我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ダイムの月からバジルオコナーScholarの賞と全米科学財団からGACへのキャリア賞だけでなく、ハワードヒューズ医学研究所からのアラバマの大学に学部研究科学プログラムグラント、神経細胞の興奮性に資金を提供しているとコー​​ルドウェルラボにおけるてんかんの研究。

アルジカルブの露出パラダイム<ol><li>初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目アルジカルブアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。 </li><li>二日目に、70％エタノール（EtOH）および30％のddH 2 Oでアルジカルブの100mMのストック溶液を作る希望アルジカルブの濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にアルジカルブの適切な量を広げる。我々は一貫して7.5 mLのNGMプレート上にめっきによって100mMのアルジカルブの37.5μLを0.5 mMのアルジカルブを使用してください。アルジカルブプレートは室温でおよそ30〜60分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、アルジカルブはNGMに加え、4℃で一週間保存できます。 &nbsp;</li><li> E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム各アルジカルブプレートの中心と室温でさらに30〜60分間乾燥した上に大腸菌 （できれOP50）。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。 &nbsp;</li><li>食品の芝生が乾燥しているとき、人はアルジカルブアッセイを進めることができます。アルジカルブアッセイの主観的な性質のため、それは非常に実験は&quot;盲目的に&quot;実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さアルディカーブプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者は、アッセイ野生型株だけでなく、耐性株と過敏性ひずみを場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験者が一度に少なくとも6つの系統を分析することができるはずです。 &nbsp;</li><li>白金線で一貫した方法で各ワームをつついによって麻痺したワームの数を数えます。我々は一貫して二回頭の上と二回尾三時間の合計は30分ごとに私たちのワームを突く。ポンピング咽頭の停止も麻痺を定義するために使用されるが、実験者は、すべてのアッセイ上麻痺の一貫した定義を採用している場合にのみすることができます。また、それは特に、いくつかのワーム、アルジカルブに耐性があるものは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はアルディカーブプレートの周りに、パルミチン酸、ワームの運動への物理的な障壁の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。 </li></ol> PTZ露出パラダイム<ol><li>初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目のPTZアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。 </li><li>二日目には、PTZ 0.5gのPTZ / mLののddH 2 Oのストック溶液を作る。希望するPTZ濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にPTZの適切な量を広げる。我々は7.5 mLのNGMプレート上にPTZの量を変えPTZ、我々プレートの用量反応アッセイを好むので。たとえば、あるは7.5 mLのNGMプレート上にプレートPTZストック溶液の37.5μLを5 mgのPTZ / mLの溶液を作成することがあります。 PTZプレートは室温でおよそ60〜120分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、PTZはNGMに直接追加することができますが、それはすぐに凝固した後、アッセイに使用する必要があります。 PTZの安定性はアルジカルブの場合よりもかなり少なくなります。したがって、古いPTZプレートとアッセイは信頼性が低い。 PTZは、使用前に乾燥剤をデシケーター中で-20℃で保存してください。我々は安定性を確保するために、開封後約2ヶ月PTZを破棄することを好む。 </li><li> E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム大腸菌 （できれOP50）各PTZプレートの中央に、室温で別の30〜60分間乾燥した。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。 &nbsp;</li><li>食品の芝生が乾燥しているとき、人はPTZアッセイを進めることができます。 