석사 재정 및 행정 지원을위한 오스트리아 과학 기금 (FWF, J3086-B11) 및 감사의 슈뢰딩거의 교제 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다. GS와 JH는 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF, LS13-030)에 의해 지원되었다.

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The authors declare that they have no competing financial interest.

동일계에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 pMHC TCR-11 결합의 낮은 친 화성 상호 작용을 취급 할 때 특히 매우 바람직하다. 온 - 레이트뿐만 아니라 이러한 상호 작용의 안정성은 크게 결합이 일어나는 상황 하에서 특정의 영향 때문이다. 최소 침습 FRET 기반 이미징 방식 완벽 등의 작업에 적합하다 원리에 따라서, 제 아직 극복해야 할 장애물의 수를 포함한다. 자기 형광 세포에 의해 생성 된 잡음은 측정의 감도를 제한하고 따라서 최소한으로 유지되어야한다. TIRF 현미경 적으로 선택 13-15의 단백질과 장식 평면 유리 지원 지질 이중층의 형태로, 잘 (12)이 필요성을 제공하지만 유리 슬라이드의 작용을 필요로한다. 부분적 reconstitutive 접근법의 또 다른 장점은 재조합 이중층 상주 FRET 파트너 훨씬 m 될 수 있다는쉽게 작고 밝은 형광으로 양적, 사이트 별과 합리적인 방식으로 표시 광석 세포 표면 발현 된 단백질로 가능한 것보다. 이전에 2 테스트되었습니다로 TCR도는 재조합 SCF V S, T 세포의 인식에 영향을주지 않는 태그가 있습니다. 또한, SLB의 단백질 조성물은, 예를 들면 pMHCs의 밀도 및 액세서리 인자의 선택은 하나의 특정 요구에 조정될 수있다. 우리는 이전에 자극 pMHCs의 밀도 변화와 실험을 수행했지만, 오프 2D가-K 및 2D-K (D2)에서 유의 한 차이가 발견되지 않았다. 지금까지 여기 MHC 클래스 II 분자의 인식은 주로 때문에 양단이 개구들이 펩타이드 결합 틈의 특성으로 만 처리되었으며, 따라서 형광 물질을 부착하기위한 링커 펩티드를 포함 큰 수용한다. 어떤 경우에는 이러한 접근 방식은 또한 라벨의 MHC CIA 요원에 대한 작동하지 않을 수 있습니다SS 나는 16 분자하지만 큰주의는 실험에 사용을 확인하기 위해주의해야한다. 표면 플라즈몬 공진에 의해 시험 관내에서 측정 된 T 세포 증식 분석법뿐만 아니라 키네틱 결합 pMHC-TCR을 통해 측정 할 수있는 항원을 향해 T 세포의 감도는 링커 및 형광 물질에의 첨가에 의해 영향을 받아서는 안 펩티드. 또한, 내가 자신을 분자 MHC 클래스는 중쇄 (게시되지 않은 관찰)의 순서 내 짝 시스테인의 도입으로 사이트 별 방식으로 표시 할 수 있습니다. 적절한 분자 프로브를 이용하여 임의의 시냅스 단백질 - 단백질 상호 작용은 원칙적으로 본 명세서에 기재된 방법으로 연구 될 수있다. 예를 들어, 이러한 프로브는, SCF V의 또는 설계 Ankyrin 반복 단백질 (DARPins) (17)는 1가 있어야하며 관심의 상호 작용에 영향을주지 않고 안정적으로 자신의 목표를 ​​결합해야합니다. 물론, 구조 informatio를N은 합리적인 프로브 설계에 매우 바람직하지만 절대적으로 필요합니다. FRET 파트너의 새로운 쌍을 설정할 때, 그것은 기록하고 처음으로 대량으로 FRET을 분석하는 것이 좋습니다. 라벨의 부착 위치는 FRET 신호를 최대화하기 위해 상당히 변화 될 수 있고 또한 수율이 FRET 측정 염료 간 거리에 따라 다를 수 있음을 확인하기 위해. 시스템이 최적화되면, 단일 분자는 신호 10-30%에 높은 풍부 FRET 파트너의 표시를 제한하고 단일 분자 조명 분야에서 분해 될 때까지 낮은 풍부 FRET 파트너 표백에 의해 기록 될 수있다 FRET. 마지막으로 그것이 SLB 수 어떤 근사하지만 주목해야하지 생리적 세포막의 모든 측면. 이러한 막 곡률과 유연성, 도메인 구획화, 세포 골격 재 배열 및 세포 운동성뿐만 아니라 표면 발현 막 단백질의 높은 다양한로서 자질 SLB 수로 표현되지 않고 T에 영향을 미칠 수그는 조사를 받고 처리합니다. 많은 노력이 TIRF 영상에 액세스 할 수없는 생리적 인 시냅스에서 단일 분자 해상도와 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링 허용 영상 방식을 설정하는 데 투자해야합니다.

