마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

요약

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

초록

생체내에서는 대뇌 피질 기능의 영상은 intracranial 환경의 방해없이 뇌로 광 액세스가 필요합니다. 우리는 직경 몇 mm에 걸쳐 그리고 수 개월 동안 안정 마우스 두개골에 광택과 철근 thinned 두개골 (포트) 윈도우를 구성하는 방법을 제시한다. 두개골이 광학 선명도를 달성하는 훈련을 실​​시 손으로 두께 10-15 μm의에 thinned하고 있으며, 다음으로 cyanoacrylate 접착제와 덮개 유리로 중첩됩니다 : 1) 강성, 2를 제공하는 것은) 뼈 regrowth을 억제하고 3) 빛의 산란을 감소 뼈 표면에 부정에서. 두개골이 터진 않았으므로, 공부중인 프로세스에 영향을 미칠 수있는 염증이 크게 줄어 듭니다. 최대 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의로의 이미징 깊이는 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 창문은 잘 anesthetized 정신 모두 준비에서 대뇌 혈류와 세포 기능을 공부하기 적합합니다. 그것은 더 이상 작전을 제공합니다portunity는 optogenetics를 사용하여 세포의 활동을 조작하거나 photosensitizers 순환의 조사의 대상이 혈관의 혈액 흐름을 방해한다.

프로토콜

1. 수술 준비하기 ^전

1. 초음파 세척기의 Maxizyme, 외과 우유의 혼합물에 sonicating하여 수술 도구를 청소합니다. 각 실험 전에 수술 도구를 압력솥.
2. 필요한 모든 시약과 disposables를 사용할 수 있는지 확인합니다. 시약 및 disposables의 목록은 표 2에 제공됩니다. 가능하면 노출된 조직과 접촉 시약 및 disposables는 살균해야합니다.
3. 마취를 유도. 생존 연구에 적합한 일반 anesthetics는 표 1에 설명되어 있습니다. 발가락 핀치 반사의 부족으로 확인하여 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 마우스의 최적의 나이는 생후 3-6주입니다. 어린 생쥐의 두개골은 부드럽고 얇은 더 어렵습니다. 이전 마우스는 벗겨 절차를 수행하는 동안 더 피를 봐야 두꺼운 두개골이 있습니다.
4. stereotaxic 프레임 ^1에서 동물을 고정합니다. 수술 장비의 목록은 표 2에 제공됩니다.
5. 몸의 온도를 유지37 진짜야 ° C에서 피드백 규제 직장 프로브 및 열 패드를 사용합니다.
6. 수분을 유지하기 위해 눈에 안과 연고를 바릅니다.
7. 작은 전기 면도기로 머리를 면도.
8. 70% (V / V) 이소 프로필 알콜과 함께 보라고 뒤에 Betadine로 두피를 청소합니다.
9. 원하는 경우 심장과 호흡 속도는 펄스 산소 농도계를 사용하여 정상 범위 내에 있는지 확인하십시오. 마우스, 숫자는 각각 약 10 센터와 2 Hz에서해야합니다.
10. 37 ° C (125 MM NaCl, 10 MM 포도당, 10 밀리미터 HEPES, 3.1 MM CaCl _2, 1.3 밀리미터 MgCl _2, 산도 7.4) (시그마에서 모든 화학 물질)로 멸균-필터링된 인공 대뇌 척수 (ACSF)의 나누어지는을 따뜻하게 ^2.

