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Measuring TCR-pMHC Binding <em>In Situ</em> using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

single-molecule-fluorescence-microscopy-on-planar-supported-bilayers

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

enrichment-native-lipoprotein-particles-with-microrna-subsequent

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Vienna University of Technology

Medical University Vienna

Antigen recognition is a key event during T cell activation. Here, we introduce nanopatterned antigen arrays that mimic the antigen presenting cell surface during T cell activation. The assessment of activation related events revealed the requirement of a minimal density of 90-140 stimulating major histocompatibility complex class II proteins (pMHC) molecules per μm(2). We demonstrate that these substrates induce T cell responses in a pMHC dose-dependent manner and that the number of presented pMHCs dominates over local pMHC density.

T cell activation is determined by the number of presented antigens.

Bax is a key regulator of apoptosis that mediates the release of cytochrome c to the cytosol via oligomerization in the outer mitochondrial membrane before pore formation. However, the molecular mechanism of Bax assembly and regulation by other Bcl-2 members remains obscure. Here, by analysing the stoichiometry of Bax oligomers at the single-molecule level, we find that Bax binds to the membrane in a monomeric state and then self-assembles in <1 min. Strikingly, active Bax does not exist in a unique oligomeric state, but as several different species based on dimer units. Moreover, we show that cBid activates Bax without affecting its assembly, while Bcl-xL induces the dissociation of Bax oligomers. On the basis of our experimental data and theoretical modelling, we propose a new mechanism for the molecular pathway of Bax assembly to form the apoptotic pore.

Bax monomers form dimer units in the membrane that further self-assemble into multiple oligomeric species.

Here, we measure the actin cytoskeleton arrangement of different morphological states of human platelets using a new protocol for photo-switching of rhodamine class fluorophores. A new medium composition was established for imaging the cytoskeleton using Alexa Fluor 488 conjugated to phalloidin. Morphological states of platelets bound to a glass substrate are visualized and quantified by two-dimensional localization microscopy at nanoscopic resolution. Marker-less drift correction yields localization of individual Alexa 488 conjugated to phalloidin with a positional accuracy of 12 nm.

Localization Microscopy of Actin Cytoskeleton in Human Platelets.

microRNAs (miRNAs) are post-transcriptional regulators of messenger RNA (mRNA), and transported through the whole organism by-but not limited to-lipoprotein particles. Here, we address the miRNA profile in serum and lipoprotein particles of healthy individuals in comparison with patients with uremia. Moreover, we quantitatively determined the cellular lipoprotein-particle-uptake dependence on the density of lipoprotein particle receptors and present a method for enhancement of the transfer efficiency. We observed a significant increase of the cellular miRNA level using reconstituted high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yielded no measurable effect. Thus, we conclude that no relevant effect of lipoprotein-particle-mediated miRNA-transfer exists under in vivo conditions though the miRNA profile of lipoprotein particles can be used as a diagnostic marker.

Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.

&#x836F;&#x7406;&#x5B66;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x5E38;&#x6570;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x4FBF;&#x4E86;&#x89E3;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x4E0E;&#x5404;&#x79CD;&#x819C;&#x53D7;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x7814;&#x7A76; Centruroides limbatus &#x4E2D;&#x7F8E;&#x6D32;&#x874E;&#x5B50;&#x6BD2;&#x6DB2;&#x7EC4;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x77ED;&#x80BD;&#x79F0;&#x4E3A; hongotoxin(1) &#xFF08;HgTX(1))&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x7279;&#x522B;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5728;&#x5206;&#x5B50;&#x5316;&#x5B66;&#x8BA1;&#x91CF;&#x5B66;&#x7684; 1:1 &#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x6027;&#x94BE;&#x901A;&#x9053; 1.3 K (V)&#x3002;&#x6BD2;&#x7D20;&#x6A21;&#x62DF; (HgTX(1)-A19C) &#x53D7;&#x5230;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x7B7E;&#x4E0E; Cy5 &#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x5229;&#x7528;&#x8D85;&#x7075;&#x654F;&#x7684;&#x5FAE;&#x89C2;&#x65B9;&#x6CD5; &#xFF08;&#x5355;&#x67D3;&#x6599;&#x8FFD;&#x8E2A; &#xFF1B;&#x7279;&#x6B8A;&#x548C;&#x5DEE;&#x522B;&#x5F85;&#x9047;&#xFF09; &#x6211;&#x4EEC;&#x90FD;&#x80FD;&#x76F4;&#x63A5;&#x60F3;&#x8C61; HgTX 1-A19C-Cy5 &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; K (V) 1.3 Jurkat &#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0A;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x6027;&#x94BE;&#x901A;&#x9053;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5141;&#x8BB8;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x89E3;&#x79BB;&#x5E38;&#x6570; &#xFF08;K(D)) &#x548C;&#x5173;&#x95ED;&#x7387; (k(off)) HgTX 1 A19C Cy5 &#x5BF9;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x83B7;&#x5F97;&#x4E0E;&#x7279;&#x6B8A;&#x548C;&#x5DEE;&#x522B;&#x5F85;&#x9047;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x88AB;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4F7F;&#x7528;&#x653E;&#x5C04;&#x6027;&#x7898;&#x6807;&#x8BB0; HgTX(1) &#x6A21;&#x62DF;&#x7684;&#x76F8;&#x540C;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x8FDB;&#x884C;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;

&#x8D85;&#x7075;&#x654F;&#x836F;&#x7406;&#x7684;&#x7279;&#x5F81;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x6027;&#x94BE;&#x901A;&#x9053; 1.3 K (V) &#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;

The determination of pharmacologically relevant constants is crucial in order to understand the effects of compounds interacting with various membrane receptors. In this report we study a venom component of the Central American scorpion Centruroides limbatus, a short peptide termed hongotoxin(1) (HgTX(1)), which specifically binds to the voltage-gated potassium channel K(V)1.3 at a molecular stoichiometry of 1:1. A toxin analogue (HgTX(1)-A19C) was subjected to fluorescence labelling studies with Cy5. Utilising an ultrasensitive microscopic method (single-dye tracing; SDT) we were able to directly visualise HgTX(1)-A19C-Cy5 binding to the voltage-gated potassium channel K(V)1.3 on Jurkat cells at the single molecule level. For the first time, this approach allowed the determination of both the dissociation constant (K(D)) and the off-rate (k(off)) of HgTX(1)-A19C-Cy5 on living cells. In order to validate this novel approach, the data obtained with SDT were correlated to radioligand binding studies performed under identical conditions using a radioiodinated HgTX(1) analogue.

Ultrasensitive pharmacological characterisation of the voltage-gated potassium channel K(V)1.3 studied by single-molecule fluorescence microscopy.

La d&#xE9;termination des constantes pharmacologiquement pertinentes est cruciale pour comprendre les effets de compos&#xE9;s interagissant avec des r&#xE9;cepteurs membranaires diff&#xE9;rents. Dans ce rapport, nous &#xE9;tudions une composante de venin de l&#x26;#39;Am&#xE9;rique centrale Centruroides limbatus scorpion, un peptide court hongotoxin appel&#xE9; (1) (HgTX (1)), qui se lie sp&#xE9;cifiquement &#xE0; la voltage-d&#xE9;pendants des canaux potassiques K (V) 1.3 &#xE0; une stoechiom&#xE9;trie mol&#xE9;culaire de 1:1. Un analogue de la toxine (HgTX (1)-A19C) a &#xE9;t&#xE9; soumis &#xE0; des &#xE9;tudes de marquage par fluorescence avec Cy5. Utilisant une m&#xE9;thode ultrasensible microscopique (un seul colorant de tra&#xE7;age; SDT), nous avons pu visualiser directement HgTX (1)-A19C-Cy5 liaison &#xE0; la voltage-d&#xE9;pendants des canaux potassiques K (V) 1.3 sur les cellules Jurkat &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de la mol&#xE9;cule unique. Pour la premi&#xE8;re fois, cette approche a permis la d&#xE9;termination de la constante de dissociation &#xE0; la fois (K (D)) et le hors-taux (k (off)) de HgTX (1)-A19C-Cy5 sur des cellules vivantes. Afin de valider cette nouvelle approche, les donn&#xE9;es obtenues avec traitement sp&#xE9;cial et diff&#xE9;renci&#xE9; ont &#xE9;t&#xE9; corr&#xE9;l&#xE9;s &#xE0; des &#xE9;tudes de radioligands effectu&#xE9;es dans des conditions identiques en utilisant une radioiod&#xE9;e HgTX (1) analogique.

Ultrasensible Caract&#xE9;risation pharmacologique du voltage-d&#xE9;pendants des canaux potassiques K (V) 1,3 &#xE9;tudi&#xE9;e par une seule mol&#xE9;cule de microscopie de fluorescence

Ultrasensitive pharmakologische Charakterisierung des spannungsgesteuerten Kaliumkanal K (V) 1.3 von Einzelmolek&#xFC;l-Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht.

La determinazione delle costanti farmacologicamente rilevanti &egrave; cruciale per capire gli effetti di composti interagisce con diversi recettori di membrana. In questa relazione che si studiano un componente del veleno dello Scorpione Centruroides limbatus centroamericano, un corto peptide chiamato hongotoxin(1) (HgTX(1)), che si lega in modo specifico per il canale del potassio voltaggio-dipendente K (V) 1.3 presso una stechiometria molecolare di 1:1. Un analogo di tossina (HgTX(1)-A19C) &egrave; stato sottoposto a fluorescenza etichettatura studi con Cy5. Utilizzando un metodo ultrasensibile microscopico (traccia singola-colorante; SDT) siamo stati in grado di visualizzare direttamente HgTX (1) - A19C - Cy5 vincolante per il potassio voltaggio-dipendenti canale K (V) 1.3 su cellule Jurkat a livello di singola molecola. Per la prima volta, questo approccio ha permesso la determinazione di entrambi la costante di dissociazione (K(D)) e l&#39;off-rate (k(off)) di HgTX (1) - A19C - Cy5 su cellule viventi. Al fine di convalidare questo nuovo approccio, i dati ottenuti con SDT erano correlati a radioattivo associazione studi eseguiti in condizioni identiche, utilizzando un analogo di HgTX(1) radioiodinated.