T 세포가 항원을 인식하는 방법의 근본적인 이해는 T 세포와 APC 사이에 형성된 면역 시냅스 내에서, 즉, 정확한 위치를 찾고 요구한다. 여기서, 분자 결합 동력학은 셀룰러 힘, 막 구조 및 막 단백질 사이의 측 방향 작용뿐만 아니라 시냅스 특정 기하학적 제약들을 포함하는 셀룰러 파라미터에 크게 의존하지만 관련된 상호 작용 파트너의 본질적인 생화학 적 특성에 의해 결정되지 않는다 3. 생화학 적 방법은 그들이 관련된 시냅스 막의 적어도 하나의 중단을 필요로 해상력으로 제한된다. 이러한 이유로 FRET 기반 이미징 방법은 항원 pMHCs 2 TCR의 결합을 모니터하기 위해 개발되었다. 여기에 T - 세포 재조합로 장식되어 및 사이트 특별히 TCRβ 반응 단일 사슬 항체 단편 (SCF의 V) 표시 및 계획에 직면<html> MHC 클래스 II 형광 표지 된 항원 펩티드와 함께로드 분자, 보조 자극 분자와 접착 단백질을 항구 AR 유리 지원 지질 이중층 (SLB 수). 시냅스는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 벌크 및 단일 분자 수준에서 모니터링 할 수 있습니다 FRET의 염료 표지 TCR 및 염색 표지 pMHC 결과 사이의 바인딩. 이 문서는, T 세포에 시냅스를 분석하기위한 SLB 수를 이용하는 기능성 T 세포 칼슘 플럭스 분석을 통해 자신의 무결성을 검증하는 방법을 상세히 설명하고, 실시 대량으로 단일 분자 감도 측정 FRET 및 수집 된 데이터를 분석한다. 권장 사항은 이중층 작용에 필요한 제대로 닮아 단백질을 생산에게 제공됩니다. 이중층의 형성과 적절한 TIRF 현미경 (4)를 다시 다시 게시 추가 공용 액세스 조브 간행물을 참조하시기 바랍니다의 설치에 관한보다 구체적인 내용은. 십t &quot;&gt; SLB 수의 자연 Functionalizable SLB 수 용이 두 지질 1- 팔미 토일 -2- 올레 오일 실 -Sn- gylcero -3- 포스 포 함유 단일 층 소포 (SUV의)로부터 생성 될 수있다 (단 : POPC, 90-99%) 및 1,2- dioleoyl- SN을 - 글리세로 -3 - {[N (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산] 석시} (단 : DGS-NTA 니켈 1-10 %). 깨끗한 유리 슬라이드에 도포 SUV와 인접한 평면 이중층 (4)을 형성한다. DGS-NTA-NI는 합성 NTA - 니켈 함유 헤드 그룹 (그림 1A)와 폴리 히스티딘 매개 복잡한 형성을 통해 폴리 히스티딘 태그가 단백질을 고정하는 역할을한다. 안정 협회 하나를 들어 일반적으로 접착 단백질 ICAM-1과 열두 히스티딘에게 (ICAM-1-12H, B7-1 -12H)를 포함하는 하나의 태그와 공동 자극 분자 B7-1의 기본 횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 대체합니다 (그림 1B) . 펩티드 -로드 된 클래스 II 분자 IE에서 k 개의 임베디드 막 (α 및 β) 폴리 펩타이드 쇄를 포함의. 양쪽 사슬의 트랜스 / 세포질 도메인은 각 여섯 개의 히스티딘 (IE K α β 6H 6H 또는 IE 케이 -2x6H)를 포함하는 태그로 대체되어야한다. 다른 열두 히스티딘과 α-체인을 확장하고 태그가 지정되지 않은 (12H의 β의 0H 또는 IE의 케이 -12H α IE의 K 상승을주는) β-체인의 세포 외 도메인을 떠나으로 만족스러운 결과 (그림 1B)을 발생시킨다. pMHCs의 사이트 별 라벨 그것은 의미있는 평형 결합 상수에 FRET 측정 수율을 변환 할 수하기 위해 화학 양 론적 및 사이트 구체적으로 pMHC 레이블을하는 것이 중요합니다. 이는 재조합 히스티딘 태그가 MHC 클래스 II 분자의 2,5- 펩타이드 결합 틈에로드 합성 펩티드의 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 펩티드 w로서 T 세포 에피토프의 모든 잔기를 포함엘 시스테인 다음에 짧은 C- 말단 링커 (GGS)으로 (예를 들어 나방 시토크롬 C (MCC) 펩타이드 ANERADLIAYLKQATK- GGSC에서, 링커는 굵은 글씨로 표시되어 있습니다). 이 시스테인은 말레이 미드 염료 유도체를 이용하여 화학량 론적으로 펩티드 라벨을 사용한다. 이 점에서 각별한주의가 시스테인 함유 펩타이드 정량 염료 커플 링을 확인에 전념해야한다. 펩타이드 염료 부가의 HPLC 정제를 권장하고 전기 분무 이온화 질량 분석에 의해 따라야한다. (염료없이) 펩타이드 유리체에 해당하는 모든 기록 대중은 불완전한 라벨을 반영한다. 