PTZアッセイはアルジカルブのアッセイよりも主観的ですが、それはまだ非常に実験は&quot;盲目的に&quot;実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さPTZプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者のアッセイ野生株だけでなく、前方または全身痙攣を有する株場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験は、一度に少なくとも3つの株を分析することができるはずです。ワームが麻痺になったり、場合によっては、薬剤に慣らしとしてはまだ、その後周波数と強度の暴露の15〜30分間の間に通常のピークPTZ誘発性痙攣の、とは減衰。 </li><li>一時間の合計のための&quot;てんかんのような&quot;ワームをconvul​​sing 30分ごとの数を数えます。それは、フルボディの痙攣、全身麻痺、我々は&quot;トニック&quot;と呼ぶ、または組み合わせでワームの数とは別に、我々は&quot;頭ボブ&quot;と呼ぶ前痙攣、とワームの数を獲得するのが最適です我々は、&quot;強直間代&quot;と呼ぶBWM麻痺と前方痙攣、。単一の遺伝子型のほとんどのワームは、痙攣の1種類のみを示す。しかし、強直間代ワームは、しばしば完全に強壮剤になるので、一つはすべてのワームはすでに痙攣を展示している場合でも、30分を過ぎて分析を続ける必要があります。また、それはいくつかのワームは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はPTZプレート周りのパルミチン酸の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。 </li></ol>アルジカルブ及びPTZに選択された線虫のシナプス伝達の変異体の行動反応<table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th>変異体名</th><th>シナプスの役割</th><th>薬物なしで動作</th><th>アルジカルブの行動反応（野生型N2に比べて） </th><th> PTZに対する行動反応</th></tr><tr><td>トム- 1（ok188） </td><td>シナプス伝達を抑制する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>野生型と区別できない</td></tr><tr><td> UNC - 43（n498n1186） </td><td>複雑</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>全身痙攣</td></tr><tr><td> UNC - 25（e156） </td><td> GABA伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>前痙攣、全身麻痺</td></tr><tr><td> SNB - 1（md247） </td><td>シナプス伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の減少率</td><td>前痙攣</td></tr><tr><td> UNC - 4（E120） </td><td>アセチルコリン伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の減少率</td><td>野生型と区別できない</td></tr></tbody></table>ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれる2つのニューラル覚醒剤、アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、およびGABA受容体拮抗薬は、、C. elegansのシナプス伝達の変異体を特徴づけるために相補的に使用することができます。過剰興奮性アセチルコリン（ACH）はAChの伝達（例えばタム- 1、UNC - 43）または抑制性GABA伝達（例えば、UNC - 25）の正の調節因子の負の調節に有害な突然変異からワーム体壁筋接合部（NMJs）に蓄積する。逆に、ワームのNMJsにおける興奮性AChのレベルは、一般的なシナプス伝達（例えば、SNB - 1）またはACH -特定の送信の遺伝子（例えば、UNC - 4）の正電圧レギュレータで、有害な突然変異によって減少する。低下興奮性AChの伝達と変異型ワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の減少率を示すのに対し、野生型N2のワームと比較すると、NMJsで上昇興奮性AChの伝達と変異体のワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の増強率を示す。 PTZはないアルジカルブとは異なり、線虫体壁筋で神経同期を中断しますが、PTZもC. elegansの頭部の筋肉に抑制GABAに拮抗する。その結果、アルジカルブの感度は、正確にPTZの感受性を予測することはできません。負または正のregul内の特定の欠陥を持つ変異体ワームアセチルコリン伝送の評価作業を容易には一般的なシナプス伝達または抑制性GABA伝達の展示堅牢なPTZ誘発性前部痙攣で特定の欠陥の正の調節に欠陥を持つ変異体ワームのに対し、PTZの存在下で野生型N2のワームから区別することはできません。また、UNC - 43の機能喪失変異体は、PTZの存在下で、フルボディの痙攣を表示し、おそらく彼らのユニークな薬剤応答に寄与する追加のシナプス伝達の異常を、持っている。