Ultrasensibile caratterizzazione farmacologica della scanalatura tensione-gated potassio K (V) 1.3 studiato da microscopia di fluorescenza di singola molecola.

&#x85AC;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x5B9A;&#x6570;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x306F;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x7406;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4E2D;&#x592E;&#x30A2;&#x30E1;&#x30EA;&#x30AB;&#x306E;&#x30B5;&#x30BD;&#x30EA;&#x30BB;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EB;&#x30ED;&#x30A4;&#x30C7;&#x30B9;&#x5C5E;limbatus&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x91CF;&#x8AD6;&#x3067;&#x3001;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;K&#xFF08;V&#xFF09;1.3&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x77ED;&#x3044;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;hongotoxin&#xFF08;1&#xFF09;&#xFF08;HgTX&#xFF08;1&#xFF09;&#xFF09;&#x306E;&#x6BD2;&#x6210;&#x5206;&#x3092;&#x5B66;&#x3076;1:1&#x3002;&#x6BD2;&#x7D20;&#x30A2;&#x30CA;&#x30ED;&#x30B0;&#xFF08;HgTX&#xFF08;1&#xFF09;-A19C&#xFF09;&#x304C;Cy5&#x3067;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x8D85;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x6CD5;&#xFF08;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x67D3;&#x6599;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B9;&#x3001;SDT&#xFF09;&#x3092;&#x6D3B;&#x304B;&#x3057;&#x305F;&#x6211;&#x3005;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;Jurkat&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;K&#xFF08;V&#xFF09;1.3&#x306B;HgTX&#xFF08;1&#xFF09;-A19C-Cy5&#x3092;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x521D;&#x3081;&#x3066;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x89E3;&#x96E2;&#x5B9A;&#x6570;&#xFF08;K&#xFF08;D&#xFF09;&#xFF09;&#x3068;HgTX&#x306E;&#x30AA;&#x30D5;&#x7387;&#xFF08;K&#xFF08;&#x30AA;&#x30D5;&#xFF09;&#xFF09;&#xFF08;1&#xFF09;-A19C-Cy5&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x306F;&#x3001;SDT&#x3067;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x653E;&#x5C04;&#x6027;&#x30E8;&#x30A6;&#x7D20;HgTX&#xFF08;1&#xFF09;&#x30A2;&#x30CA;&#x30ED;&#x30B0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x540C;&#x4E00;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x653E;&#x5C04;&#x6027;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x8A66;&#x9A13;&#x306B;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;

&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;K&#xFF08;V&#xFF09;1.3&#x306E;&#x8D85;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x85AC;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x7814;&#x7A76;

Pharmacologically &#xAD00;&#xB828; &#xC0C1;&#xC218; &#xACB0;&#xC815;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB9C9; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC640; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC774;&#xD574; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC911;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACF5;&#xBD80; Centruroides limbatus &#xC911;&#xC559; &#xC544;&#xBA54;&#xB9AC;&#xCE74; &#xC804;&#xAC08;&#xC758; &#xB3C5;&#xC774; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xB294;&#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9E7;&#xC740; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB098; hongotoxin(1) (HgTX(1)), &#xD2B9;&#xD788; 1: 1&#xC758; &#xBD84;&#xC790; stoichiometry&#xC5D0;&#xC11C; &#xC804;&#xC555; &#xAC1C;&#xD3D0; &#xCE7C;&#xB968; &#xCC44;&#xB110; K (V) 1.3 &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3C5; &#xC18C; &#xC544;&#xB0A0;&#xB85C;&#xADF8; (HgTX(1)-A19C) &#xD615;&#xAD11; &#xB77C;&#xBCA8; Cy5 &#xC5F0;&#xAD6C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC774; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD65C;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#x78C1; &#xBBF8;&#xC138;&#xD55C; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; (&#xB2E8;&#xC77C; &#xC5FC;&#xB8CC; &#xCD94;&#xC801;; SDT) &#xC9C1;&#xC811; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654; HgTX (1)-A19C-Cy5 &#xC804;&#xC555; &#xAC1C;&#xD3D0; &#xCE7C;&#xB968; &#xCC44;&#xB110; K (V) 1.3 &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; Jurkat &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCC98;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xC811;&#xADFC; &#xD5C8;&#xC6A9; (K(D))&#xC640; &#xC624;&#xD504;-&#xC18D;&#xB3C4; (HgTX (1)-A19C-Cy5 &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; k(off)) &#xBAA8;&#xB450;&#xB294; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC0C1;&#xC218; &#xACB0;&#xC815;. &#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; SDT&#xB85C; &#xC5BB;&#xC740; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; radioligand radioiodinated HgTX(1) &#xC544;&#xB0A0;&#xB85C;&#xADF8;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD558; &#xC0C1;&#xAD00; &#xD588;&#xB2E4;.

&#x78C1; &#xC57D;&#xB9AC; &#xBB18;&#xC0AC;&#xAC00; &#xC804;&#xC555; &#xAC1C;&#xD3D0; &#xCE7C;&#xB968; &#xCC44;&#xB110; K (V) 1.3&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACF5;&#xBD80;.

La determinaci&#xF3;n de las constantes farmacol&#xF3;gicamente relevantes es crucial para comprender los efectos de los compuestos que interact&#xFA;an con receptores de membrana diferentes. En este informe se estudia un componente de veneno de la Am&#xE9;rica Central Centruroides limbatus escorpi&#xF3;n, una hongotoxin p&#xE9;ptido corto llamado (1) (HgTX (1)), que se une espec&#xED;ficamente a la dependiente de voltaje del canal de potasio K (V) 1.3 en una estequiometr&#xED;a molecular de 1:1. Un an&#xE1;logo de la toxina (HgTX (1)-A19C) se someti&#xF3; a estudios de fluorescencia de etiquetado con Cy5. Utilizando un m&#xE9;todo ultrasensible microsc&#xF3;pico (de un solo tinte de rastreo; TED), pudimos visualizar directamente HgTX (1)-A19C-Cy5 uni&#xF3;n a la dependiente de voltaje del canal de potasio K (V) 1,3 en las c&#xE9;lulas Jurkat en el nivel de mol&#xE9;culas individuales. Por primera vez, este enfoque permite la determinaci&#xF3;n tanto de la constante de disociaci&#xF3;n (K (D)) y la velocidad de disociaci&#xF3;n (K (apagado)) de HgTX (1)-A19C-Cy5 en c&#xE9;lulas vivas. A fin de validar este nuevo enfoque, los datos obtenidos con el trato especial y diferenciado se correlacionaron con los estudios de uni&#xF3;n de radioligandos realizados en condiciones id&#xE9;nticas, usando un radioyodada HgTX (1) anal&#xF3;gica.

Caracterizaci&#xF3;n ultrasensible farmacol&#xF3;gico de la dependiente de voltaje del canal de potasio K (V) 1,3 Estudiado por una sola mol&#xE9;cula de microscop&#xED;a de fluorescencia

&#x6CBF; neurites PC12 &#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x6CCC;&#x56CA;&#x6CE1;&#x7684;&#x8D29;&#x8FD0;&#x88AB;&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x7684; 2D &#x548C; 3D &#x5B9E;&#x65F6;&#x6210;&#x50CF;&#x4F7F;&#x7528;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x3002;&#x56CA;&#x6CE1;&#x8FD0;&#x52A8;&#x6CBF;&#x7740;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x9014;&#x5F84;&#x662F;&#x76F4;&#x63A5;&#x770B;&#x5230;&#x3002;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E2A;&#x8DEF;&#x5F84;&#x7684;&#x91CD;&#x53E0;&#x90E8;&#x5206;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4E9A;&#x6CE2;&#x957F;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x6210;&#x50CF;&#x57FA;&#x7840;&#x9AA8;&#x67B6;&#x957F;&#x4E1D;&#x3002;&#x8FDE;&#x7EED;&#x56CA;&#x6CE1;&#x8FD0;&#x8F93;&#x4E2D;&#x65AD;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#x8FD0;&#x52A8;&#x4E0E;&#x968F;&#x4E4B;&#x800C;&#x6765;&#x7684;&#x901A;&#x8DEF;&#x53D8;&#x5316;&#x7684;&#x65F6;&#x671F;&#x3002;&#x7EDF;&#x8BA1;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4E2D;&#x65AD;&#x4E86;&#x6CBF;&#x706F;&#x4E1D;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A;&#x9A6C;&#x8FBE;&#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x4E0A;&#x4E0B;&#x6587;&#x4E2D;&#x4E5F;&#x6709;&#x9650;&#x7684; processivity &#x968F;&#x673A;&#x5206;&#x5E03;&#x3002;&#x6269;&#x6563;&#x8FD0;&#x52A8;&#x671F;&#x95F4;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4FBF;&#x5229;&#x4E0E;&#x79EF;&#x6781;&#x8FD0;&#x8F93;&#x56CA;&#x6CE1;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x9891;&#x7E41;&#x7684;&#x534F;&#x4F1A;&#x548C;&#x56CA;&#x6CE1;&#x7684;&#x9762;&#x5B54;&#x518D;&#x770B;&#x5230;&#x4E86;&#x4E00;&#x8D2F;&#xFF0C;&#x6307;&#x5411;&#x56CA;&#x6CE1; cotransport &#x529F;&#x80FD;&#x76F8;&#x5173;&#x6027;&#x3002;

&#x53EF;&#x89C6;&#x5316;&#x7684;&#x56CA;&#x6CE1;&#x8FD0;&#x8F93;&#x6CBF;&#x7EBF;&#x548C;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x9014;&#x5F84;&#xFF0C;&#x5728; neurites &#x7684;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;

Trafficking of secretory vesicles along neurites of PC12 cells was visualized by 2D and 3D real-time imaging using fluorescence microscopy. Vesicle motion along distinct pathways was directly seen. From an overlay of individual pathways, the underlying cytoskeletal filament could be imaged at a subwavelength resolution. Continuous vesicle transport was interrupted by periods of diffusive motion with concomitant pathway changes. Statistical analysis shows that such interruptions were distributed stochastically along the filament, indicating a limited processivity of motor proteins also in a cellular context. Periods of diffusive motion facilitated the interaction with actively transported vesicles. Frequent associations and dissociations of vesicles have been observed consistently, pointing to a functional relevance of vesicle cotransport.