이것이 사실이라면 라벨이 양적 것으로 간주 될 때까지, HPLC 정제 펩타이드는 염료 라벨의 연속 라운드를 실시해야한다. 이 방법은 시료의 이온화를위한 레이저 방사선을 포함 같이 MALDI-TOF 질량 분광법은 피해야합니다. 펩티드 질량 따라서 underrepre 판독되기 전에 처리는 부착 성 형광을 붕괴<html> 염료 결합의 변위량도. 가의 단일 체인 F V 조각의 사용과 셀 바인딩 TCR도의 간접 아직 사이트 별 라벨 아직 사이트 별 방식으로 살아있는 세포의 표면 관련 단백질을 세포하기 위해 염료를 부착 도전하고있다. 표면이 노출 된 TCR도 장애물을 극복하기 위해, 모노클로 날 항체 TCRβ -reactive H57-197 (2)의 유전자 발 가의 단일 쇄 버젼 (SCF V)를 구성하고있다. TCR과 착물이 항체의 결정 구조가 합리적으로 (대응 FRET 파트너 염료가 부착) MHC 관련 펩티드의 C 말단 가까이에있는 세린 잔기가 치환 된 버전을 설계 할 수있다 시스테인 잔류 물. 이 돌연변이 시스테인은 염료의 결합 (그림 2)에 대한 수용체 역할을한다. 방법론은 FRET을 기록하는 NT &quot;&gt; 벌크 FRET 값은 선택된 간 염료의 거리 사이의 관계를 확인하는 것이 가장 적합하며, 시스템 (2) 결합이 TCR-pMHC 측정 효율을 FRET. 또한, 벌크 FRET 측정은 시냅스 TCR-pMHC 유사성의 정량적 차이 (공개 아래 참조) 및 프로토콜 3.2. 문헌 6에 도입 된 FRET 효율을 정량화하기위한 다양한 접근 방법을.이 문서 FRET을 통해 기록에서 (a) 도너 복구 셉터 표백 후, 비아 (b)는 FRET 수용체 방출을 증감. 첫 번째 방법 (A)은 용이하게 광 퇴색 될 수 FRET 수용체, 오히려 광 안정성이다 도너의 사용을 필요로한다. 또한 이는 광 퇴색 셉터 더이상 도너 형광 급냉 할 수없는 것을 보장하는 것이 중요하다. 같은 감지 채널 (기증자)를 정량에 사용되는 바와 같이, 어떤 보정 요인 없습니다D 더 색수차는이 방법론 간단하고 신뢰성을 렌더링하는 고려되어야 할 필요가 없습니다. 그러나, 정량적 측정이 동일한 표본 지점에서 반복 될 수없고 FRET의 변화는 시간에 기록 할 수 없다. (수용체 표백 전) 첫 번째 무서워 기증자와 (FRET 수용체 표백 후) 두 번째 FRET 공여 이미지 수집 사이를 통과하는 시간을 최소화 분자 확산 또는 빠른 표백 단계를 목적으로한다 세포 운동에 의해 발생 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 조명 및 표백 시간을 최소화하기 위해 FRET 셉터 여진 파장의 강력한 레이저 광원을 사용하는 것이 권장된다. 반면, (b) 방출 민감화 FRET 측정 접근법 FRET 도너는 흥분과 FRET 수용체의 발광은 FRET 수용체 채널에서 관찰된다. FRET 수용체 신호의 변화가 적색 편이 수용체 채널로 시간 만 무서워 기증자의 방출을 통해 기록 할 수있다 (Termed bleedthrough) 정확하게 결정하고 기록 FRET 수용체 채널에서 공제 할 필요가 기증자 여기를 통해 수용체 크로스 여기를 FRET. 이를 위해 FRET 도너 대응하고 FRET 셉터 이미지 공간적으로 정렬되어야한다. 단일 분자 검출 (SM) 이벤트를 FRET 여기 원, 민감한 카메라와 노이즈 감쇠 TIRF 현미경으로서 레이저를 이용하여 하나의 형광체의 형광 쉽게 시간 동안 추적 될 수있다. 유사한 분자간 smFRET 이벤트의 검출을위한 사실이다. 그러나 합병증 FRET 도너 bleedthrough 및 FRET 수용체의 가교 자극에 의​​해 발생하고, 따라서 세심 smFRET 실험에서 형광 밀도를 조정할 때는주의가 필요하다 할 수있다. 아래의 프로토콜 (프로토콜 섹션 4)에서 TCR 낮은 풍부 FRET 수용체 높은 풍부하고 pMHC에 무서워 기증자로 선정되었다. FR을 감쇠충분히, 형광 SCF (V)과 비 형광 SCF의 V를 사용하여 TCR도의 90-70%와 TCR도 10-30 %에 장식 bleedthrough 동부 기증자. 그것은 하나의 분자와 공 초점이 채널을 FRET 때문에 여기 FRET 수용체 채널은 단일 분자 채널로 선택되었다. 이 smFRET 검증의 기초가 무서워 수용체 단일 분자와 smFRET 이벤트를 정렬하는 데 도움이됩니다. smFRET 측정을 통해 시냅스 오프 비율을 추출 양자의 광표백은 도너와 억 셉터를 FRET는 단일 분자의 상호 작용이 트레이스를 FRET의 반감기를 추출 할 때 고려되어야 할 FRET. 단일 도너 - 억 셉터 페어로서의 외관 N의 시작-FRET 관찰 신호의 수 (0) 수용체 - 리간드 복합체의 양 및 광표백 바인딩 해제하여 시간이 지남에 따라 감소된다. 