석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS와 JH는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple.">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. 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T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+repeat+proteins:+well-expressed,+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins.">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

동일계에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 pMHC TCR-11 결합의 낮은 친 화성 상호 작용을 취급 할 때 특히 매우 바람직하다. 온 - 레이트뿐만 아니라 이러한 상호 작용의 안정성은 크게 결합이 일어나는 상황 하에서 특정의 영향 때문이다. 최소 침습 FRET 기반 이미징 방식 완벽 등의 작업에 적합하다 원리에 따라서, 제 아직 극복해야 할 장애물의 수를 포함한다. 자기 형광 세포에 의해 생성 된 잡음은 측정의 감도를 제한하고 따라서 최소한으로 유지되어야한다. TIRF 현미경 적으로 선택 13-15의 단백질과 장식 평면 유리 지원 지질 이중층의 형태로, 잘 (12)이 필요성을 제공하지만 유리 슬라이드의 작용을 필요로한다. 부분적 reconstitutive 접근법의 또 다른 장점은 재조합 이중층 상주 FRET 파트너 훨씬 m 될 수 있다는쉽게 작고 밝은 형광으로 양적, 사이트 별과 합리적인 방식으로 표시 광석 세포 표면 발현 된 단백질로 가능한 것보다. 이전에 2 테스트되었습니다로 TCR도는 재조합 SCF V S, T 세포의 인식에 영향을주지 않는 태그가 있습니다. 또한, SLB의 단백질 조성물은, 예를 들면 pMHCs의 밀도 및 액세서리 인자의 선택은 하나의 특정 요구에 조정될 수있다. 우리는 이전에 자극 pMHCs의 밀도 변화와 실험을 수행했지만, 오프 2D가-K 및 2D-K (D2)에서 유의 한 차이가 발견되지 않았다. 지금까지 여기 MHC 클래스 II 분자의 인식은 주로 때문에 양단이 개구들이 펩타이드 결합 틈의 특성으로 만 처리되었으며, 따라서 형광 물질을 부착하기위한 링커 펩티드를 포함 큰 수용한다. 어떤 경우에는 이러한 접근 방식은 또한 라벨의 MHC CIA 요원에 대한 작동하지 않을 수 있습니다SS 나는 16 분자하지만 큰주의는 실험에 사용을 확인하기 위해주의해야한다. 표면 플라즈몬 공진에 의해 시험 관내에서 측정 된 T 세포 증식 분석법뿐만 아니라 키네틱 결합 pMHC-TCR을 통해 측정 할 수있는 항원을 향해 T 세포의 감도는 링커 및 형광 물질에의 첨가에 의해 영향을 받아서는 안 펩티드. 또한, 내가 자신을 분자 MHC 클래스는 중쇄 (게시되지 않은 관찰)의 순서 내 짝 시스테인의 도입으로 사이트 별 방식으로 표시 할 수 있습니다. 적절한 분자 프로브를 이용하여 임의의 시냅스 단백질 - 단백질 상호 작용은 원칙적으로 본 명세서에 기재된 방법으로 연구 될 수있다. 예를 들어, 이러한 프로브는, SCF V의 또는 설계 Ankyrin 반복 단백질 (DARPins) (17)는 1가 있어야하며 관심의 상호 작용에 영향을주지 않고 안정적으로 자신의 목표를 ​​결합해야합니다. 물론, 구조 informatio를N은 합리적인 프로브 설계에 매우 바람직하지만 절대적으로 필요합니다. FRET 파트너의 새로운 쌍을 설정할 때, 그것은 기록하고 처음으로 대량으로 FRET을 분석하는 것이 좋습니다. 라벨의 부착 위치는 FRET 신호를 최대화하기 위해 상당히 변화 될 수 있고 또한 수율이 FRET 측정 염료 간 거리에 따라 다를 수 있음을 확인하기 위해. 시스템이 최적화되면, 단일 분자는 신호 10-30%에 높은 풍부 FRET 파트너의 표시를 제한하고 단일 분자 조명 분야에서 분해 될 때까지 낮은 풍부 FRET 파트너 표백에 의해 기록 될 수있다 FRET. 마지막으로 그것이 SLB 수 어떤 근사하지만 주목해야하지 생리적 세포막의 모든 측면. 이러한 막 곡률과 유연성, 도메인 구획화, 세포 골격 재 배열 및 세포 운동성뿐만 아니라 표면 발현 막 단백질의 높은 다양한로서 자질 SLB 수로 표현되지 않고 T에 영향을 미칠 수그는 조사를 받고 처리합니다. 많은 노력이 TIRF 영상에 액세스 할 수없는 생리적 인 시냅스에서 단일 분자 해상도와 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링 허용 영상 방식을 설정하는 데 투자해야합니다.