Visualization of vesicle transport along and between distinct pathways in neurites of living cells.

La traite des v&#xE9;sicules de s&#xE9;cr&#xE9;tion le long de neurites des cellules PC12 a &#xE9;t&#xE9; visualis&#xE9;e par 2D et 3D en temps r&#xE9;el d&#x26;#39;imagerie par microscopie &#xE0; fluorescence. Mouvement des v&#xE9;sicules le long des voies distinctes a &#xE9;t&#xE9; vu directement. De la superposition des parcours individuels, le filament sous-jacente du cytosquelette pourrait &#xEA;tre imag&#xE9;e &#xE0; une r&#xE9;solution longueur d &#x26;#39;onde. Le transport des v&#xE9;sicules en continu a &#xE9;t&#xE9; interrompue par des p&#xE9;riodes de mouvement diffusif avec des changements de parcours concomitants. L&#x26;#39;analyse statistique montre que ces interruptions ont &#xE9;t&#xE9; distribu&#xE9;s stochastiquement le long du filament, indiquant une processivit&#xE9; limit&#xE9; de prot&#xE9;ines motrices aussi dans un contexte cellulaire. Les p&#xE9;riodes de mouvement diffusif a facilit&#xE9; l&#x26;#39;interaction avec des v&#xE9;sicules activement transport&#xE9;s. Les associations et les dissociations fr&#xE9;quentes de v&#xE9;sicules ont &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;es de mani&#xE8;re coh&#xE9;rente, pointant vers une pertinence fonctionnelle de la v&#xE9;sicule cotransport.

Visualisation de transport v&#xE9;siculaire le long et entre voies distinctes dans neurites de cellules vivantes

Visualisierung von Vesikeltransport entlang und zwischen verschiedenen Pfaden in Neuriten von lebenden Zellen.

Traffico di vescicole secretorie lungo neuriti delle cellule PC12 &egrave; stato visualizzato da 2D e 3D in tempo reale utilizzando la microscopia di fluorescenza di imaging. Movimento della vescicola lungo percorsi distinti &egrave; stato visto direttamente. Da una sovrapposizione di percorsi individuali, il filamento del citoscheletro sottostante potrebbe essere imaged con una risoluzione di subwavelength. Trasporto continuo vescicola &egrave; stato interrotto da periodi di movimento diffusivo con modifiche di percorso concomitante. Analisi statistica dimostra che tali interruzioni sono state distribuite casualmente lungo il filamento, che indica un processivity limitato di proteine motrici anche in un contesto cellulare. Periodi di movimento diffusivo agevolato l&#39;interazione con le vescicole attivamente trasportate. Frequenti associazioni e dissociazioni di vescicole sono stati osservati costantemente, che punta a una rilevanza funzionale di cotrasporto vescicola.

Visualizzazione di trasporto vescicola lungo e tra percorsi distinti in neuriti delle cellule viventi.

PC12&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x7A81;&#x8D77;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6CCC;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;2D&#x3068;3D&#x306E;&#x30EA;&#x200B;&#x200B;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x76F4;&#x63A5;&#x898B;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x30AA;&#x30FC;&#x30D0;&#x30FC;&#x30EC;&#x30A4;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x57FA;&#x790E;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x9AA8;&#x683C;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x30B5;&#x30D6;&#x6CE2;&#x9577;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x3067;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9023;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A;&#x5C0F;&#x80DE;&#x8F38;&#x9001;&#x304C;&#x4F75;&#x7528;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3068;&#x62E1;&#x6563;&#x904B;&#x52D5;&#x306E;&#x30D4;&#x30EA;&#x30AA;&#x30C9;&#x3067;&#x4E2D;&#x65AD;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D71;&#x8A08;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x4E2D;&#x65AD;&#x306F;&#x3001;&#x643A;&#x5E2F;&#x96FB;&#x8A71;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x3082;&#x3001;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x9650;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#xFF08;processivity&#xFF09;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3001;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;&#x78BA;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x5206;&#x5E03;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x62E1;&#x6563;&#x904B;&#x52D5;&#x306E;&#x671F;&#x9593;&#x306F;&#x3001;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306B;&#x8F38;&#x9001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x983B;&#x7E41;&#x306A;&#x56E3;&#x4F53;&#x3084;&#x89E3;&#x96E2;&#x306F;&#x3001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x5171;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x95A2;&#x9023;&#x6027;&#x3092;&#x6307;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x7A81;&#x8D77;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x5C0F;&#x80DE;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x53EF;&#x8996;&#x5316;

PC12 &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; neurites &#xB530;&#xB77C; &#xBD84; vesicles&#xC758; &#xBC00;&#xB9E4; 2D &#xBC0F; 3D &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC00;&#xC2DC;&#xD654; &#xD588;&#xB2E4;. &#xACE0;&#xC720; &#xACBD;&#xB85C; &#xB530;&#xB77C; &#xAE30; &#xBAA8;&#xC158; &#xC9C1;&#xC811; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xAC1C;&#xBCC4; &#xACBD;&#xB85C; &#xC624;&#xBC84;&#xB808;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAE30;&#xBCF8; cytoskeletal &#xD544; &#xB77C; &#xBA58; &#xD2B8; subwavelength &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBA87; &#xAD70;&#xB370; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5F0;&#xC18D; &#xAE30; &#xC804;&#xC1A1; &#xBD80;&#xCC28;&#xC801;&#xC778; &#xD1B5;&#xB85C; &#xBCC0;&#xACBD;&#xC73C;&#xB85C; &#xD37C;&#xC9C0;&#xB294; &#xBAA8;&#xC158;&#xC758; &#xAE30;&#xAC04;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xB2E8; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD1B5;&#xACC4; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAC19;&#xC740; &#xC911;&#xB2E8; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; &#xCEE8;&#xD14D;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB610;&#xD55C; &#xBAA8;&#xD130; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC81C;&#xD55C; processivity &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBA58;&#xC744; &#xB530;&#xB77C; stochastically &#xBC30;&#xD3EC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD37C;&#xC9C0;&#xB294; &#xBAA8;&#xC158; &#xAE30;&#xAC04; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xC1A1;&#xB41C; &#xC18C;&#xD3EC;&#xC640;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4;. &#xC790;&#xC8FC; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558; &#xACE0; dissociations vesicles&#xC758; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC77C;&#xAD00; &#xB418; &#xAC8C;, &#xAE30; cotransport&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xAD00;&#xB828;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xB9AC;&#xD0A4;&#xB294;.

&#xC18C;&#xD3EC; &#xC6B4;&#xC1A1; &#xB530;&#xB77C; &#xD558; &#xACE0; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; neurites&#xC5D0; &#xACE0;&#xC720;&#xD55C; &#xACBD;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC774; &#xC2DC;&#xAC01;&#xD654;.

El tr&#xE1;fico de ves&#xED;culas secretoras a lo largo de neuritas de las c&#xE9;lulas PC12 se visualiz&#xF3; en 2D y 3D en tiempo real de im&#xE1;genes mediante microscop&#xED;a de fluorescencia. Movimiento de las ves&#xED;culas a lo largo de v&#xED;as diferentes, se ve directamente. Desde una superposici&#xF3;n de itinerarios individuales, el filamento del citoesqueleto subyacente podr&#xED;a ser reflejado en una resoluci&#xF3;n subwavelength. El transporte de ves&#xED;culas continua fue interrumpido por per&#xED;odos de movimiento difusivo con cambios concomitantes de la v&#xED;a. El an&#xE1;lisis estad&#xED;stico muestra que tales interrupciones fueron distribuidos estoc&#xE1;sticamente lo largo del filamento, lo que indica una procesividad limitado de prote&#xED;nas motoras tambi&#xE9;n en un contexto celular. Los per&#xED;odos de movimiento difusivo facilit&#xF3; la interacci&#xF3;n con las ves&#xED;culas activamente transportados. Asociaciones y disociaciones frecuentes de las ves&#xED;culas se han observado consistentemente, apuntando a una relevancia funcional de la ves&#xED;cula cotransporte.

La visualizaci&#xF3;n de la ves&#xED;cula de transporte lo largo y entre distintas v&#xED;as de neuritas de las c&#xE9;lulas vivas