다음과 같이 주어진 시간 N (t)에서 단지 생존 수는 수학적으로 표현 될 수있다 : 광표백 용어 특급 (-t / τ 표백제)의 시간 t는 즉 표백 만 조명시 발생 관찰 수 (N)의 생성물 및 (인해 비 연속적, 불연속 관찰 모드의 병, 조명 시간 t에 의해 설명된다 ). 운동 기간 exp- (t / τ OFF) 시간 t가 관찰 수 (N)의 곱과 단일 FRET 관찰 (즉, 결합 해제 운동이 연속적으로 발생 함)에 대한 시간 t 래그 내이다. 수학 식 1과 같이 표현 될 수있다 : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> 용어 τ 표백제 / τ 아픈 데백화가 발생하고, 기대 값이 &lt;N 백제&gt;로서의 지수 함수 정의 될 때까지 관찰의 수를 cribes. 다음과 같이 수학 식 2를 단순화 할 수있다 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> 시간 t-FRET 관찰 후 이벤트와 프레임의 수 N (t)의 기대 값은 &lt;N (t 래그)&gt; 직접 실험으로부터 결정된다. 이 실험에서 선택된 관측 (t 래그) 및 τ 오프 (OFF k는 오프 - 속도의 역수)에 대한 미지의 값의 설정 가능한 시간에 따라 표백이 발생하기 전에, 관측 횟수의 기대 값을 &lt;N 백제&gt; . 따라서, t의 적어도 두 값의 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 계산 <sub&gt; 지연이 &lt;N 표백&gt; 오프 τ의 실험적인 결정을 할 수 있습니다. FRET 기반의 측정을 통해 시냅스 2D-K D 값을 추출 TCR 점유 즉, 바인딩 TCR도 총 TCR도 사이의 비율을 측정, 시냅스 2D-K D의 값을 결정하는 핵심이다. 한 TCR도가 무서워 기증자와 pMHCs 무서워 수용체로의 역할로 산출 프렛 측정에 식 (4)에 따르면이 용어는 직접적으로 비례한다. <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> = TCR 점유율과, C는 = 환산 계수 C는 FRET 시스템에 의존하고 형광체가 사용되는 상수이다. 아래 그림과 같이이 실험적으로 결정될 수있다. 수학 식 5에있어서, 2D-K D로 전환 될 때종래 이중층에 T 세포의 첨가로 TCR 리간드의 초기 밀도가 공지되어있다. 이는 SLB 부착 단백질의 높은 이동성의 SLB 수이며, 또한 (2)의 리간드는 거의 무진장 저장조를 제공하기 때문이다. <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [pMHC의 초기]는 종래의 T 세포에 첨가 pMHC의 초기 밀도를 함께 = 식 4, 5 일 지금 쉽게 TCR 및 pMHC 사이의 시냅스 2D-K D를 확인할 수 있습니다. 이것은 가장 확실 수용체 표백 (프로토콜 3.1 절 참조) 후 기증자의 회복을 기반으로 FRET 측정으로 이루어집니다. 그러나, C에게 내가 FRET FRET 세기 간의 관계를 측정하고 TCR 점유 결정한다 (배경에 대해 보정, FRET 도너 및 억 셉터 bleedthrough 교차 여진은 FRET). 이를 위해, 하나의내가 기증자를 FRET과 단일 분자의 평균 강도 사건이 난 FRET SM FRET 단일 TCR 관련 FRET 기증자 형광 (예를 Cy3 또는 AF555) SM의 평균 형광 강도의 비 (R)를 알 필요가있다. R은 형광 검출에 사용되는 질문, 배출 필터와 카메라의 FRET 체제에 따라 다릅니다. TCR은 다음 직접 식 6에 따라 결정될 수있다 점유. <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = SM과 내가 FRET 기증자 / SM을 FRET R은 리드 H57 scFv-를 Cy3 / pMHC-Cy5의 시스템에 대한 1.45로 하였다 : = 대량 나는 1.45 • / 대량 나는 TCR-CY3을 FRET TCR 점유 및 FRET 수율 사이의 관계는 FRET 공여체에 의해 결정될 수있다 복구수용체 표백 후 Y. 선형 피팅 그림 4A 국지적 인 슬로프에서와 같이이 두 매개 변수가 숫자 TCR의 microclusters에 대해 서로에 대해 플롯은 (식 4)에서 변환 계수 C를 나타냅니다. 1.995로는 Cy3 / Cy5의 pMHC-FRET 시스템 및 (b) 가해 현미경 시스템 구성 -도 4a에서 설명 된 바와 같이, C가 (a)의 V H57 SCF 대한 금액. TCR은 다음과 같이 용이하게 추론 될 수 점유 : TCR 점유 = 1.995 • 산출 FRET