T 세포가 항원을 인식하는 방법의 근본적인 이해는 T 세포와 APC 사이에 형성된 면역 시냅스 내에서, 즉, 정확한 위치를 찾고 요구한다. 여기서, 분자 결합 동력학은 셀룰러 힘, 막 구조 및 막 단백질 사이의 측 방향 작용뿐만 아니라 시냅스 특정 기하학적 제약들을 포함하는 셀룰러 파라미터에 크게 의존하지만 관련된 상호 작용 파트너의 본질적인 생화학 적 특성에 의해 결정되지 않는다 3. 생화학 적 방법은 그들이 관련된 시냅스 막의 적어도 하나의 중단을 필요로 해상력으로 제한된다. 이러한 이유로 FRET 기반 이미징 방법은 항원 pMHCs 2 TCR의 결합을 모니터하기 위해 개발되었다. 여기에 T - 세포 재조합로 장식되어 및 사이트 특별히 TCRβ 반응 단일 사슬 항체 단편 (SCF의 V) 표시 및 계획에 직면<html> MHC 클래스 II 형광 표지 된 항원 펩티드와 함께로드 분자, 보조 자극 분자와 접착 단백질을 항구 AR 유리 지원 지질 이중층 (SLB 수). 시냅스는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 벌크 및 단일 분자 수준에서 모니터링 할 수 있습니다 FRET의 염료 표지 TCR 및 염색 표지 pMHC 결과 사이의 바인딩. 이 문서는, T 세포에 시냅스를 분석하기위한 SLB 수를 이용하는 기능성 T 세포 칼슘 플럭스 분석을 통해 자신의 무결성을 검증하는 방법을 상세히 설명하고, 실시 대량으로 단일 분자 감도 측정 FRET 및 수집 된 데이터를 분석한다. 권장 사항은 이중층 작용에 필요한 제대로 닮아 단백질을 생산에게 제공됩니다. 이중층의 형성과 적절한 TIRF 현미경 (4)를 다시 다시 게시 추가 공용 액세스 조브 간행물을 참조하시기 바랍니다의 설치에 관한보다 구체적인 내용은. 십t &quot;&gt; SLB 수의 자연 Functionalizable SLB 수 용이 두 지질 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 실 -Sn- gylcero -3- 포스 포 함유 단일 층 소포 (SUV의)로부터 생성 될 수있다 (단 : POPC, 90-99%) 및 1,2- dioleoyl- SN을 - 글리세로 -3 - {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 석시} (단 : DGS-NTA 니켈 1-10 %). 깨끗한 유리 슬라이드에 도포 SUV와 인접한 평면 이중층 (4)을 형성한다. DGS-NTA-NI는 합성 NTA - 니켈 함유 헤드 그룹 (그림 1A)와 폴리 히스티딘 매개 복잡한 형성을 통해 폴리 히스티딘 태그가 단백질을 고정하는 역할을한다. 안정 협회 하나를 들어 일반적으로 접착 단백질 ICAM-1과 열두 히스티딘에게 (ICAM-1-12H, B7-1 -12H)를 포함하는 하나의 태그와 공동 자극 분자 B7-1의 기본 횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 대체합니다 (그림 1B) . 펩티드 -로드 된 클래스 II 분자 IE에서 k 개의 임베디드 막 (α 및 β) 폴리 펩타이드 쇄를 포함의. 양쪽 사슬의 트랜스 / 세포질 도메인은 각 여섯 개의 히스티딘 (IE K α β 6H 6H 또는 IE 케이 -2x6H)를 포함하는 태그로 대체되어야한다. 다른 열두 히스티딘과 α-체인을 확장하고 태그가 지정되지 않은 (12H의 β의 0H 또는 IE의 케이 -12H α IE의 K 상승을주는) β-체인의 세포 외 도메인을 떠나으로 만족스러운 결과 (그림 1B)을 발생시킨다. pMHCs의 사이트 별 라벨 그것은 의미있는 평형 결합 상수에 FRET 측정 수율을 변환 할 수하기 위해 화학 양 론적 및 사이트 구체적으로 pMHC 레이블을하는 것이 중요합니다. 