&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8FD0;&#x52A8;&#x8F68;&#x8FF9;&#x5206;&#x6790;&#x662F;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x96C6;&#x4E0E;&#x591A;&#x4E2A;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x8499;&#x7279;&#x5361;&#x7F57;&#x6A21;&#x62DF;&#x7EFC;&#x5408;&#x6BD4;&#x8F83;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5B83;&#x5141;&#x8BB8;&#x5B9A;&#x91CF;&#x6570;&#x636E;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;&#x7279;&#x522B;&#x662F;&#x6BCF;&#x5F53;&#x5206;&#x6790;&#x5904;&#x7406;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x6A21;&#x5F0F;&#x662F;&#x4E0D;&#x53EF;&#x884C;&#x7684;&#x3002;&#x6A21;&#x62DF;&#x79BB;&#x6563;&#x53C2;&#x6570;&#x7A7A;&#x95F4;&#x4E0A;&#x6267;&#x884C;&#xFF0C;&#x7531;&#x4E00;&#x4E2A;&#x975E;&#x53C2;&#x6570;&#x68C0;&#x9A8C;&#x7EDF;&#x8BA1;&#x91CF;&#x4E0E;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7ED3;&#x679C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x8BC4;&#x4F30;&#x7684;&#x6982;&#x7387;&#x6709;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6570;&#x636E;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x53C2;&#x6570;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x7684; p-&#x503C;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x4E3A;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x4E09;&#x79CD;&#x5178;&#x578B;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF1A; &#x6211;)&#xFF0C;&#x514D;&#x8D39;&#x5E03;&#x6717;&#x8FD0;&#x52A8;&#x7684;&#x793A;&#x8E2A;&#x5242;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E8C;&#xFF09;&#xFF0C;&#x5408;&#x6269;&#x6563;&#x4E2D;&#x7684;&#x5E73;&#x65B9;&#x548C;&#x548C;&#x7B2C;&#x4E09;&#x6B21;&#x5B9A;&#x671F;&#x7F51;&#x793A;&#x8E2A;&#x5242;)&#x3001; &#x77AC;&#x6001;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x6162;&#x6162;&#x6269;&#x6563;&#x7ED3;&#x6784;&#x793A;&#x8E2A;&#x5242;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x63CF;&#x7ED8; p &#x503C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6A21;&#x578B;&#x53C2;&#x6570;&#x7684;&#x51FD;&#x6570;&#xFF0C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8F7B;&#x677E;&#x8BC6;&#x522B;&#x6700;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x53C2;&#x6570;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x4F46;&#x4E5F;&#x6062;&#x590D;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F9D;&#x8D56;&#x548C;&#x542B;&#x7CCA;&#x4E4B;&#x5904;&#xFF0C;&#x662F;&#x5F88;&#x96BE;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x6807;&#x51C6;&#x914D;&#x4EF6;&#x4F8B;&#x7A0B;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x8FDB;&#x884C;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x6790;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x83B7;&#x5F97; glycosylphosphatidylinositol &#x86CB;&#x767D; CD59 &#x4EBA;&#x7C7B; T24 &#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#x3002;

&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8DDF;&#x8E2A;&#x6570;&#x636E;&#x7684;&#x5168;&#x9762;&#x6D4B;&#x8BD5;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x8499;&#x7279;&#x5361;&#x7F57;&#x6A21;&#x62DF;&#x7684;&#x901A;&#x7528;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

We propose here an approach for the analysis of single-molecule trajectories which is based on a comprehensive comparison of an experimental data set with multiple Monte Carlo simulations of the diffusion process. It allows quantitative data analysis, particularly whenever analytical treatment of a model is infeasible. Simulations are performed on a discrete parameter space and compared with the experimental results by a nonparametric statistical test. The method provides a matrix of p-values that assess the probability for having observed the experimental data at each setting of the model parameters. We show the testing approach for three typical situations observed in the cellular plasma membrane: i), free Brownian motion of the tracer, ii), hop diffusion of the tracer in a periodic meshwork of squares, and iii), transient binding of the tracer to slowly diffusing structures. By plotting the p-value as a function of the model parameters, one can easily identify the most consistent parameter settings but also recover mutual dependencies and ambiguities which are difficult to determine by standard fitting routines. Finally, we used the test to reanalyze previous data obtained on the diffusion of the glycosylphosphatidylinositol-protein CD59 in the plasma membrane of the human T24 cell line.

Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.

Nous proposons ici une approche pour l&#x26;#39;analyse des trajectoires d&#x26;#39;une seule mol&#xE9;cule qui est bas&#xE9; sur une comparaison d&#xE9;taill&#xE9;e des donn&#xE9;es exp&#xE9;rimentales &#xE9;tablies un avec de multiples simulations de Monte Carlo du processus de diffusion. Il permet l&#x26;#39;analyse quantitative des donn&#xE9;es, en particulier lorsque le traitement analytique d&#x26;#39;un mod&#xE8;le est infaisable. Des simulations sont effectu&#xE9;es sur un espace param&#xE8;tre discret et compar&#xE9;s avec les r&#xE9;sultats exp&#xE9;rimentaux par un test statistique non param&#xE9;trique. Proc&#xE9;d&#xE9; fournit une matrice de valeurs p qui &#xE9;valuent la probabilit&#xE9; d&#x26;#39;avoir observ&#xE9; les donn&#xE9;es exp&#xE9;rimentales &#xE0; chaque r&#xE9;glage des param&#xE8;tres du mod&#xE8;le. Nous montrons l&#x26;#39;approche de test pour les trois situations typiques observ&#xE9;s dans la membrane plasmique cellulaire: i), sans mouvement brownien du traceur, ii), la diffusion hop du traceur dans un maillage p&#xE9;riodique de carr&#xE9;s, et iii), la liaison passag&#xE8;re du traceur aux structures de diffusion lente. En tra&#xE7;ant la p-valeur en fonction des param&#xE8;tres du mod&#xE8;le, on peut facilement identifier les param&#xE8;tres les plus coh&#xE9;rentes, mais aussi de r&#xE9;cup&#xE9;rer les d&#xE9;pendances mutuelles et les ambigu&#xEF;t&#xE9;s qui sont difficiles &#xE0; d&#xE9;terminer par la norme des programmes d&#x26;#39;ajustage. Enfin, nous avons utilis&#xE9; le test de r&#xE9;analyser les donn&#xE9;es pr&#xE9;c&#xE9;dentes obtenues sur la diffusion de la CD59 glycosylphosphatidylinositol-prot&#xE9;ines dans la membrane plasmique de la ligne T24 cellule humaine.

Analyse des donn&#xE9;es de suivi Atout unique mol&#xE9;cule par des tests complets contre simulations de Monte Carlo

Wir bieten hier einen Ansatz f&uuml;r die Analyse der Einzelmolek&uuml;l-Trajektorien basiert auf einen umfassenden Vergleich eines experimentellen Daten-Sets mit mehreren Monte Carlo-Simulationen von den Diffusionsprozess. Es erm&ouml;glicht quantitative Datenanalyse, besonders wenn der analytischen Behandlung eines Modells nicht durchf&uuml;hrbar ist. Simulationen sind auf eine diskrete Parameterraum durchgef&uuml;hrt und im Vergleich mit den experimentellen Ergebnissen durch eine nichtparametrische statistische Test. Die Methode stellt eine Matrix p-Werte, die die Wahrscheinlichkeit f&uuml;r die experimentellen Daten auf jede Einstellung die Modellparameter beobachtet haben beurteilen. Zeigen wir den Testansatz f&uuml;r drei typische Situationen in der Plasma-Zellmembran beobachtet: ich), kostenlose Brownsche Bewegung des Tracers, Ii), hop Verbreitung des Tracers im eine periodische Netzwerk von Quadraten und Iii), vor&uuml;bergehende Bindung des Tracers zu langsam Verbreitung Strukturen. Durch Auftragen den p-Wert als Funktion der die Modellparameter, kann man leicht identifizieren die konsistenten Parametereinstellungen aber auch erholen gegenseitigen Abh&auml;ngigkeiten und Mehrdeutigkeiten, die schwierig zu bestimmen, von Standardausstattung-Routinen sind. Schlie&szlig;lich haben wir den Test um zur&uuml;ck erhaltenen Daten &uuml;ber die Verbreitung der CD59 Glykosylphosphatidyl-Protein in der Plasmamembran von der menschlichen T24-Zelllinie zu diagnostizieren.

Vielseitige Analyse der Einzelmolek&uuml;l-Tracking-Daten durch umfassende Tests gegen Monte-Carlo-Simulationen.

Proponiamo qui un approccio per l&#39;analisi della singola molecola traiettorie che si basa su un confronto completo di un set di dati sperimentali con molteplici simulazioni Monte Carlo del processo di diffusione. Permette analisi quantitativa dei dati, specialmente ogni volta che un trattamento analitico di un modello &egrave; praticamente impossibile. Simulazioni vengono eseguite su uno spazio di parametro discreto e confrontati con i risultati sperimentali di un test statistico non parametrico. Il metodo fornisce una matrice di valori di p che valutano la probabilit&agrave; per aver osservato i dati sperimentali a ciascuna impostazione dei parametri del modello. Mostriamo l&#39;approccio test per tre situazioni tipiche osservati nella membrana del plasma cellulare: ho), libero moto browniano del tracciante, ii), hop diffusione del tracciante in un reticolo periodico di piazze e iii), vincolante del tracciante per lentamente diffondendo strutture transienti. Riportando il p-valore in funzione dei parametri del modello, si pu&ograve; facilmente identificare le impostazioni dei parametri pi&ugrave; coerente ma anche recuperare le dipendenze reciproche e ambiguit&agrave; che sono difficili da determinare dalle routine di montaggio standard. Infine, abbiamo usato il test per rianalizzare i dati precedenti ottenuti sulla diffusione del CD59 glicosilfosfatidilinositolo-proteina nella membrana del plasma della linea di cellule umana T24.

Versatile analisi della singola molecola rilevamento dati di test completa contro simulazioni Monte Carlo.