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>insect cell media for baculo virus production</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>insect cell media for baculo virus expression</td></tr><tr><td>Sf9 cells</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>cells for virus production and expansion</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>cells for potein expression</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Centramate cassette 10kDa cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, cell permeant</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>for dissolving fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>imaging buffer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>supplement for imaging buffer</td></tr><tr><td>14-4-4S antibody</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &amp;micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for fura-2-based calcium measurements&amp;nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for (single molecule) FRET measurements</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>planar supported lipid bilayers</td><td></td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, with L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T-cell media</td></tr><tr><td>non-essential amino acid 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>mouse interleukin-2 recombinant protein</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Research Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Origin (analysis program)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td><td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

의 Fura-2 칼슘 염료 통하여 세포 내 칼슘의 기록뿐만 아니라 후속 셀룰러 분석 자극 효능 및도 4에 도시되어 SLB 수의 따라서 기능을 확인하기 위해. 분명하게 된 바와 같이, 칼슘 농도는 다음과 같이 표현 (T 세포 상승 기준 즉시 즉시이 자극 SLB 수에 정착으로) 1 인 정규화의 Fura-2 시간 조사 / 380 ㎚ ​​비율. 칼슘 농도가 곧 TCR 결합 이로부터 차단 pMHCs가 T 세포 활성화를 종료 항체의 첨가 후에 기준선 수준으로 복귀. 도 6은 (도 4에 도시) FRET 수율을 측정하기 위해 채용되며, 2D-K D 값을 산출하는 역할을하는 셉터 표백 후 FRET 도너 회복과 관련된 대표적인 실험을 도시한다. 무서워의 신속하고 완전한 절제 후 AF555을 통해 표시 TCR을 나타냅니다 무서워 기증자 강도의 증가를, 양해 해 주시기 바랍니다cceptor 종 (여기서는 pMHCs과 관련된 AF647). 또한 분명이 무서워 채널에 강한 감소는, 즉, FRET 수용체 표백 후 FRET 공여 여기에서 FRET - 수용체 채널. 거의 보이지 나머지 신호는 기증자 bleedthrough을 FRET에 해당합니다. 개별 TCR의 microclusters 또는 전체 시냅스 내 무서워 수익률을 계산 표시된 측정 된 강도 값 (그림 6B)을 기반으로합니다. 