이는 재조합 히스티딘 태그가 MHC 클래스 II 분자의 2,5- 펩타이드 결합 틈에로드 합성 펩티드의 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 펩티드 w로서 T 세포 에피토프의 모든 잔기를 포함엘 시스테인 다음에 짧은 C- 말단 링커 (GGS)으로 (예를 들어 나방 시토크롬 C (MCC) 펩타이드 ANERADLIAYLKQATK- GGSC에서, 링커는 굵은 글씨로 표시되어 있습니다). 이 시스테인은 말레이 미드 염료 유도체를 이용하여 화학량 론적으로 펩티드 라벨을 사용한다. 이 점에서 각별한주의가 시스테인 함유 펩타이드 정량 염료 커플 링을 확인에 전념해야한다. 펩타이드 염료 부가의 HPLC 정제를 권장하고 전기 분무 이온화 질량 분석에 의해 따라야한다. (염료없이) 펩타이드 유리체에 해당하는 모든 기록 대중은 불완전한 라벨을 반영한다. 이것이 사실이라면 라벨이 양적 것으로 간주 될 때까지, HPLC 정제 펩타이드는 염료 라벨의 연속 라운드를 실시해야한다. 이 방법은 시료의 이온화를위한 레이저 방사선을 포함 같이 MALDI-TOF 질량 분광법은 피해야합니다. 펩티드 질량 따라서 underrepre 판독되기 전에 처리는 부착 성 형광을 붕괴<html> 염료 결합의 변위량도. 가의 단일 체인 F V 조각의 사용과 셀 바인딩 TCR도의 간접 아직 사이트 별 라벨 아직 사이트 별 방식으로 살아있는 세포의 표면 관련 단백질을 세포하기 위해 염료를 부착 도전하고있다. 표면이 노출 된 TCR도 장애물을 극복하기 위해, 모노클로 날 항체 TCRβ -reactive H57-197 (2)의 유전자 발 가의 단일 쇄 버젼 (SCF V)를 구성하고있다. TCR과 착물이 항체의 결정 구조가 합리적으로 (대응 FRET 파트너 염료가 부착) MHC 관련 펩티드의 C 말단 가까이에있는 세린 잔기가 치환 된 버전을 설계 할 수있다 시스테인 잔류 물. 이 돌연변이 시스테인은 염료의 결합 (그림 2)에 대한 수용체 역할을한다. 방법론은 FRET을 기록하는 NT &quot;&gt; 벌크 FRET 값은 선택된 간 염료의 거리 사이의 관계를 확인하는 것이 가장 적합하며, 시스템 (2) 결합이 TCR-pMHC 측정 효율을 FRET. 또한, 벌크 FRET 측정은 시냅스 TCR-pMHC 유사성의 정량적 차이 (공개 아래 참조) 및 프로토콜 3.2. 문헌 6에 도입 된 FRET 효율을 정량화하기위한 다양한 접근 방법을.이 문서 FRET을 통해 기록에서 (a) 도너 복구 셉터 표백 후, 비아 (b)는 FRET 수용체 방출을 증감. 첫 번째 방법 (A)은 용이하게 광 퇴색 될 수 FRET 수용체, 오히려 광 안정성이다 도너의 사용을 필요로한다. 또한 이는 광 퇴색 셉터 더이상 도너 형광 급냉 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 같은 감지 채널 (기증자)를 정량에 사용되는 바와 같이, 어떤 보정 요인 없습니다D 더 색수차는이 방법론 간단하고 신뢰성을 렌더링하는 고려되어야 할 필요가 없습니다. 그러나, 정량적 측정이 동일한 표본 지점에서 반복 될 수없고 FRET의 변화는 시간에 기록 할 수 없다. (수용체 표백 전) 첫 번째 무서워 기증자와 (FRET 수용체 표백 후) 두 번째 FRET 공여 이미지 수집 사이를 통과하는 시간을 최소화 분자 확산 또는 빠른 표백 단계를 목적으로한다 세포 운동에 의해 발생 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 조명 및 표백 시간을 최소화하기 위해 FRET 셉터 여진 파장의 강력한 레이저 광원을 사용하는 것이 권장된다. 