&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x62E1;&#x6563;&#x904E;&#x7A0B;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30E2;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AB;&#x30EB;&#x30ED;&#xB7;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x5305;&#x62EC;&#x7684;&#x306A;&#x6BD4;&#x8F03;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x8ECC;&#x8DE1;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x51E6;&#x7406;&#x304C;&#x4E0D;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x305F;&#x3073;&#x306B;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x306A;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x96E2;&#x6563;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x7A7A;&#x9593;&#x3067;&#x5B9F;&#x884C;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30CE;&#x30F3;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x7D71;&#x8A08;&#x7684;&#x691C;&#x5B9A;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x5404;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x3067;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x78BA;&#x7387;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;p&#x5024;&#x306E;&#x884C;&#x5217;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;3&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5178;&#x578B;&#x7684;&#x306A;&#x72B6;&#x6CC1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC;&#x306E;&#xFF09;i&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC;&#x306E;&#x81EA;&#x7531;&#x306A;&#x30D6;&#x30E9;&#x30A6;&#x30F3;&#x904B;&#x52D5;&#x3001;ii&#xFF09;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6B63;&#x65B9;&#x5F62;&#x306E;&#x5B9A;&#x671F;&#x7684;&#x306A;&#x7DB2;&#x76EE;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC;&#x306E;&#x30DB;&#x30C3;&#x30D7;&#x62E1;&#x6563;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;iii&#x3001;&#x4E00;&#x6642;&#x7684;&#x306A;&#x7D50;&#x5408;&#x5F90;&#x3005;&#x306B;&#x62E1;&#x6563;&#x3059;&#x308B;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x3002;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x3068;&#x3057;&#x3066;p&#x5024;&#x3092;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308B;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x6A19;&#x6E96;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30C1;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x56F0;&#x96E3;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F9D;&#x5B58;&#x95A2;&#x4FC2;&#x3084;&#x3042;&#x3044;&#x307E;&#x3044;&#x3055;&#x3092;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;T24&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;CD59&#x306E;&#x62E1;&#x6563;&#x3067;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x518D;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30E2;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AB;&#x30EB;&#x30ED;&#xB7;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x5305;&#x62EC;&#x7684;&#x306A;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30C8;&#x30E9;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x6C4E;&#x7528;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x5206;&#x6790;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5EC;&#xAE30; &#xD655;&#xC0B0; &#xACFC;&#xC815;&#xC758; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBAAC;&#xD14C; &#xCE74;&#xB97C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC138;&#xD2B8;&#xC758; &#xD3EC;&#xAD04;&#xC801;&#xC778; &#xBE44;&#xAD50;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xADA4;&#xB3C4;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788; &#xBAA8;&#xB378;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xCE58;&#xB8CC;&#xB294; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC5B8;&#xC81C; &#xB4E0; &#xC9C0; &#xC591;&#xC801; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xC774;&#xC0B0; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218; &#xACF5;&#xAC04;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xBA70; &#xBE44;&#xD328;&#xB77C;&#xBA54;&#xD2B8;&#xB9AD; &#xD1B5;&#xACC4; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB85C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xD3C9;&#xAC00; &#xBAA8;&#xB378; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218;&#xC758; &#xAC01; &#xC124;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558;&#xB294; &#xB370;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD655;&#xB960; p &#xAC12;&#xC758; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;: &#xB098;), &#xBB34;&#xB8CC; &#xBE0C;&#xB77C;&#xC6B4; &#xBAA8;&#xC158; &#xCD94;&#xC801; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; ii&#xC758;), &#xD649; &#xC0AC;&#xAC01;&#xD615;&#xACFC; iii&#xC758; &#xC815;&#xAE30; &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0; &#xCD94;&#xC801; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC758; &#xD655;&#xC0B0;), &#xCC9C;&#xCC9C;&#xD788; &#xD655;&#xC0B0; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xCD94;&#xC801; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xACFC;&#xB3C4;. &#xBAA8;&#xB378; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218; &#xD568;&#xC218;&#xB85C; p &#xAC12;&#xC744; &#xADF8;&#xB824;&#xC11C; &#xD558;&#xB098; &#xC27D;&#xAC8C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xAD00;&#xC131; &#xC788;&#xB294; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218; &#xC124;&#xC815;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB610;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC885;&#xC18D;&#xC131; &#xBC0F; &#xD45C;&#xC900; &#xD53C;&#xD305; &#xB8E8;&#xD2F4;&#xC73C;&#xB85C; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xBAA8;&#xD638;&#xD568;&#xC744; &#xBCF5;&#xAD6C;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; glycosylphosphatidylinositol &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; CD59 &#xC778;&#xAC04;&#xC758; T24 &#xC140; &#xB77C;&#xC778;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC758; &#xD655;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xC774;&#xC804; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xB2E4;&#xC2DC; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558;.

&#xBAAC;&#xD14C;&#xCE74;&#xB97C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3EC;&#xAD04;&#xC801;&#xC778; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xCD94;&#xC801; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xBD84;&#xC11D;.

Aqu&#xED; se propone un enfoque para el an&#xE1;lisis de las trayectorias individuales de mol&#xE9;culas que se basa en una comparaci&#xF3;n global de un conjunto de datos experimentales establecidas con varias simulaciones de Monte Carlo del proceso de difusi&#xF3;n. Se permite el an&#xE1;lisis cuantitativo de los datos, sobre todo cada vez que el tratamiento anal&#xED;tico de un modelo no es factible. Las simulaciones se llevan a cabo en un espacio de par&#xE1;metros discretos y se compararon con los resultados experimentales de una prueba estad&#xED;stica no param&#xE9;trica. El m&#xE9;todo proporciona una matriz de valores de p para evaluar la probabilidad de haber observado los datos experimentales en cada ajuste de los par&#xE1;metros del modelo. Se demuestra el enfoque de prueba de tres situaciones t&#xED;picas observadas en la membrana plasm&#xE1;tica celular: i), el movimiento Browniano libre del trazador, ii), la difusi&#xF3;n de saltos del trazador en una malla peri&#xF3;dica de las plazas, y iii), la uni&#xF3;n transitoria del trazador a las estructuras lentamente difusoras. Al graficar el valor de p en funci&#xF3;n de los par&#xE1;metros del modelo, se pueden identificar f&#xE1;cilmente los ajustes de los par&#xE1;metros m&#xE1;s consistentes, sino tambi&#xE9;n recuperar dependencias mutuas y las ambig&#xFC;edades que son dif&#xED;ciles de determinar por rutinas de ajuste est&#xE1;ndar. Por &#xFA;ltimo, se utiliz&#xF3; la prueba para volver a analizar los datos previos obtenidos en la difusi&#xF3;n de la CD59 glicosilfosfatidilinositol-prote&#xED;na en la membrana plasm&#xE1;tica de la l&#xED;nea celular humana T24.

An&#xE1;lisis vers&#xE1;til de datos de seguimiento de una sola mol&#xE9;cula de Pruebas Integral Contra las Simulaciones Monte Carlo

&#x5916;&#x56FD;&#x7684; T &#x6DCB;&#x5DF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x8BC6;&#x522B;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x6700;&#x9002;&#x5E94;&#x6027;&#x514D;&#x75AB;&#x5E94;&#x7B54;&#x3002;&#x5B83;&#x662F;&#x7531;&#x53D7;&#x7279;&#x5B9A; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x4F53; (&#x901A;&#x4EA7;&#x6DA6;&#x76DB;&#xFF09; &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x76F8;&#x5BB9;&#x6297;&#x539F;&#x80BD;&#x4E3B;&#x8981;&#x6027;&#x590D;&#x6742; &#xFF08;&#x62B5;&#x62BC;&#xFF09; &#x4E0A;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x9A71;&#x52A8;&#x7684;&#x3002;&#x5982;&#x679C;&#x751F;&#x4EA7;&#x6027;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4EA4;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x514D;&#x75AB;&#x7A81;&#x89E6;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x7A81;&#x89E6; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x52A8;&#x6001;&#x4E0E; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x4FDD;&#x6301;&#x5F88;&#x5927;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x3001; &#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB; &#xFF08;&#x97F3;&#x54C1;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x901A;&#x4EA7;&#x6DA6;&#x76DB;&#x548C;&#x5176;&#x540C;&#x6E90;&#x62B5;&#x62BC;&#x914D;&#x4F53;&#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x539F;&#x4F4D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x7EFC;&#x5408;&#x4F53;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#x4E0E;&#x6D4B;&#x91CF;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x5927;&#x5E45;&#x589E;&#x52A0; (4-12-&#x6298;&#x53E0;&#xFF09;&#x3002;&#x4E2D;&#x65AD;&#x7684;&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#x626D;&#x8F6C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9AA8;&#x67B6;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7834;&#x574F;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4E92;&#x52A8;&#xFF0C;&#x76F4;&#x63A5;&#x6216;&#x95F4;&#x63A5;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5982;&#x6B64;&#xFF0C;TCR &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x4E3A;&#x62B5;&#x62BC;&#x88AB;&#x5927;&#x5927;&#x63D0;&#x5347;&#x5927;&#x578B;&#x7ED3;&#x679C; &#xFF08;&#x7EA6; 100 &#x500D;&#xFF09; &#x589E;&#x52A0;&#x534F;&#x4F1A;&#x7387;&#xFF0C;&#x4E92;&#x8865;&#x5206;&#x5B50;&#x53D6;&#x5411;&#x548C;&#x805A;&#x7C7B;&#x5206;&#x6790;&#x53EF;&#x80FD;&#x53D1;&#x751F;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x3002;&#x8F85;&#x52A9; T &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;CD4 &#x5206;&#x5B50;&#x62DF;&#x5408;&#x4F5C;&#x5230;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x540C;&#x4E00;&#x62B5;&#x62BC; tcr &#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;CD4 &#x5C01;&#x9501;&#x4E86;&#x7A81;&#x89E6; TCR &#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x6CA1;&#x6709;&#x7834;&#x574F;&#x7A33;&#x5B9A; TCR &#x62B5;&#x62BC;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A; TCR &#x7ED1;&#x5B9A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E; CD4 &#x7684;&#x62B5;&#x62BC;&#x3002;

&#x539F;&#x4F4D; TCR-&#x80BD;-MHC &#x4EA4;&#x4E92;&#x663E;&#x793A;&#x52A0;&#x901F;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3002;

The recognition of foreign antigens by T lymphocytes is essential to most adaptive immune responses. It is driven by specific T-cell antigen receptors (TCRs) binding to antigenic peptide-major histocompatibility complex (pMHC) molecules on other cells. If productive, these interactions promote the formation of an immunological synapse. Here we show that synaptic TCR-pMHC binding dynamics differ significantly from TCR-pMHC binding in solution. We used single-molecule microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET) between fluorescently tagged TCRs and their cognate pMHC ligands to measure the kinetics of TCR-pMHC binding in situ. When compared with solution measurements, the dissociation of this complex was increased significantly (4-12-fold). Disruption of actin polymers reversed this effect, indicating that cytoskeletal dynamics destabilize this interaction directly or indirectly. Nevertheless, TCR affinity for pMHC was significantly elevated as the result of a large (about 100-fold) increase in the association rate, a likely consequence of complementary molecular orientation and clustering. In helper T cells, the CD4 molecule has been proposed to bind cooperatively with the TCR to the same pMHC complex. However, CD4 blockade had no effect on the synaptic TCR affinity, nor did it destabilize TCR-pMHC complexes, indicating that the TCR binds pMHC independently of CD4.

TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.

La reconnaissance des antig&#xE8;nes &#xE9;trangers par les lymphocytes T est indispensable &#xE0; la plupart des r&#xE9;ponses immunitaires adaptatives. Elle est entra&#xEE;n&#xE9;e par des r&#xE9;cepteurs sp&#xE9;cifiques de l&#x26;#39;antig&#xE8;ne des cellules T (TCR) de liaison au complexe d&#x26;#39;histocompatibilit&#xE9; peptide antig&#xE9;nique-major (pMHC) mol&#xE9;cules sur d&#x26;#39;autres cellules. Si productive, ces interactions favorisent la formation d&#x26;#39;une synapse immunologique. Ici, nous montrons que synaptiques TCR-PMHC la dynamique de liaison diff&#xE8;rent consid&#xE9;rablement de TCR-pMHC contraignant en solution. Nous avons utilis&#xE9; une seule mol&#xE9;cule de la microscopie et la fluorescence de transfert d&#x26;#39;&#xE9;nergie par r&#xE9;sonance (FRET) entre TCR marqu&#xE9;es par fluorescence et de leurs ligands apparent&#xE9;s PMHC pour mesurer la cin&#xE9;tique de TCR-pMHC liaison in situ. En comparaison avec mesures de la solution, la dissociation de ce complexe a &#xE9;t&#xE9; augment&#xE9; de mani&#xE8;re significative (de 4 &#xE0; 12 fois). Perturbation des polym&#xE8;res d&#x26;#39;actine a renvers&#xE9; cet effet, indiquant que la dynamique du cytosquelette d&#xE9;stabiliser cette interaction, directement ou indirectement. N&#xE9;anmoins, TCR affinit&#xE9; pour pMHC a &#xE9;t&#xE9; significativement plus &#xE9;lev&#xE9;e que le r&#xE9;sultat d&#x26;#39;une grande (environ 100 fois) augmentation de la vitesse d&#x26;#39;association, une cons&#xE9;quence probable de l&#x26;#39;orientation mol&#xE9;culaire compl&#xE9;mentaire et le clustering. Dans les cellules T auxiliaires, la mol&#xE9;cule CD4 a &#xE9;t&#xE9; propos&#xE9; de lier en collaboration avec le TCR au m&#xEA;me complexe pMHC. Cependant, le blocus CD4 n&#x26;#39;a eu aucun effet sur la synaptique affinit&#xE9; du TCR, et n&#x26;#39;a pas d&#xE9;stabiliser TCR-PMHC complexes, ce qui indique que le TCR se lie pMHC ind&#xE9;pendamment de CD4.

TCR-peptide-CMH Interactions in situ pr&#xE9;sentent des cin&#xE9;tiques acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9;es et une affinit&#xE9; accrue

Die Anerkennung der fremde Antigene von T-Lymphozyten ist wichtig, die adaptive Immunantworten. Es wird durch spezifische T-Zell-Antigenrezeptoren (TCRs) binden an Antigene Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC) Molek&uuml;le auf andere Zellen angetrieben. Wenn produktiv, f&ouml;rdern diese Interaktionen die Bildung von eine immunologische Synapse. Hier zeigen wir, dass synaptische TCR-pMHC Bindung Dynamik von TCR-pMHC Bindung in L&ouml;sung deutlich unterscheiden. Wir verwendeten Einzelmolek&uuml;l-Mikroskopie und Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) zwischen Leuchtstoff markierte TCRs und ihrer Verwandten pMHC-Liganden, um die Kinetik der TCR-pMHC Bindung an Ort und Stelle zu messen. Im Vergleich zu L&ouml;sung Messungen der Dissoziation dieses Komplexes deutlich erh&ouml;ht (4-12-fach). Unterbrechung der Aktin-Polymere umgekehrt dieser Effekt, der darauf hinweist, dass Zytoskelett Dynamik dieser Interaktion direkt oder indirekt zu destabilisieren. Dennoch war TCR Affinit&auml;t f&uuml;r pMHC deutlich erh&ouml;ht, wie das Ergebnis einer gro&szlig;en (ca. 100-fold) zu erh&ouml;hen, in der Vereinigung Rate, eine wahrscheinlich Folge der komplement&auml;re Molekulare Orientierung und clustering. In T-Helferzellen schl&auml;gt das CD4-Molek&uuml;l, kooperativ mit TCR auf der gleichen pMHC Komplex zu binden. Jedoch CD4-Blockade hatte keine Auswirkung auf die synaptische TCR-Affinit&auml;t, noch hat es destabilisieren TCR-pMHC-komplexe, die darauf hinweist, dass TCR pMHC unabh&auml;ngig von der CD4 bindet.

TCR-Peptid-MHC-Interaktion in-situ zeigen beschleunigte Kinetik und erh&ouml;hte Affinit&auml;t.

Il riconoscimento di antigeni estranei dai linfociti T &egrave; essenziale a pi&ugrave; risposte immunitarie. Esso &egrave; guidato da cellule T antigene recettori specifici (TCRs) associazione di molecole su altre cellule a antigenica del peptide-maggiore istocompatibilit&agrave; complesse (pMHC). Se produttive, queste interazioni promuovono la formazione di una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo che synaptic TCR-pMHC associazione dinamica differisce significativamente dalla associazione di TCR-pMHC in soluzione. Abbiamo usato la singola molecola fluorescenza e microscopia resonance energy transfer (FRET) tra TCRs fluorescente contrassegnati e loro ligandi pMHC affine per misurare la cinetica del legame del TCR-pMHC in situ. Quando confrontato con misurazioni di soluzione, la dissociazione di questo complesso &egrave; stata aumentata significativamente (4-12-fold). Interruzione dei polimeri di actina invertito questo effetto, che indica che la dinamica del citoscheletro destabilizzer&agrave; questa interazione direttamente o indirettamente. Tuttavia, affinit&agrave; TCR per pMHC era significativamente elevati come il risultato di un grande (circa 100 volte) aumento del tasso di associazione, una probabile conseguenza dell&#39;orientamento molecolare complementare e clustering. In cellule T helper, la molecola CD4 &egrave; stato proposto di associare in modo cooperativo con il TCR per il pMHC stesso complesso. Tuttavia, CD4 blocco ha avuto alcun effetto sull&#39;affinit&agrave; del TCR sinaptica, n&eacute; fatto destabilizzare complessi TCR-pMHC, che indica che il TCR si lega pMHC indipendentemente dai CD4.

TCR-peptide-MHC interazioni in situ Visualizza cinetica accelerata e maggiore affinit&agrave;.

T&#x30EA;&#x30F3;&#x30D1;&#x7403;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5916;&#x6765;&#x6297;&#x539F;&#x306E;&#x8A8D;&#x8B58;&#x306F;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x9069;&#x5FDC;&#x514D;&#x75AB;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x4E0A;&#x306E;&#x6297;&#x539F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x4E3B;&#x8981;&#x7D44;&#x7E54;&#x9069;&#x5408;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#xFF08;pMHC&#xFF09;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x7279;&#x7570;&#x7684;T&#x7D30;&#x80DE;&#x6297;&#x539F;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;TCR&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x99C6;&#x52D5;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x751F;&#x7523;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x5834;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x7684;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x306E;TCR-pMHC&#x7D50;&#x5408;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306F;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x3067;TCR-pMHC&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3068;&#x306F;&#x5927;&#x304D;&#x304F;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3001;in situ&#x3067;TCR-pMHC&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x52D5;&#x614B;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;TCR&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x540C;&#x65CF;pMHC&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#xFF08;FRET&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x5024;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x306F;&#x3001;&#xFF08;4&#x304B;&#x3089;12&#x500D;&#xFF09;&#x304C;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x91CD;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x7834;&#x58CA;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x9AA8;&#x683C;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x9006;&#x8EE2;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;pMHC&#x305F;&#x3081;&#x306E;TCR&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30BD;&#x30B7;&#x30A8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7387;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#xFF08;100&#x500D;&#x7A0B;&#x5EA6;&#xFF09;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x914D;&#x5411;&#x3068;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x3044;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x4E0A;&#x6607;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;CD4&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x540C;&#x3058;pMHC&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;TCR&#x3068;&#x5354;&#x8ABF;&#x7684;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;CD4&#x306E;&#x5C01;&#x9396;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;TCR&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3055;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;TCR-pMHC&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;TCR&#x306F;CD4&#x304B;&#x3089;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x3066;pMHC&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x4E0A;&#x76AE;&#x5185;TCR-&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;-MHC&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x52A0;&#x901F;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x3068;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3059;&#x308B;

T &#xB9BC;&#xD504; &#xD1A8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC678;&#xAD6D; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC778;&#xC2DD; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC801;&#xC751; &#xBA74;&#xC5ED; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xB978; &#xC140;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xC870;&#xC9C1; &#xD56D; &#xC6D0; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;-&#xC804;&#xACF5; &#xC801;&#xD569;&#xC131; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C; (pMHC)&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC815; T &#xC138;&#xD3EC; &#xD56D; &#xC6D0; &#xC218;&#xC6A9; (TCRs)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAD6C;&#xB3D9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACBD;&#xC6B0; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC131;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBA74;&#xC5ED; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4;&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; TCR pMHC &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC5ED;&#xD559; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; TCR-Pmhc&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD06C;&#xAC8C; &#xCC28;&#xC774;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; (FRET) &#xC0AC;&#xC774; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xD0DC;&#xADF8; TCRs &#xBC0F; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xB3D9;&#xC871; pMHC ligands TCR pMHC &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD604;&#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xCE21;&#xC815;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;,&#xC774; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;&#xC758; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4; (4-12 &#xBC30;). &#xC911;&#xB2E8; &#xB9D0;&#xB77C; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC9C1;&#xC811; &#xB610;&#xB294; &#xAC04;&#xC811;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; cytoskeletal &#xC5ED;&#xD559;&#xC774;&#xC774; &#xC791;&#xC6A9; &#xBD88;&#xC548;&#xC815;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBC18;&#xC804;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xD611;&#xD68C; &#xC694;&#xAE08;, &#xC0C1;&#xD638; &#xBCF4;&#xC644;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xC790; &#xBC29;&#xD5A5; &#xBC0F; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xB9C1;&#xC758; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0; &#xD070; &#xACB0;&#xACFC; (&#xC57D; &#xC57D;) &#xC99D;&#xAC00; &#xD568;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; Pmhc&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; TCR &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC0C1;&#xC2B9; &#xB41C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBCF4;&#xC870; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; CD4 &#xBD84;&#xC790; &#xD611;&#xB825; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; pMHC TCR&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC81C;&#xC548; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, CD4 &#xBD09;&#xC1C4; &#xD588;&#xB2E4; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; TCR &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0;&#xB3C4; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; TCR pMHC &#xB2E8;&#xC9C0;, TCR &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; CD4 &#xBCC4;&#xB3C4;&#xB85C; pMHC &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBD88;&#xC548;&#xC815;.