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

C.とアルジカルブ露出のための現在のプロトコル虫は、変異体の両方のクラスはアルジカルブに耐性を示すように実験者は、シナプス伝達における一般的な赤字とAChの伝達と変異体の特定の障害を持つ変異体を区別することはできません。同様に、アルジカルブは、変異体は変異の両方のクラスはアルジカルブに過敏症を示すように否定的に、アセチルコリンの伝達を調節するためにGABA伝達ま...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

線虫、線虫（Caenorhabditis elegans）は、神経伝達を研究するための方便モデルとなっている。その神経系の解剖学との接続は電子顕微鏡写真から決定および薬理学的アッセイによって洗練されているようにC. elegansは、動物モデルの中で一意です。このビデオでは、我々は、どのように2つの補完的な神経刺激剤アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を、記述し、ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれるγ-アミノ酪酸（GABA）受容体拮抗薬は、、特にC. elegansの神経筋接合部での信号の特性評価に用いることができる（NMJs）と拮抗神経回路の我々の理解を促進する。 302 C. elegansのニューロン、19 GABA作動性D -型運動ニューロン神経支配の体壁の筋肉（BWMS）、の間RMEsと呼ばれる4つのGABA作動性ニューロン、、支配する頭の筋肉。逆に、三十から九運動ニューロンは、興奮性神経伝達物質、アセチルコリン（ACH）を発現し、運動を調整するBWMSでGABA伝達を拮抗する。体壁のNMJsにおけるGABA作動性およびコリン作動性運動ニューロンの拮抗性質は、最初にレーザーアブレーション法によって決定され、後でアルジカルブの曝露によってbuttressedした。時間の経過または野生型ワームにおいて用量反応性の麻痺の急性アルジカルブの暴露の結果。以下アセチルコリンがBWMSの少ない刺激につながる、ワームのNMJsで蓄積として、まだ、興奮性AChの伝送の損失は、アルジカルブに耐性を付与する。アルジカルブへの抵抗は、アセチルコリン固有のまたは一般的なシナプス機能の変異体で観察されることがあります。拮抗GABAおよびアセチルコリン伝達、GABA伝達の損失、または否定的にアセチルコリン放出を調節することが失敗と一致し、アルジカルブに過敏性を付与する。アルジカルブの曝露は神経伝達遺伝子の多数のワームのホモログの単離につながっているものの、アルジカルブの露出だけでは効率的に特定の線虫C. elegansの運動神経細胞の遺伝子とパスウェイのための支配的役割を決定することはできません。この目的のために、我々は、PTZを使用して補完的な実験的アプローチを、導入している。 神経伝達変異体は、PTZに対応しアルディカーブ誘導の麻痺とは異なる明確な表現型を、、が表示されます。野生型ワームだけでなく、アセチルコリンを放出または受信する場合は、特定の無能と変異体は、PTZに明らか感度を示していない。しかし、GABAの変異体、ならびに一般的シナプス機能の変異体は、時間経過や用量反応性の形で前方痙攣が表示されます。否定的に一般的な神経伝達物質の放出を調節し、従って、BWMSにアセチルコリンの過剰な量を分泌できない変異体は、PTZに麻痺する。離散的変異体のクラスのPTZ誘発性表現型は、C. elegansのアルジカルブ及びPTZ露出パラダイムと相補的なアプローチは、神経伝達の我々の理解を加速させる可能性があることを示している。また、我々は薬理学的アッセイを行う方法をデモビデオはC. elegansの研究のための一貫性のある方法を確立する必要があります。

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

このビデオでは、線虫、C. elegansのシナプス機能を研究するために補完的な方法で2つのニューラル覚せい剤、アルジカルブとペンチレンテトラゾール（PTZ）を、採用する方法を示します。この補完的なアプローチは、変調神経同調のための進化的に保存のメカニズムに光を当てると、てんかんと発作のための意味を持つために使用することができます。

C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  University of Alabama. このビデオでは、線虫、C. elegansのシナプス機能を研究するために補完的な方法で2つのニューラル覚せい剤、アルジカルブとペンチレンテトラゾール（PTZ）を、採用する方法を示します。この補完的なアプローチは、変調神経同調のための進化的に保存のメカニズムに光を当てると、てんかんと発作のための意味を持つために使用することができます。

ビデオ: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法<em&gt; C。エレガンス</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...