반면, (b) 방출 민감화 FRET 측정 접근법 FRET 도너는 흥분과 FRET 수용체의 발광은 FRET 수용체 채널에서 관찰된다. FRET 수용체 신호의 변화가 적색 편이 수용체 채널로 시간 만 무서워 기증자의 방출을 통해 기록 할 수있다 (Termed bleedthrough) 정확하게 결정하고 기록 FRET 수용체 채널에서 공제 할 필요가 기증자 여기를 통해 수용체 크로스 여기를 FRET. 이를 위해 FRET 도너 대응하고 FRET 셉터 이미지 공간적으로 정렬되어야한다. 단일 분자 검출 (SM) 이벤트를 FRET 여기 원, 민감한 카메라와 노이즈 감쇠 TIRF 현미경으로서 레이저를 이용하여 하나의 형광체의 형광 쉽게 시간 동안 추적 될 수있다. 유사한 분자간 smFRET 이벤트의 검출을위한 사실이다. 그러나 합병증 FRET 도너 bleedthrough 및 FRET 수용체의 가교 자극에 의​​해 발생하고, 따라서 세심 smFRET 실험에서 형광 밀도를 조정할 때는주의가 필요하다 할 수있다. 아래의 프로토콜 (프로토콜 섹션 4)에서 TCR 낮은 풍부 FRET 수용체 높은 풍부하고 pMHC에 무서워 기증자로 선정되었다. FR을 감쇠충분히, 형광 SCF (V)과 비 형광 SCF의 V를 사용하여 TCR도의 90-70%와 TCR도 10-30 %에 장식 bleedthrough 동부 기증자. 그것은 하나의 분자와 공 초점이 채널을 FRET 때문에 여기 FRET 수용체 채널은 단일 분자 채널로 선택되었다. 이 smFRET 검증의 기초가 무서워 수용체 단일 분자와 smFRET 이벤트를 정렬하는 데 도움이됩니다. smFRET 측정을 통해 시냅스 오프 비율을 추출 양자의 광표백은 도너와 억 셉터를 FRET는 단일 분자의 상호 작용이 트레이스를 FRET의 반감기를 추출 할 때 고려되어야 할 FRET. 단일 도너 - 억 셉터 페어로서의 외관 N의 시작-FRET 관찰 신호의 수 (0) 수용체 - 리간드 복합체의 양 및 광표백 바인딩 해제하여 시간이 지남에 따라 감소된다. 다음과 같이 주어진 시간 N (t)에서 단지 생존 수는 수학적으로 표현 될 수있다 : 광표백 용어 특급 (-t / τ 표백제)의 시간 t는 즉 표백 만 조명시 발생 관찰 수 (N)의 생성물 및 (인해 비 연속적, 불연속 관찰 모드의 병, 조명 시간 t에 의해 설명된다 ). 운동 기간 exp- (t / τ OFF) 시간 t가 관찰 수 (N)의 곱과 단일 FRET 관찰 (즉, 결합 해제 운동이 연속적으로 발생 함)에 대한 시간 t 래그 내이다. 수학 식 1과 같이 표현 될 수있다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> 용어 τ 표백제 / τ 아픈 데백화가 발생하고, 기대 값이 &lt;N 백제&gt;로서의 지수 함수 정의 될 때까지 관찰의 수를 cribes. 다음과 같이 수학 식 2를 단순화 할 수있다 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> 시간 t-FRET 관찰 후 이벤트와 프레임의 수 N (t)의 기대 값은 &lt;N (t 래그)&gt; 직접 실험으로부터 결정된다. 이 실험에서 선택된 관측 (t 래그) 및 τ 오프 (OFF k는 오프 - 속도의 역수)에 대한 미지의 값의 설정 가능한 시간에 따라 표백이 발생하기 전에, 관측 횟수의 기대 값을 &lt;N 백제&gt; . 따라서, t의 적어도 두 값의 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 계산 <sub&gt; 지연이 &lt;N 표백&gt; 오프 τ의 실험적인 결정을 할 수 있습니다. FRET 기반의 측정을 통해 시냅스 2D-K D 값을 추출 TCR 점유 즉, 바인딩 TCR도 총 TCR도 사이의 비율을 측정, 시냅스 2D-K D의 값을 결정하는 핵심이다. 