2. 헤드 프레임 마운트

1. 포셉, 외과 가위로 전체 지느러미 두개골 표면을 통해 두피를 제거합니다. 두개골 및 게시물의 양쪽에 laterally 측두엽 근육의 가장자리에 피부 손질목 (그림 1A)의 근육에 erior.
2. 두개골의 표면에서 얇은 골막을 제거 메스 블레이드를 사용하십시오.
3. 젖은 솜으로 두개골을 청소 작은 주걱을 끌어내려하고 먼지 수에서 공기의 흐름으로 두개골 표면을 건조. 그런 다음 전체 두개골 표면 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 접착제의이 계층은 후속 단계에서 치과 시멘트의 적절한 준수가 필요합니다. cyanoacrylate 접착제는 소독을 할 필요가 없습니다.
4. 멀리 원하는 창의 영역에서 두개골 표면에 금속 커넥터를 연결합니다. anesthetized 준비 들면, 작은 너트는 나중에 볼트를 사용하여 이미지 설정 (그림의 1B, 1L와 1N)으로 망하는 수 cyanoacrylate 접착제의 명인과 두개골을 확보할 수 있습니다. 접착제가 두개골에 첨부하는 동안 스레드를 입력하지 않도록 테이프로 너트의 뒷부분을 밀봉합니다. 너트와 테이프은 멸균 처리 해야해 이전 수술에 의한 autoclaving.
5. 깨어 이미징 준비를 위해 두 개의 첨부 지점 (그림 1M와 1N)으로보다 엄격한 정의 커넥터를 연결합니다. ½ mm 드릴 버와 contralateral 피질 반구 위에 두개골에 구멍을 뚫을 및 후 두 # 000 셀프 태핑 나사를 소개합니다. 이러한 나사는 머리 두개골에 마운트 정박하는 데 도움이됩니다. 기본 피질에 압력을 적용하지 않도록하기 위해, 나사의 한 차례를 적용합니다. 그런 다음, 소뇌 이상 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량으로 정의 금속 크로스 모음을 첨부합니다. cyanoacrylate 접착제가 완전히 건조하도록 허용합니다. 이 금속 커넥터는 크게 자유의 학위를 감소시키고 길이 방향의 연구에 동일한 이미징 분야의 재배치를 단순화합니다. 넓은 크로스 바는 vibrissae의 전극 배치 및 자극을위한 충분한 공간을 제공합니다. 사용자 정의 헤드 마운트 및 첨부 장치를 생성하는 상세한 계획은 온라인에서 구할 수 있습니다 (그를 이길 / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). 나사와 크로스 바 전에 수술에 autoclaving 소독을해야합니다.
6. 치과 시멘트의 계층과 윈도우의 위치 (그림 1C 및 1D) 제외, 전체 두개골 표면을 커버. 피부의 모든 노출된 가장자리는 시멘트로 덮여 있는지 확인하십시오. 치과 시멘트의 구성 요소는 멸균 처리하지 않아도됩니다.