TCR-&#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC;-MHC &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC6D0;&#xB798;&#xC758; &#xC7A5;&#xC18C;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC18D;&#xB41C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xBC0F; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El reconocimiento de ant&#xED;genos extra&#xF1;os por los linfocitos T es esencial para la mayor&#xED;a de las respuestas inmunitarias adaptativas. Es conducido por los receptores espec&#xED;ficos de ant&#xED;genos de c&#xE9;lulas T (TCR) de uni&#xF3;n al complejo de histocompatibilidad antig&#xE9;nica del p&#xE9;ptido mayor (pMHC) mol&#xE9;culas en otras c&#xE9;lulas. Si productiva, estas interacciones promover la formaci&#xF3;n de una sinapsis inmunol&#xF3;gica. Aqu&#xED; nos muestran que sin&#xE1;pticas TCR-pMHC la din&#xE1;mica de uni&#xF3;n difieren significativamente de TCR-pMHC vinculante en la soluci&#xF3;n. Se utiliz&#xF3; una sola mol&#xE9;cula de la microscop&#xED;a y la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente (FRET) entre el TCR marcado con fluorescencia y sus ligandos afines pMHC para medir la cin&#xE9;tica de la TCR-pMHC uni&#xF3;n in situ. Cuando se compara con las mediciones de la soluci&#xF3;n, la disociaci&#xF3;n de este complejo fue significativamente mayor (4-12 veces). La interrupci&#xF3;n de pol&#xED;meros de actina invierte este efecto, lo que indica que la din&#xE1;mica del citoesqueleto desestabilizar esta interacci&#xF3;n directa o indirectamente. No obstante, TCR afinidad por pMHC fue significativamente elevado como el resultado de un grande (aproximadamente 100-veces) en la velocidad de asociaci&#xF3;n, una probable consecuencia de la orientaci&#xF3;n molecular y complementaria agrupaci&#xF3;n. En las c&#xE9;lulas T auxiliares, la mol&#xE9;cula CD4 se ha propuesto para enlazar cooperativamente con el TCR al complejo pMHC mismo. Sin embargo, el bloqueo de CD4 no tuvo efecto sobre la afinidad sin&#xE1;ptica TCR, ni tampoco desestabilizar TCR-pMHC complejos, lo que indica que el TCR se une pMHC independientemente de CD4.

TCR-p&#xE9;ptido-MHC Interacciones in situ muestra una cin&#xE9;tica acelerada y una mayor afinidad

&#x6269;&#x6563;&#x819C;&#x6210;&#x5206;&#x4E0D;&#x65AD;&#x53D7;&#x5230;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x5176;&#x968F;&#x673A;&#x8DEF;&#x5F84;&#x7684;&#x90E8;&#x961F;&#x3002;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5141;&#x8BB8;&#x7528;&#x4E8E;&#x89E3;&#x51B3;&#x5728;&#x6781;&#x9AD8;&#x7684;&#x7A7A;&#x95F4;&#x548C;&#x65F6;&#x95F4;&#x51C6;&#x786E;&#x6027;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x793A;&#x8E2A;&#x5242;&#x7684;&#x9014;&#x4E2D;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x8F68;&#x8FF9;&#x3002;&#x8FD9;&#x6B21;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x6D3E;&#x751F;&#x7684;&#x57FA;&#x672C;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8FFD;&#x8E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6CE8;&#x91CD;&#x65B0;&#x901A;&#x7528;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x6765;&#x5206;&#x6790;&#x5728;&#x6CA1;&#x6709;&#x5145;&#x5206;&#x5206;&#x6790;&#x5904;&#x7406;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6269;&#x6563;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5BF9;&#x5047;&#x8BBE;&#x7684;&#x5728;&#x8BA1;&#x7B97;&#x673A;&#x4E0A;&#x6267;&#x884C;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7ED3;&#x679C;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6570;&#x636E;&#x7684;&#x7EFC;&#x5408;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x8499;&#x7279;&#x5361;&#x7F57;&#x6A21;&#x62DF;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F88;&#x5BB9;&#x6613;&#x548C;&#x8FC5;&#x901F;&#x6267;&#x884C;&#xFF0C;&#x5373;&#x4F7F;&#x5728;&#x5148;&#x8FDB;&#x7684; Pc &#x4E0A;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5C06;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7528;&#x4E8E;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x5404;&#x79CD;-&#x751A;&#x81F3;&#x590D;&#x6742;-&#x6269;&#x6563;&#x6A21;&#x578B;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B80;&#x5355;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7EC6;&#x8282;&#xFF0C;&#x5E76;&#x6F14;&#x793A;&#x9002;&#x7528;&#x6027;&#x4E0A;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x4F8B;&#x5B50;&#xFF1A; &#x7B2C;&#x4E00;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6D3E;&#x751F;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x901F;&#x7387;&#x5E38;&#x6570;&#x77AC;&#x6001;&#x4E92;&#x52A8;&#x7684;&#x624B;&#x673A;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; &#xFF1B;&#x7B2C;&#x4E8C;&#xFF0C;&#x5C45;&#x4F4F;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x56F4;&#x680F;&#x5927;&#x5C0F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x63D0;&#x53D6;&#x5BC6;&#x95ED;&#x7684;&#x6269;&#x6563;&#x3002;

&#x6211;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4ECE;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8F68;&#x8FF9;&#x5B66;&#x4E60;&#x4EC0;&#x4E48;&#xFF1F;

Diffusing membrane constituents are constantly exposed to a variety of forces that influence their stochastic path. Single molecule experiments allow for resolving trajectories at extremely high spatial and temporal accuracy, thereby offering insights into en route interactions of the tracer. In this review we discuss approaches to derive information about the underlying processes, based on single molecule tracking experiments. In particular, we focus on a new versatile way to analyze single molecule diffusion in the absence of a full analytical treatment. The method is based on comprehensive comparison of an experimental data set against the hypothetical outcome of multiple experiments performed on the computer. Since Monte Carlo simulations can be easily and rapidly performed even on state-of-the-art PCs, our method provides a simple way for testing various - even complicated - diffusion models. We describe the new method in detail, and show the applicability on two specific examples: firstly, kinetic rate constants can be derived for the transient interaction of mobile membrane proteins; secondly, residence time and corral size can be extracted for confined diffusion.

What can we learn from single molecule trajectories?

Constituants de la membrane de diffusion sont constamment expos&#xE9;s &#xE0; une vari&#xE9;t&#xE9; de forces qui influent sur leur chemin stochastique. Exp&#xE9;riences de mol&#xE9;cules uniques permettent de r&#xE9;soudre les trajectoires avec une pr&#xE9;cision spatiale et temporelle extr&#xEA;mement &#xE9;lev&#xE9;e, offrant ainsi un aper&#xE7;u des interactions en route du traceur. Dans cette revue, nous discutons des approches pour obtenir des informations sur les processus sous-jacents, sur la base des exp&#xE9;riences simples de suivi de mol&#xE9;cules. En particulier, nous nous concentrons sur une nouvelle fa&#xE7;on d&#x26;#39;analyser la diffusion polyvalent seule mol&#xE9;cule, en l&#x26;#39;absence d&#x26;#39;un traitement analytique complet. La m&#xE9;thode est bas&#xE9;e sur la comparaison globale des donn&#xE9;es exp&#xE9;rimentales &#xE9;tablies un contre l&#x26;#39;issue hypoth&#xE9;tique d&#x26;#39;exp&#xE9;riences multiples effectu&#xE9;es sur l&#x26;#39;ordinateur. Depuis simulations de Monte Carlo peut &#xEA;tre facilement et rapidement ex&#xE9;cut&#xE9;, m&#xEA;me sur l&#x26;#39;&#xE9;tat de l&#x26;#39;art-PC, notre m&#xE9;thode fournit un moyen simple pour tester diff&#xE9;rents - m&#xEA;me compliqu&#xE9; - des mod&#xE8;les de diffusion. Nous d&#xE9;crivons la nouvelle m&#xE9;thode en d&#xE9;tail, et de montrer l&#x26;#39;applicabilit&#xE9; sur deux exemples pr&#xE9;cis: d&#x26;#39;une part, des constantes cin&#xE9;tiques peuvent &#xEA;tre tir&#xE9;s de l&#x26;#39;interaction transitoire de prot&#xE9;ines membranaires mobiles; d&#x26;#39;autre part, le temps de r&#xE9;sidence et la taille corral peuvent &#xEA;tre extraites pour la diffusion limit&#xE9;e.

Que pouvons-nous savoir &#xE0; partir de trajectoires Single Molecule?