한 TCR도가 무서워 기증자와 pMHCs 무서워 수용체로의 역할로 산출 프렛 측정에 식 (4)에 따르면이 용어는 직접적으로 비례한다. <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> = TCR 점유율과, C는 = 환산 계수 C는 FRET 시스템에 의존하고 형광체가 사용되는 상수이다. 아래 그림과 같이이 실험적으로 결정될 수있다. 수학 식 5에있어서, 2D-K D로 전환 될 때종래 이중층에 T 세포의 첨가로 TCR 리간드의 초기 밀도가 공지되어있다. 이는 SLB 부착 단백질의 높은 이동성의 SLB 수이며, 또한 (2)의 리간드는 거의 무진장 저장조를 제공하기 때문이다. <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [pMHC의 초기]는 종래의 T 세포에 첨가 pMHC의 초기 밀도를 함께 = 식 4, 5 일 지금 쉽게 TCR 및 pMHC 사이의 시냅스 2D-K D를 확인할 수 있습니다. 이것은 가장 확실 수용체 표백 (프로토콜 3.1 절 참조) 후 기증자의 회복을 기반으로 FRET 측정으로 이루어집니다. 그러나, C에게 내가 FRET FRET 세기 간의 관계를 측정하고 TCR 점유 결정한다 (배경에 대해 보정, FRET 도너 및 억 셉터 bleedthrough 교차 여진은 FRET). 이를 위해, 하나의내가 기증자를 FRET과 단일 분자의 평균 강도 사건이 난 FRET SM FRET 단일 TCR 관련 FRET 기증자 형광 (예를 Cy3 또는 AF555) SM의 평균 형광 강도의 비 (R)를 알 필요가있다. R은 형광 검출에 사용되는 질문, 배출 필터와 카메라의 FRET 체제에 따라 다릅니다. TCR은 다음 직접 식 6에 따라 결정될 수있다 점유. <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = SM과 내가 FRET 기증자 / SM을 FRET R은 리드 H57 scFv-를 Cy3 / pMHC-Cy5의 시스템에 대한 1.45로 하였다 : = 대량 나는 1.45 • / 대량 나는 TCR-CY3을 FRET TCR 점유 및 FRET 수율 사이의 관계는 FRET 공여체에 의해 결정될 수있다 복구수용체 표백 후 Y. 선형 피팅 그림 4A 국지적 인 슬로프에서와 같이이 두 매개 변수가 숫자 TCR의 microclusters에 대해 서로에 대해 플롯은 (식 4)에서 변환 계수 C를 나타냅니다. 1.995로는 Cy3 / Cy5의 pMHC-FRET 시스템 및 (b) 가해 현미경 시스템 구성 -도 4a에서 설명 된 바와 같이, C가 (a)의 V H57 SCF 대한 금액. TCR은 다음과 같이 용이하게 추론 될 수 점유 : TCR 점유 = 1.995 • 산출 FRET

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
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			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