3. 번쩍의 생성 및 Thinned-해골 (포트) 창 강화

1. 드릴 털은 날카로운 것을 확인하고이를 재사용하지 마십시오. ½ mm 버와 somatosensory 피질 이상 2mm 지역으로 2mm 얇은 치과 훈련에 낮은 속도를 사용합니다. 냉각을위한 땀 및 썼음을위한 건조, ACSF으로 두개골을 wetting 후 가스 살포기에서 공기의 부드러운 흐름으로 두개골 표면을 건조 사이의 대체. 이것은 과다 출혈 있습니다 두개골의 해면 모양의 계층을 통해 썼음 필요하지만 controll 수ACSF (그림 1E)으로 세정하여 에드. 두개골은 ~ 50 μm의이며, pial 혈관이 젖었 뼈 (그림 1 층)를 통해 볼 수있을 때 훈련의 약간의 압력을 받고 굽히는 시작한다. 이 두께에서는 뼈 사이 작은 흰 반점이 건조 두개골 표면이 moistened되는 직후 몇 초간 표시가됩니다.
2. 이 시점에서, 뼈를 얇은 더욱. 단지 약간의 터치와 함께 두개골 표면을 미는 느린 훈련 속도, 즉, 1000 RPM을 사용하십시오. 펜처럼 훈련을 누른 상태에서 작은 움직임 제어를 사용하고 오직 측면 방향으로 힘을 적용됩니다. 뼈가 최종 두께 (그림 1G)에서 10-15 μm의를 낙제야해야합니다. 건조 두개골 표면이 moistened 때 뼈를 충분히 얇은되면 뼈에 작은 흰 반점은 더 이상 볼 수 없습니다.
3. 주석 산화물 분말과 윈도우 영역을 갈고 닦아서. 실리콘 수족관 밀봉 재와 함께 담근되어 미리 만든 드릴 비트를 첨부테이퍼 채찍을 (삽입된 페이지, 그림. 1H) 떠나, 그린. 실리콘 채찍은 수술 전에 최소한 하나의 하루를 준비하고 사용하기 전에 이소프로판올 70%로 소독해야한다. ACSF (그림 1H)의 방울과 함께 창을 분말의 작은 핀치를 놓습니다. 부드럽게 두개골 표면으로 이동 채찍의 끝을 만져 의해 10 분 동안 창문을 통해 슬러리를 선동. ACSF를 사용하여 창문에서 철저하게 주석 산화물 분말을 멀리 플러시와 공기의 부드러운 흐름과 함께 철저하게 뼈를 건조. 이전 단계에서 드릴링으로 남아 표면 불규칙과 자기편 골 칩은 연마 (그림 1H와 1I) 이후에 제거하여야한다. 주석 산화물 분말은 멸균 처리하지 않아도됩니다.
4. 노 평방 조각을 잘라. 윈도우의 크기보다 약간 작은 공 덮개 유리. 부드럽게 스트레이트 에지를 사용하여 커버 슬립으로 구분하여 수평 및 수직 라인을 득점하는 학자를 사용합니다. 그렇다면 배양 접시와 KN에서 커버 슬립을 배치유리 조각을 분리하기 위해 테이블​​ 가장자리로부터 요리를 ock. 전체 배양 접시 그런 다음 불임을 보장하기 위해 autoclaved 수 있습니다.
5. 적절한 규모의 커버 유리 근처 말린 창을 놓습니다. 부러진 나무 목화 팁 작은 주걱의 끝부분을 사용하여 창을 통해 cyanoacrylate 접착제의 작은 소량을 적용하고, 신속하게 접착제 꼭대기 커버 유리 precut 조각을 밀어. 커버 유리 밑에 거품을 생성하지 마십시오. 부드럽게 두개골 표면에 대한 커버 유리를 밀고하고, 몇 초 (그림 1J 및 1O)을 누르고 있습니다. 접착제 15 분 이상 완전히 건조하도록 허용합니다. 그것이 건조 후 초과 cyanoacrylate 접착제는 메스 블레이드로 커버 유리의 위쪽 표면에서 제거할 수 있습니다. 치과용 시멘트와 커버 유리의 가장자리를 밀봉하고 형성 약간 마른 렌즈 (그림의 1K 및 1O)에 물을 잡고 잘 키웠습니다.

4. 회복

1. 따뜻한 케이지 다음과 같은 수술에 동물을 배치합니다. 을 모니터링동물은 정기적으로 그것은 완전히 마취에서 회복까지.
2. 준비가 하루 이상 생존하기위한 경우 진통제에 대한 buprenorphine을 (G의 설치류 당 0.03 μg)을 제공합니다. 초기 주입 후 우리는 일반적으로 이미지 동물 적어도 하나의 하루.

