RANペプチドは、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症などの神経変性疾患の繰り返し拡大の特徴である。これらのプロトコルは、C.elegansモデルシステムにおけるRANペプチド毒性を定量化するための重要な標準化されたアプローチを提供します。説明する技術は、学習が簡単で安価で、迅速に実行でき、動きや再生などのC.elegansシステムの再現可能な機能を活用することができます。
このプロトコルを試みるとき、主要な課題は、一貫したRANペプチド毒性および発現を得る。制御する主な要因には、薬物温度、温度変化のタイミング、アッセイプレートの調製などがあります。実験者は、この年齢依存性プロセスアッセイにおいて動物の表現型を一貫して分類することが重要である。
この手法の視覚的なデモンストレーションでは、その分類基準を示します。24ウェルプレートに1ミリモルIPTGと25マイクログラムの1ミリモルIPTGと25マイクログラムの標準的な線虫増殖培地を注ぐことから始めます。RNAiは、LBカルベニシリン寒天にHT115細菌のクローンを供給し、24時間摂氏37度でそれらを成長させます。
翌日、LBカルベニシリン液体培地の1ミリリットルに単一のコロニーを選び、250rpmで振りながら摂氏37度で18時間細菌を増殖させます。テキスト原稿に記載されているように、一晩細菌培養物の20マイクロリットルを有するNGM RNAi 24ウェルプレートの4つの個々の井戸を発見し、RNAi細菌が一晩で二本鎖RNA産生を誘導することを可能にする。標準的な次亜塩素酸塩法を使用して、一日目の成人C.elegansから卵を単離し、統合されたRANペプチドトランスジーンを発現させます。
その後、24ウェルプレートの各ウェルに約30個の卵を播種し、7日間摂氏20度でプレートをインキュベートします。ビデオ速度解析を行うために、モノクロカメラを装着したステレオ解剖顕微鏡を用いて、RNAi状態ごとに2つの別々の井戸から2つのビデオを取得します。井戸間で一貫した取得設定を使用してください。
ビデオごとに、10 秒の期間と時間間隔を 76 ミリ秒に設定します。イメージの露出時間を 4 ミリ秒に設定し、1.49 ズーム設定を使用します。次に、2つのビン分割で2つを選択します。
解像度が 800 x 600 ピクセルであることを確認し、録音を開始します。取得後、各ビデオに株、RNAi条件、およびウェル番号をすぐにラベル付けします。次に、各RNAi状態について合計約40匹のワームを調べ、ビデオあたり20種類の動物の移動距離と各動物の長さを測定します。
ソフトウェアで、注釈ツールボタンを選択します。次に、テキスト描画ツール。ビデオの最初のフレームで測定されているワームの中央にある点をクリックし、数字でマークします。
ワームを視覚的に追跡しながらビデオを最後まで進めます。次にそれをクリックし、次の対応する番号でマークします。1 つ目の数値から 2 番目の数値までの線を描画し、スプレッドシートに移動した距離を記録するには、描画スケール バー ツールを使用します。
解析ウィンドウで個々の測定を保存しながら、ビデオ内の19の他のワームに対してこの測定を繰り返します。測定が完了したら、すべての測定ラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成し、データを元の動物に戻すことができます。次に、4 列のスプレッドシートを使用してデータを分析します。
各ビデオの時間は、実験の下でビデオを右クリックし、プロパティに行くことによって見つけることができます。速度測定を正規化するには、各動物の長さを求めます。引きポリラインツールを使用して、頭の先端から尾の先端までC.elegansを自由にトレースします。
次に、すべてのポリラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成します。行の長さは統計の下に記録されます。スプレッドシートに 2 つの列を追加し、1 つは動物の長さ、もう 1 つは正規化された速度用です。
最後に、一方向の ANOVA を使用して、非定型のテストと空のベクトル RNAi を使用して正規化された速度データを分析します。6センチメートルのGFP RNAiプレートにRANペプチドGFPを発現する4〜6個のトランスジェニックL4 C.エレガンを置き、摂氏20度で成長させます。実験がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果をテストするためにRNAiを利用している場合、10のトランスジェニックグラビッド成人を2つの空のベクターRNAi GFP RNAiまたは遺伝子特異的RNAiプレートのそれぞれに移動させる。
変異体がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果を分析するために使用されている場合、2つの空のベクターRNAiまたはGFP RNAiプレートのそれぞれに同じRANトランスジーンを発現する10グラムの野生型または突然変異動物を配置する。摂氏20度で48時間育ててください。RNAiプレートから10個のトランスジェニックL4を10セットピックアップし、各セットを3センチメートルのRNAiプレートに置きます。
アッセイ用に選択されたワームがすべて表面的に正常な運動性を持っていることを確認してください。プレートをビニール袋に入れて水分を保持し、摂氏25度でインキュベートします。24時間後、解剖顕微鏡のプレートをタップし、動きを確認して移動性のために動物を分析します。
ワームが体長以上動く場合は、移動体としてカウントし、新しい3センチメートルのRNAiプレートに転送します。頭と尾の残りのワームをタップするプラチナピックを使用してください。動物が体の長さ以上に動く場合は、移動体として動物を数え、新しい3センチメートルのRNAiプレートに移します。
2日目までに空のベクトル制御で有意な麻痺が見られない場合は、アッセイを終了して最初からやり直してください。すべての動かないワームをグループ化して、体長以上の動きを簡単に検出できるようにします。すべての麻痺、袋詰め、または死んだワームを数え、プレートを捨てます。
毎日5~7日間、麻痺の動物を採点し続けます。増殖アッセイは、G4C2反復拡張を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する遺伝子阻害の効果を測定するために使用された。PR50 GFPの発現だけでは完全な成長停止が生じたが、いくつかの遺伝子のノックダウンは発達毒性を抑制した。
PR50発現動物の発達運動性に対する特異的遺伝子ノックダウンの効果を、ビデオ速度解析法を用いて測定した。予想通り、PR50 GFP発現の阻害は、空のベクターRNAiと比較して運動性の大幅な増加をもたらした。さらに、プロテアソームサブユニットRPN7に対するRNAiは、PR50運動性の有意な増加をもたらした。
成人表現型を年齢依存性麻痺アッセイで分析した場合、PR50 GFPは5日までに最大80%の麻痺を示した。しかし、RNAiは、PR50 GFP毒性に対して袋-6が必要であることを示唆する有意に遅延した麻痺の遺伝子に向けられた。ランタンパク質がC.elegansニューロンで発現したときに神経病理学を引き起こすかどうかを判断するために、ニューロン特異的毒性をコミュランスアッセイを用いて検討した。
2日目の成人では、運動ニューロンにおけるPR50 GFP発現が運動ニューロンの出血の有意な増加につながった。この神経病理学は、インスリンIGF受容体遺伝子ホモログDAF-2の変異によって有意に抑制され、いくつかの神経変性タンパク質の毒性特性を遅延させた。行動アッセイでは、RANペプチドが浸透性の高い表現型を生成することが重要です。
このような遺伝子または薬物は、RANペプチド疾患の新しいバイオマーカーまたは治療オプションを提供することができる。これらのアッセイを用いて、C9ORF72に関連するRANペプチドプロリンアルギニンのサプレッサーに対するゲノムワイドRNAiスクリーンを実施した。この画面で同定された遺伝子には、将来の機械研究の対象となる多くの新しい保存された遺伝子が含まれる。