의 Fura-2 칼슘 염료 통하여 세포 내 칼슘의 기록뿐만 아니라 후속 셀룰러 분석 자극 효능 및도 4에 도시되어 SLB 수의 따라서 기능을 확인하기 위해. 분명하게 된 바와 같이, 칼슘 농도는 다음과 같이 표현 (T 세포 상승 기준 즉시 즉시이 자극 SLB 수에 정착으로) 1 인 정규화의 Fura-2 시간 조사 / 380 ㎚ ​​비율. 칼슘 농도가 곧 TCR 결합 이로부터 차단 pMHCs가 T 세포 활성화를 종료 항체의 첨가 후에 기준선 수준으로 복귀. 도 6은 (도 4에 도시) FRET 수율을 측정하기 위해 채용되며, 2D-K D 값을 산출하는 역할을하는 셉터 표백 후 FRET 도너 회복과 관련된 대표적인 실험을 도시한다. 무서워의 신속하고 완전한 절제 후 AF555을 통해 표시 TCR을 나타냅니다 무서워 기증자 강도의 증가를, 양해 해 주시기 바랍니다cceptor 종 (여기서는 pMHCs과 관련된 AF647). 또한 분명이 무서워 채널에 강한 감소는, 즉, FRET 수용체 표백 후 FRET 공여 여기에서 FRET - 수용체 채널. 거의 보이지 나머지 신호는 기증자 bleedthrough을 FRET에 해당합니다. 개별 TCR의 microclusters 또는 전체 시냅스 내 무서워 수익률을 계산 표시된 측정 된 강도 값 (그림 6B)을 기반으로합니다. 그림 7은 두 시간 프레임에서 볼 수 단일 분자 FRET 이벤트의 궤적과 시간 경과를 나타낸다. 도입에 위에서 설명한 것과 같은 행동은 모두 결합 시냅스 TCR-pMHC의 부패와 광표백에 의해 발생합니다. 이러한 두 가지 기여를 구별하기 위해, 실험 획득 시간 프레임은 지속 기간에서 가변 할 수있다 : 광표백은 일정하게 유지하면서, FRET 이벤트 궤도 길이의 변화에​​만 결합 동력학에 의해 야기된다. tracelengths의 정량, W<html> HICH도 7에 도시 된 오프 - 속도와 표백의 계산을위한 기초를 형성한다, (3) 표 1에 제공된다. 2D-K D의의 결정은 대량의 녹음이 무서워 - 기증자 표시 TCR도에 대한 수율을 FRET이 필요합니다. 실험적으로 유추 상수 C (도 4)의 사용으로, TCR의 microcluster 또는 전체 시냅스 측정 FRET 수율 TCR로 점유 전환 될 수있다, 즉, pMHC - 결합 및 총 TCR도의 비 (도 4C) . 종래 T 세포에 첨가 SLB에 본 공지 pMHC 밀도로, 값은 시냅스 2D-K D 값 (도 4d)를 결정하기 위해 적용될 수있다. 온 속도는 질량 작용의 법칙으로 계산 될 수있다 (에 2D-K = 2D-K / 2D-K D를) 결정 시냅스에서 오프 속도와 2D-KD 값. 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; 도 1의 평면 유리 지원 지질 이중층 (SLB) 시스템의 개략 회로도. (A) SLB 수는 해당 지질로 구성된 POPC (90-99%) 및 합성 지질 DGS의 Ni-NTA (1-10%)로 구성하고 깨끗한 유리 표면이 작은 단일 층 소포 (포드 SUV)으로 충전되면 자발적으로 형성된다. (B)가 형성되면, 예컨대 SLB 수는 T 세포에 대한 장갑차 역할을하는 수용성 폴리 히스티딘 - 태그 pMHCs 세포 유래의 부분, 보조 자극 B7-1 단백질과 ICAM-1의 접착 단백질로 작용 화 될 수있다. SLB 수를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 AXMANN 등. (4)를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> 2. 포스터 공명 에너지 재 전송 기반의 분석은 TCR-pMHC가 현장에서 바인딩을 정량한다. (A) pMHC 결합 H57 단일 사슬 단편과 복합 TCR의 복합 구조물은 본원에 기재된 FRET 기반 접근법 나타낸다. 약 41A FRET을받은 두 대응하는 형광 물질을 분리하는 짧은 거리를합니다. 형광 - 말레이 미드에 대한 수용체 사이트는 녹색과 빨간색으로 표시됩니다. (B)는 현장에서 TCR-pMHC 상호 작용을 검출하는 원리가 설명된다. 