그림 7은 두 시간 프레임에서 볼 수 단일 분자 FRET 이벤트의 궤적과 시간 경과를 나타낸다. 도입에 위에서 설명한 것과 같은 행동은 모두 결합 시냅스 TCR-pMHC의 부패와 광표백에 의해 발생합니다. 이러한 두 가지 기여를 구별하기 위해, 실험 획득 시간 프레임은 지속 기간에서 가변 할 수있다 : 광표백은 일정하게 유지하면서, FRET 이벤트 궤도 길이의 변화에​​만 결합 동력학에 의해 야기된다. tracelengths의 정량, W<html> HICH도 7에 도시 된 오프 - 속도와 표백의 계산을위한 기초를 형성한다, (3) 표 1에 제공된다. 2D-K D의의 결정은 대량의 녹음이 무서워 - 기증자 표시 TCR도에 대한 수율을 FRET이 필요합니다. 실험적으로 유추 상수 C (도 4)의 사용으로, TCR의 microcluster 또는 전체 시냅스 측정 FRET 수율 TCR로 점유 전환 될 수있다, 즉, pMHC - 결합 및 총 TCR도의 비 (도 4C) . 종래 T 세포에 첨가 SLB에 본 공지 pMHC 밀도로, 값은 시냅스 2D-K D 값 (도 4d)를 결정하기 위해 적용될 수있다. 온 속도는 질량 작용의 법칙으로 계산 될 수있다 (에 2D-K = 2D-K / 2D-K D를) 결정 시냅스에서 오프 속도와 2D-KD 값. 1 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; 도 1의 평면 유리 지원 지질 이중층 (SLB) 시스템의 개략 회로도. (A) SLB 수는 해당 지질로 구성된 POPC (90-99%) 및 합성 지질 DGS의 Ni-NTA (1-10%)로 구성하고 깨끗한 유리 표면이 작은 단일 층 소포 (포드 SUV)으로 충전되면 자발적으로 형성된다. (B)가 형성되면, 예컨대 SLB 수는 T 세포에 대한 장갑차 역할을하는 수용성 폴리 히스티딘 - 태그 pMHCs 세포 유래의 부분, 보조 자극 B7-1 단백질과 ICAM-1의 접착 단백질로 작용 화 될 수있다. SLB 수를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 AXMANN 등. (4)를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> 2. 포스터 공명 에너지 재 전송 기반의 분석은 TCR-pMHC가 현장에서 바인딩을 정량한다. (A) pMHC 결합 H57 단일 사슬 단편과 복합 TCR의 복합 구조물은 본원에 기재된 FRET 기반 접근법 나타낸다. 약 41A FRET을받은 두 대응하는 형광 물질을 분리하는 짧은 거리를합니다. 형광 - 말레이 미드에 대한 수용체 사이트는 녹색과 빨간색으로 표시됩니다. (B)는 현장에서 TCR-pMHC 상호 작용을 검출하는 원리가 설명된다. 만 SCF V는 특정 복합체를 형성 TCR도 및 pMHCs (여기에 IE의 k)를, -decorated, 측정 FRET 신호에 상승을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;/&gt; 도 SCF V S 단량체와 펩티드 -로드 된 IE의 K -2x6H 분자 최종 겔 여과 단계주는 상승 3. 크로마토. X 축이 용액에 보유 체적을 나타내고, Y 축에는 임의의 단위로 280 nm에서 (AU)을 흡광도를 나타낸다 . (A) H57 SCF의 V 부위 - 특이 알렉사 형석 555 말레이 미드 단백질 (단계 1.2.5)에서 미 반응 된 염료를 분리 S75 크로마토 그래피로 표지. 고정 간격으로 14 - 15 ㎖ (점선)에 대응 분획 단량체 H57 SCF의 V 라벨링 나타낸다. UV 분해성 ANP 공간 홀더 펩타이드 복합체 (B) IE의 유전율 -2x6H 분자하면, UV가 조사 된 부위 - 특이 알렉스 함께 배양했다 647 말레이 미드 표지 펩티드​​ 마지막 자유 펩티드 (단계 1.1.2.4)로부터 단백질을 분리하는 S200 크로마토. 포함이 제대로 접혀 점선과 단량체 pMHCs 사이의 간격. (A, B) </strong는&gt; 0.7 ml의 샘플 럼 (0 mL의 점)의 시작 컬럼에 적용 하였다. 수집 된 분획을 농축 하였다. 단백질을 염색 비율 전에 PBS / 50 % 글리세롤에 대한 투석에 photospectrometry에 의해 결정되었다 (-20 °에서 저장). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> 그림 4. 결정 2D-K D S와 S의 2D-K. (A) 수용체의 표백 및 TCR 점유율이 실험적으로 측정 한 후 기증자의 회복에 의해 결정되는 FRET 수익률 사이의 상관 관계. 4.2 절에 설명 된대로 TCR 점유율은 개별 TCR의 microclusters에 대해 판단 할 수있다. 