタグ化すべきである。

3別のCから三次元タイムラプス撮影実験エレガンス株は、上述の光シート顕微鏡セットアップを用いて得ることができるデータの種類を示す。私たちは、これらの条件下で胚はSPIMイメージングがCで唯一の低光毒性レベルを引き起こすことを示す以前の報告と一致して、通常の速度で開発し、イメージングを生き残ることを確認虫胚 6,7。 第1の株は、GFP（; stIs10024 zuIs178）に融合されたヒストンを表現しています。記録は37秒毎に撮影し20スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで2時間実施した。 図6は、異なる時点でのスタックの1つの面を示している。 interphasic核（矢印）と凝縮された有糸分裂クロマチン（矢じり）の両方がはっきりと見える。 第2の株は、GFP（ruIs57）に融合されたチューブリンおよびヒストンを表現mCherry（; stIs10226 itIs37）に融合。記録は105秒毎に採取20スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで16分間で実施した。7はスタックと異なる時点の異なる面を示す図 。 3つの連続する時点での関連する映画1を表示し、3D再構成。分裂の間に、紡錘体（緑色）と凝縮した染色体（赤）が開発中の細胞分裂の方向を追跡できるようにはっきりと見える。 三株は、GFPに融合したアポリポタンパク質VIT-2（pwIs23）とmCherry（ltIs44）膜結合を表現しています。記録は30秒毎に撮影し10スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで25分間で実施した。8はスタックと異なる時点の異なる面を示す図 。細胞内の卵黄リポタンパク質粒子（緑）の迅速な動きを簡単にすることができます続く。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：照明および検出ユニットは、前面および底面図で構成SPIM光学装置 。照明ユニットにおいては、ダイクロイックミラーにより合わせたレーザーはそれぞれ独立して、レーザのパワーを制御するAOTFを入力する。次いで、望遠鏡は4倍ビームの大きさを増大させ、ペリスコープは、顕微鏡の高さに持ってくる。シリンドリカルレンズは、照明対物レンズによって再集束された光のシートを形成する。検出部は、正立顕微鏡に一体化され、主に検出レンズ、フィルター、チューブレンズとEMCCDによって構成されている。試料は、照明および検出経路間の交差部に配置されている。ピエゾステージは、試料の垂直（Z）の変位を可能にする3D取得のため。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> 図2：このキュベットホルダーは、ホルダー3のアルミニウム板からなり、圧電ステージ上にねじ込まれている。ガラスキュベット（赤）ばねによって保持される。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> 図3：Cの実装プロトコルSPIM実験のための胚エレガンス 。ガラスの切断片を、ポリ-L-リジンで被覆されている。寒天のパッドがコーティングされた表面上に配置される。ポリ-L-リジン、次いで寒天パッドに添加される。最後に、C.エレガンス胚は、ポリ-L-リジンコーティングされた寒天パッド上に整列される。 図4：試料ホルダー 。ホルダーは、ガラスキュベットの内部寸法に適合します。 （赤）二つのスプリング（ 図3を参照）、スライドガラスを保持します。このホルダーをガラスキュベットの中に置かれる。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> 図5：観察コンテキストにおける試料ホルダ胚を図3にまとめたプロトコルに従ってスライドガラス上に固定したスライドは、図4で説明した試料ホルダに保持されている試料ホルダをガラスキュベットに挿入される、。 図2で説明したホルダに保持された。光シートは、私は水平であり、側からの胚をlluminates。検出対物レンズは試料の上に、垂直である。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> 図6：Cの記録ヒストンを表現する線虫胚 :: GFP融合ヒストンを発現するトランスジェニック胚の単一平面画像:: GFP融合（zuIs178; stIs10024）異なる時点での3Dタイムラプス記録から抽出した画像：20スライスで作られたスタック（。スライス1μm）との間の距離;スライス当たりの露光時間：30秒;スタック間の時間間隔：37秒;総取得時間：2時間。矢印：interphasic核、矢頭：凝縮有糸分裂クロマチン。 T = 0分で胚は2細胞期にあり、正常な発達の下に予想されるようにtの= 120分、胚は約70細胞が含まれています（胚のすべての細胞単一の平面に含まれる細胞のみが絵で表示されていることに注意していない）オシッコ。照明の電力は、（照明目的の出口で測定）488nmで30μWた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> 図7：Cの記録チューブリン:: GFP融合とヒストンを表現する線虫胚:: mCherry融合℃の3Dタイムラプス記録から抽出した画像チューブリン:: GFP融合（ruIs57）とヒストン:: mCherry融合（; stIs10226 itIs37）を発現する線虫胚 。記録条件：スライス1間の20スライス（距離のスタックの取得程度）ごとに105秒;総取得時間：16分;露出時間：各チャネルごとに200ミリ秒。パネルAは 、同じスタックの10スライスを示しています。パネルBは、同じスライスごとに210秒を示しています。照明の電力はそれぞれ488と561 nmのレーザー、（照明目的の出口で測定）のために、30μW300μWた<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> 図8：Cの記録VIT-2 :: GFP融合し、膜を標的とmCherryを表現する線虫胚℃の3Dタイムラプス記録から抽出した画像虫胚 VIT-2 :: GFP融合を表現（PWIS23）、膜を標的とmCherry（ltIs44）。記録条件：10スライス（スライス1ミクロンの間の距離）ごとに30秒のスタックの取得;総取得時間：25分;チャネル当たりの露光時間：200ミリ秒。パネルAは 、同じスタックの5最初のスライスを示しています。パネルBは、同一スライスごとに30秒を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K ビュー.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université. このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。 

ビデオ: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する

のための簡単なシート光顕微鏡を設定する