만 SCF V는 특정 복합체를 형성 TCR도 및 pMHCs (여기에 IE의 k)를, -decorated, 측정 FRET 신호에 상승을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;/&gt; 도 SCF V S 단량체와 펩티드 -로드 된 IE의 K -2x6H 분자 최종 겔 여과 단계주는 상승 3. 크로마토. X 축이 용액에 보유 체적을 나타내고, Y 축에는 임의의 단위로 280 nm에서 (AU)을 흡광도를 나타낸다 . (A) H57 SCF의 V 부위 - 특이 알렉사 형석 555 말레이 미드 단백질 (단계 1.2.5)에서 미 반응 된 염료를 분리 S75 크로마토 그래피로 표지. 고정 간격으로 14 - 15 ㎖ (점선)에 대응 분획 단량체 H57 SCF의 V 라벨링 나타낸다. UV 분해성 ANP 공간 홀더 펩타이드 복합체 (B) IE의 유전율 -2x6H 분자하면, UV가 조사 된 부위 - 특이 알렉스 함께 배양했다 647 말레이 미드 표지 펩티드​​ 마지막 자유 펩티드 (단계 1.1.2.4)로부터 단백질을 분리하는 S200 크로마토. 포함이 제대로 접혀 점선과 단량체 pMHCs 사이의 간격. (A, B) </strong는&gt; 0.7 ml의 샘플 럼 (0 mL의 점)의 시작 컬럼에 적용 하였다. 수집 된 분획을 농축 하였다. 단백질을 염색 비율 전에 PBS / 50 % 글리세롤에 대한 투석에 photospectrometry에 의해 결정되었다 (-20 °에서 저장). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> 그림 4. 결정 2D-K D S와 S의 2D-K. (A) 수용체의 표백 및 TCR 점유율이 실험적으로 측정 한 후 기증자의 회복에 의해 결정되는 FRET 수익률 사이의 상관 관계. 4.2 절에 설명 된대로 TCR 점유율은 개별 TCR의 microclusters에 대해 판단 할 수있다. 상기 데이터의 선형 피팅을 행함으로써 표시의 기울기는 TCR 간의 비율 C 같다점유하고 무서워 수율. C는 FRET 시스템과 사용 된 형광 (여기를 Cy3와 Cy5에)에 대한 일정한 다릅니다. 이 예는 (B). 1.988를 산출 수율 데이터는 개별 TCR의 microclusters 결정했다 FRET (N = 187, 온도 = 24 ° C) 수용체 표백의 기증자 복구를 통해. 히스토그램 막대 아래 번호 간격 내의 상한을 나타낸다. 측정 곱하여 (B)에 도시 한 데이터 (C)는 변환 (A)가 C에서 결정된 상수 수율 FRET. 바 아래 숫자 간격 내의 상한을 나타낸다. (D) 히스토그램 (세미 - 대수,베이스 = 4)의 개별 TCR microclusters 측정 2D-K D (S)의 분포를 도시. 중간 2D-K (D)는 청색으로 표시됩니다. 바 아래 숫자는 (E) (D)에 도시 한 히스토그램. 간격 내의 상한을 나타내는 INT를 전환시켰다OA 2D-K 24 ° C의 오프 시냅스 K를 사용 -histogram (반 대수,베이스 = 4)에 (0.41 S-1). 값에 결정된 중간 2D-k는 청색으로 표시됩니다. 데이터가 원래 Huppa 등. 2 년에 출판 된 새로운 형식으로 여기에 시각입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> SLB 수의 그림 5. 기능 검증은 T 세포 자극 및 이미징 위해 사용. 의 Fura-2와 함께로드 (A) TCR-트랜스 제닉 T 세포는 항원 폭발 pMHCs, ICAM-1 및 B-7을 자극하는 형질 SLB 직면 하였다. 셀룰러 340 nm의 380 nm에서 흥분의 Fura-2 방출뿐만 아니라 DIC 이미지가 기록되었다. 