상기 데이터의 선형 피팅을 행함으로써 표시의 기울기는 TCR 간의 비율 C 같다점유하고 무서워 수율. C는 FRET 시스템과 사용 된 형광 (여기를 Cy3와 Cy5에)에 대한 일정한 다릅니다. 이 예는 (B). 1.988를 산출 수율 데이터는 개별 TCR의 microclusters 결정했다 FRET (N = 187, 온도 = 24 ° C) 수용체 표백의 기증자 복구를 통해. 히스토그램 막대 아래 번호 간격 내의 상한을 나타낸다. 측정 곱하여 (B)에 도시 한 데이터 (C)는 변환 (A)가 C에서 결정된 상수 수율 FRET. 바 아래 숫자 간격 내의 상한을 나타낸다. (D) 히스토그램 (세미 - 대수,베이스 = 4)의 개별 TCR microclusters 측정 2D-K D (S)의 분포를 도시. 중간 2D-K (D)는 청색으로 표시됩니다. 바 아래 숫자는 (E) (D)에 도시 한 히스토그램. 간격 내의 상한을 나타내는 INT를 전환시켰다OA 2D-K 24 ° C의 오프 시냅스 K를 사용 -histogram (반 대수,베이스 = 4)에 (0.41 S-1). 값에 결정된 중간 2D-k는 청색으로 표시됩니다. 데이터가 원래 Huppa 등. 2 년에 출판 된 새로운 형식으로 여기에 시각입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> SLB 수의 그림 5. 기능 검증은 T 세포 자극 및 이미징 위해 사용. 의 Fura-2와 함께로드 (A) TCR-트랜스 제닉 T 세포는 항원 폭발 pMHCs, ICAM-1 및 B-7을 자극하는 형질 SLB 직면 하였다. 셀룰러 340 nm의 380 nm에서 흥분의 Fura-2 방출뿐만 아니라 DIC 이미지가 기록되었다. 나타낸 바와 같이, 발광 강도 비의 값은 34로 여기0과 380 nm의는 오른쪽 창에 표시됩니다. 자극 SLB 수 접촉 pMHC이 실험 실행에 항체를 14 분 동안 차단의 첨가는 T 세포 휴식에 필적 세포 내 칼슘 농도의 저하를 초래. (B)의 평균의 Fura-2 비율의 전형적인 시간 프로파일 T를 세포는 특징이있다 항체 - 매개 봉쇄 박탈 후 항원 비 - 활성화 T 세포 또는 T 세포에 비해 2 내지 4 배 높은 세포 내 칼슘의 상승 초기. 녹색 동그라미가 (A)에 예시 된 시점을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> FRET 수용체 표백 후 FRET 기증자 복구를 통해 측정 그림 6. 벌크는 수율을 FRET. <str옹&gt; 표시됨 (A)는 전형적인 시냅스 무서워 - 측정의 예입니다. 왼쪽과 상단에 표시되어있는 바와 같이 일련의 이미지가 무서워 기증자 및 FRET 수용체 채널에 상승 제공 방출 빔 스플리터를 사용하여 인수 한 (빔 스플리터에 대한 자세한 내용은 AXMANN 참조 등 4). DIC 좌측 이미지에 표시된 선은 T 세포 시냅스의 경계를 나타낸다. (B).도 FRET 수용체 표백 (단계 4) 후 FRET 도너 채널 강도의 증가는 FRET 수용체 채널 내의 강도의 손실을 참고 개별 시냅스 영역 또는 전 시냅스에 대해 나타낸 바와 같이, 효율을 정량화 할 수있다 FRET. 검사의 경우, 이전과 FRET 수용체 표백 후 이미지는 두 개의 룩업 테이블 (LUT를, 녹색과 물리학)의 사용으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> 그림 7. 단일 분자 이벤트가 나타나 insingle 단계를 사라와 완벽하게 하나의 FRET 수용체의 형광과 정렬 FRET. 단일 분자 FRET 이벤트의 시간 경과가 표시됩니다. 이미지가 백 조명 EMCCD 카메라를 사용하여 획득 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> τ를 결정 그림 8. = 1 / 측정 smFRET 궤도에서 떨어져 케이. (A) 5c.c7 TCR 유전자 변형 T 세포 폭발이 IE를 &lt;인식 장식 H57 SCF V -AF555에서 파생 관찰 FRET 신호 (의 정규화 된 누적 금액SUP&gt; / K3-AF647는 네 개의 다른 타임 래그 (42 밀리 초, 490 밀리 초, 밀리 1,007, 1,989 밀리 초) 24 ℃)에서 관측들의 총 수의 함수로서 플로팅 하였다 K. 모노 - 지수 피팅 함수. 기대 값 &lt;N (t 래그)&gt;의 음극 역 대응을 야기 (B)의 기대 값이 지연 t 지연에 대해 도시하고, &lt;N (t 래그)&gt; 식을 이용하여 장착 = τ / 오프 {(&lt;N 표백&gt; / 오프 τ) + T 지연이} τ를 산출하고 &lt;N 표백&gt;.에 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K 조회수.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