Diffundierenden Membrane Bestandteile sind st&auml;ndig eine Vielzahl von Kr&auml;ften ausgesetzt, die ihre stochastische Pfad zu beeinflussen. Einzelmolek&uuml;l-Experimente erm&ouml;glichen zum Aufl&ouml;sen von Flugbahnen bei extrem hoher r&auml;umlicher und zeitlicher Genauigkeit, und bietet Einblicke in unterwegs Interaktionen des Tracers. In diesen Bericht diskutieren wir Ans&auml;tze, um Informationen &uuml;ber die zugrunde liegenden Prozesse, basierend auf Einzelmolek&uuml;l Verfolgung Experimenten abgeleitet werden. Insbesondere konzentrieren wir uns auf eine neue vielseitige M&ouml;glichkeit, Einzelmolek&uuml;l-Verbreitung in Ermangelung einer vollst&auml;ndigen analytischen Behandlung zu analysieren. Die Methode basiert auf umfassenden Vergleich eines experimentellen Daten-Sets gegen das hypothetische Ergebnis mehrere Experimente, die auf dem Computer ausgef&uuml;hrt. Da Monte-Carlo-Simulationen schnell und einfach auch auf Zustand-of-the-Art-PCs durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen k&ouml;nnen, bietet unsere Methode eine einfache M&ouml;glichkeit, verschiedene - auch kompliziert - Verbreitung-Modelle zu Testzwecken. Wir beschreiben die neue Methode im Detail und zeigen die Anwendbarkeit auf zwei konkrete Beispiele: Erstens kinetischen Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden k&ouml;nnen, f&uuml;r die vor&uuml;bergehende Interaktion von mobilen Membranproteinen; Zweitens kann Residenz-Zeit und Corral-Gr&ouml;&szlig;e f&uuml;r begrenzten Diffusion extrahiert werden.

Was k&ouml;nnen wir von Einzelmolek&uuml;l-Trajektorien lernen?

Diffusore costituenti di membrana sono costantemente esposti a una variet&agrave; di forze che influenzano il loro percorso stocastico. Esperimenti di singola molecola consentono di risolvere le traiettorie a estremamente elevata accuratezza spaziale e temporale, offrendo intuizioni in rotta interazioni del tracciante. In questa recensione parleremo approcci per ricavare informazioni sui processi sottostanti, basato su singola molecola esperimenti di rilevamento. In particolare, ci concentriamo su un nuovo modo versatile per analizzare la diffusione di singola molecola in assenza di un trattamento analitico completo. Il metodo si basa sul confronto completo di un set di dati sperimentali contro l&#39;ipotetico esito di molteplici esperimenti eseguiti sul computer. Poich&eacute; le simulazioni Monte Carlo possono essere eseguite facilmente e rapidamente anche su PC di stato-of-the-art, il nostro metodo fornisce un modo semplice per testare vari modelli - anche complicato - diffusione. Ci descrivono il nuovo metodo in dettaglio e mostrano l&#39;applicabilit&agrave; su due esempi specifici: in primo luogo, costanti di velocit&agrave; cinetica possono essere derivate per l&#39;interazione transitoria delle proteine della membrana cellulare; in secondo luogo, dimensione tempo e corral di residenza pu&ograve; essere estratta per diffusione limitata.

Che cosa possiamo imparare dalle traiettorie di singola molecola?

&#x62E1;&#x6563;&#x819C;&#x6210;&#x5206;&#x304C;&#x7D76;&#x3048;&#x305A;&#x78BA;&#x7387;&#x7684;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x529B;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x306B;&#x3055;&#x3089;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC;&#x306E;&#x9014;&#x4E2D;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3078;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x7A7A;&#x9593;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6642;&#x9593;&#x7684;&#x306A;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x3067;&#x8ECC;&#x9053;&#x3092;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x8FFD;&#x8DE1;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x57FA;&#x790E;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x60C5;&#x5831;&#x3092;&#x5C0E;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7279;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5B8C;&#x5168;&#x306A;&#x5206;&#x6790;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x975E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x62E1;&#x6563;&#x3092;&#x89E3;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x7528;&#x9014;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D4;&#x30E5;&#x30FC;&#x30BF;&#x4E0A;&#x3067;&#x5B9F;&#x884C;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x7684;&#x306A;&#x7D50;&#x679C;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x5305;&#x62EC;&#x7684;&#x306A;&#x6BD4;&#x8F03;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x8907;&#x96D1;&#x306A; -   - &#x62E1;&#x6563;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x30E2;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AB;&#x30EB;&#x30ED;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x304B;&#x3064;&#x8FC5;&#x901F;&#x306B;&#x6700;&#x5148;&#x7AEF;&#x306E;PC&#x4E0A;&#x3067;&#x3082;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7C21;&#x5358;&#x200B;&#x200B;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x8A73;&#x7D30;&#x306B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3057;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x5177;&#x4F53;&#x4F8B;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305A;&#x3001;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x5B9A;&#x6570;&#x306F;&#x3001;&#x643A;&#x5E2F;&#x96FB;&#x8A71;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E00;&#x904E;&#x6027;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x7531;&#x6765;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x306B;&#x3001;&#x6EDE;&#x7559;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x56F2;&#x3044;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x306F;&#x3001;&#x9589;&#x3058;&#x8FBC;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x62E1;&#x6563;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x62BD;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x8ECC;&#x9053;&#x304B;&#x3089;&#x4F55;&#x3092;&#x5B66;&#x3076;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#xFF1F;

&#xD655;&#xC0B0; &#xB9C9; &#xC131;&#xBD84; stochastic &#xACBD;&#xB85C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xB294; &#xD798;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB178;&#xCD9C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xCD94;&#xC801; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC758; &#xB3C4;&#xC911;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB192;&#xC740; &#xACF5;&#xAC04; &#xBC0F; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC815;&#xD655;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xADA4;&#xC801;&#xC744; &#xD574;&#xACB0; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAC80;&#xD1A0;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xCD94;&#xC801;&#xC744; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0B4;&#xD3B4;&#xBD05;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC804;&#xCCB4; &#xBD84;&#xC11D; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD655;&#xC0B0; &#xBD84;&#xC11D; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;&#xC744;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xAC00;&#xC0C1; &#xCEF4;&#xD4E8;&#xD130;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xACB0;&#xACFC; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC138;&#xD2B8;&#xC758; &#xC885;&#xD569;&#xC801;&#xC778; &#xBE44;&#xAD50;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAAC;&#xD14C;&#xCE74;&#xB97C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xC218;&#xD589; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC27D;&#xACE0; &#xBE60;&#xB974;&#xAC8C;&#xB3C4; &#xCD5C;&#xC2E0;&#xC758; Pc, &#xC774;&#xD6C4; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C;-&#xC2EC;&#xC9C0;&#xC5B4; &#xBCF5;&#xC7A1;&#xB41C;-&#xD655;&#xC0B0; &#xBAA8;&#xB378; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC138;&#xBD80; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC5D0;, &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD2B9;&#xC815; &#xC608;&#xC81C;&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC;: &#xCCAB;&#xC9F8;, &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xC218; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;;&#xC758; &#xACFC;&#xB3C4; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB458;&#xC9F8;, &#xB808; &#xC9C0; &#xB358;&#xC2A4; &#xC2DC;&#xAC04; &#xBC0F; &#xBAA9;&#xC7A5; &#xD06C;&#xAE30; &#xBC00;&#xD3D0; &#xB41C; &#xD655;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD94;&#xCD9C;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xADA4;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBB34;&#xC5C7;&#xC744; &#xBC30;&#xC6B8; &#xC218; &#xC788;&#xC744;&#xAE4C;&#xC694;?

Difundir los componentes de membrana est&#xE1;n constantemente expuestos a una variedad de fuerzas que influyen en su comportamiento estoc&#xE1;stico. Experimentos de una sola mol&#xE9;cula permiten resolver las trayectorias de una precisi&#xF3;n espacial y temporal muy alta, lo que ofrece informaci&#xF3;n sobre las interacciones de ruta de la sustancia inyectada. En esta revisi&#xF3;n se discuten los enfoques para obtener informaci&#xF3;n sobre los procesos subyacentes, basados &#x200B;&#x200B;en simples experimentos de seguimiento de la mol&#xE9;cula. En particular, nos enfocamos en un modo nuevo y vers&#xE1;til para analizar la difusi&#xF3;n de una sola mol&#xE9;cula en ausencia de un tratamiento anal&#xED;tico completo. El m&#xE9;todo se basa en la comparaci&#xF3;n completa de un conjunto de datos experimentales fijados contra el resultado hipot&#xE9;tico de m&#xFA;ltiples experimentos realizados en el equipo. Desde simulaciones de Monte Carlo puede ser f&#xE1;cil y r&#xE1;pidamente a cabo incluso en los equipos del estado de la t&#xE9;cnica, nuestro m&#xE9;todo proporciona una forma sencilla para probar diferentes - incluso complicado - los modelos de difusi&#xF3;n. Se describe el nuevo m&#xE9;todo en detalle, y mostrar la aplicabilidad de dos ejemplos concretos: en primer lugar, las constantes cin&#xE9;ticas se pueden derivar de la interacci&#xF3;n transitoria de prote&#xED;nas de membrana celulares, en segundo lugar, el tiempo de residencia y el tama&#xF1;o de corral se pueden extraer para la difusi&#xF3;n limitada.

&#xBF;Qu&#xE9; podemos aprender de trayectorias sola mol&#xE9;cula?

The binding of peptide-loaded major histocompatibility complex (pMHC) to the T cell receptor (TCR) represents the central step in T cell antigen recognition. It proceeds in the cell contact area between a T cell and an antigen-presenting cell termed the immunological synapse. An important and unresolved issue is how T cells discriminate between potentially harmful and harmless antigens. One limitation has been the difficulty to measure interaction parameters directly, that is, as they occur in the immunological synapse. Here we present a single-molecule approach to determine pMHC-TCR interaction kinetics in situ based on diffusion analysis of dye-labeled pMHC. We find synaptic off-rates >10-fold accelerated when compared to the dissociation of purified proteins measured in vitro.

Markus Axmann

Institute for Applied Physics - Biophysics,
Institute of Applied Physics - Biophysics

Vienna University of Technology

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Markus Axmann

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Institute for Applied Physics - Biophysics,Institute of Applied Physics - Biophysics

Vienna University of Technology

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Institute for Applied Physics - Biophysics,
Institute of Applied Physics - Biophysics