나타낸 바와 같이, 발광 강도 비의 값은 34로 여기0과 380 nm의는 오른쪽 창에 표시됩니다. 자극 SLB 수 접촉 pMHC이 실험 실행에 항체를 14 분 동안 차단의 첨가는 T 세포 휴식에 필적 세포 내 칼슘 농도의 저하를 초래. (B)의 평균의 Fura-2 비율의 전형적인 시간 프로파일 T를 세포는 특징이있다 항체 - 매개 봉쇄 박탈 후 항원 비 - 활성화 T 세포 또는 T 세포에 비해 2 내지 4 배 높은 세포 내 칼슘의 상승 초기. 녹색 동그라미가 (A)에 예시 된 시점을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> FRET 수용체 표백 후 FRET 기증자 복구를 통해 측정 그림 6. 벌크는 수율을 FRET. <str옹&gt; 표시됨 (A)는 전형적인 시냅스 무서워 - 측정의 예입니다. 왼쪽과 상단에 표시되어있는 바와 같이 일련의 이미지가 무서워 기증자 및 FRET 수용체 채널에 상승 제공 방출 빔 스플리터를 사용하여 인수 한 (빔 스플리터에 대한 자세한 내용은 AXMANN 참조 등 4). DIC 좌측 이미지에 표시된 선은 T 세포 시냅스의 경계를 나타낸다. (B).도 FRET 수용체 표백 (단계 4) 후 FRET 도너 채널 강도의 증가는 FRET 수용체 채널 내의 강도의 손실을 참고 개별 시냅스 영역 또는 전 시냅스에 대해 나타낸 바와 같이, 효율을 정량화 할 수있다 FRET. 검사의 경우, 이전과 FRET 수용체 표백 후 이미지는 두 개의 룩업 테이블 (LUT를, 녹색과 물리학)의 사용으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> 그림 7. 단일 분자 이벤트가 나타나 insingle 단계를 사라와 완벽하게 하나의 FRET 수용체의 형광과 정렬 FRET. 단일 분자 FRET 이벤트의 시간 경과가 표시됩니다. 이미지가 백 조명 EMCCD 카메라를 사용하여 획득 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> τ를 결정 그림 8. = 1 / 측정 smFRET 궤도에서 떨어져 케이. (A) 5c.c7 TCR 유전자 변형 T 세포 폭발이 IE를 &lt;인식 장식 H57 SCF V -AF555에서 파생 관찰 FRET 신호 (의 정규화 된 누적 금액SUP&gt; / K3-AF647는 네 개의 다른 타임 래그 (42 밀리 초, 490 밀리 초, 밀리 1,007, 1,989 밀리 초) 24 ℃)에서 관측들의 총 수의 함수로서 플로팅 하였다 K. 모노 - 지수 피팅 함수. 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 음극 역 대응을 야기 (B)의 기대 값이 지연 t 지연에 대해 도시하고, &lt;N (t 래그)&gt; 식을 이용하여 장착 = τ / 오프 {(&lt;N 표백&gt; / 오프 τ) + T 지연이} τ를 산출하고 &lt;N 표백&gt;.에 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K 조회수.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

비디오: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

양적 측정 현장에서</em독립적인 수중 Velocimetry 장치 (SCUVA)을 사용하여> 흐름

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

연구

생체공학

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...