비디오: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the environment, a cell must be able to recognize and process it. This task mainly relies on the function of membrane receptors, whose role is to convert signals into the biochemical language of the cell. G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptor proteins in humans. Among GPCRs, metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are a unique subclass that function as obligate dimers and possess a large extracellular domain that contains the ligand-binding site. Recent advances in structural studies of mGluRs have improved the understanding of their activation process. However, the propagation of large-scale conformational changes through mGluRs during activation and modulation is poorly understood. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) is a powerful technique to visualize and quantify the structural dynamics of biomolecules at the single-protein level. To visualize the dynamic process of mGluR2 activation, fluorescent conformational sensors based on unnatural amino acid (UAA) incorporation were developed that allowed site-specific protein labeling without perturbation of the native structure of receptors. The protocol described here explains how to perform these experiments, including the novel UAA labeling approach, sample preparation, and smFRET data acquisition and analysis. These strategies are generalizable and can be extended to investigate the conformational dynamics of a variety of membrane proteins.

This study presents a detailed procedure to perform single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) experiments on G protein-coupled receptors (GPCRs) using site-specific labeling via unnatural amino acid (UAA) incorporation. The protocol provides a step-by-step guide for smFRET sample preparation, experiments, and data analysis.

단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

생화학

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

생물학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

생체공학

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

인간 PBMC의 미토콘드리아 기능에 대한 고분해능 분석

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these changes&#160;do not always reflect what occurs in other tissues, such as skeletal muscle, these cells are an accessible and valuable source of viable mitochondria from human subjects. PBMCs are exposed to systemic signals that impact their bioenergetic state. Thus, expanding our tools to interrogate mitochondrial metabolism in this population will elucidate mechanisms related to disease progression. Functional assays of mitochondria are often limited to using respiratory outputs following maximal substrate, inhibitor, and uncoupler concentrations to determine the full range of respiratory capacity, which may not be achievable in vivo. The conversion of adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) by ATP-synthase results in a decrease in mitochondrial membrane potential (mMP) and an increase in oxygen consumption. To provide a more integrated analysis of mitochondrial dynamics, this article describes the use of high-resolution fluorespirometry to measure the simultaneous response of oxygen consumption and mitochondrial membrane potential (mMP) to physiologically relevant concentrations of ADP. This technique uses tetramethylrhodamine methylester (TMRM) to measure mMP polarization in response to ADP titrations following maximal hyperpolarization with complex I and II substrates. This technique can be used to quantify how changes in health status, such as aging and metabolic disease, affect the sensitivity of mitochondrial response to energy demand in PBMCs, T-cells, and monocytes from human subjects.

저자 스포트라이트: 폐활량 측정법을 사용한 PBMC 미토콘드리아 반응에 대한 새로운 통찰력

Methods for studying mitochondrial bioenergetics under physiologically relevant substrate concentrations in immune cells are limited. We provide a detailed protocol that uses high-resolution fluorespirometry to assess changes in the response of the mitochondrial membrane potential to energy demand in human T-cells, monocytes, and peripheral mononuclear cells.

TCR-pMHC 바인딩 측정

요약

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