5. 이미징 준비

1. 머리 지원 (그림 1L와 1M)와 같은 프레임을 사용하여 이미징을위한 광학 브레드 보드에 동물을 안정화. 구속 장치는 Qioptiq 또는 ThorLabs에서 상용 optomechanical 구성 요소로 만들 수 있습니다. 각자의 접시는 동물과 하나의 단위 ^3로 조립된 모든 생리적 모니터링 장치와 외과와 두 광자 이미징 스위트 사이에 옮겨질 수 있습니다.
2. 혈액 흐름 이미징이 원하는 경우 5 % 0.05 ML (W / V) 형광등-dextran 염료는 혈액 혈청 (그림 2A와 2C 2 시간에 레이블을 지정하는 두 꼬리 정맥 또는 infraorbital 정맥을 통해 무균 식염수에 용해 투입 ) ^4-7. 이것은 전신 마취하에 수행되어야합니다. dextran 솔루션보다 점성만큼 Infraorbital 정맥 관리는 초보자를 위해 쉽게있을 수 있습니다. 꼬리 정맥은 어두운 색의 생쥐에서 찾을 어려울 수 있으며, 정맥은 실패 주사 후 축소하는 경향이있다. 녹색 발광과 이미징 vasculature 들어, 플루오레신 isothiocyanate dextran을 사용합니다. 붉은 방출 들면, 텍사스 레드 dextran을 사용합니다. 높은 분자량의 dextrans으로 염료는 여러 시간 동안 순환에 남아 있습니다. 또는 내생 형광 레이블과 동물은 적절한 두 광자 여기 파장에 직접 몇 군데하실 수 있습니다. dextran 솔루션은 나중에 사용할 수 aliquots 동안 얼어있을 수 있습니다.
3. 부드럽게 젖은 솜으로 윈도우 표면을 청소하는 것은 작은 주걱 줬지.
4. anesthetized 준비 장시간 이미징 들어, 체액 및 에너지 요구 사항을 유지하기 위해 g 2 시간마다 당 3 μL의 볼륨에서 멸균 lactated 울리는의 솔루션 intraperitoneally을 주입.
5. 언제 깨어있는 상태에서 이미징 동물, 스트레스 수준을 줄이기 위해 한 번에 몇 시간에 머리 구속을 제한하고 있습니다. 음식과 물을위한 이미징 세션 사이의 홈 새장에 동물을 반환합니다.

6. 대표 결과

성공 창이 몇 달 동안 pial 표면 아래 250 μm의로 이미징 깊이를 최대 수 있습니다. 이 방법은 대뇌 피질의 실질 ^팔 안에 생체내 모세관 혈액의 흐름 ^{4, 8,} microglial 활성화 ^{8, 9,} 돌기 구조를 공부하는 데 사용되었습니다. 한 예로, 우리는 혈액 혈청은 텍사스 레드 dextran (그림 2A)의 정맥 주사에 의해 표시된 후, anesthetized Thy1 - 노란색 형광 단백질 (YFP) 마우스의 대뇌 피질 vasculature을 보여 두 광자 이미징을 사용합니다. Dural 혈관은 종종 약간 경질의 mater에서 대뇌 피질의 표면 (그림 2C, 화살표) 위에서 볼 수 있습니다. 대형 pial arterioles 및 venules 리대뇌 피질의 표면에 전자 (그림 2D). 그들은 대뇌 피질의 조직에 영양을줍니다 고밀도 모세관 침대 (그림의 2E까지 2 시간)으로 가지를 내다 피질로이 표면 네트워크 및 다이빙에서 관통 혈관 지점. 대뇌 피질의 뉴런을 표현 깊은 YFP이 마우스 라인에 신호 내생의 돌기 arbors는 두 번째 채널 ¹⁰ (그림 2B 2 시간까지)에 동시에 몇 군데하실 수 있습니다. 뼈의 두 번째 고조파 신호 3이 채널에 수집되고, 이미지 스택의 수집 후 thinned 두개골 (2C에 그림의 2A)의 두께를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

두피 혈관 역학은 심히 anesthetics ^{11 시까지} 영향을받습니다. 두 번째 예제에서, 우리는 길들여지지 깨어 마우스에서 두 개의 광자 현미경에 의해 수집된 자발 vasoactivity의 동영상을 보여줍니다. 루멘 직경 유명 vasomotor의 oscillations는 pial arteriole로 보지 아니지만 이웃 venule으로하고 있습니다. 이vasoactivity의 기초 범위는 우레탄 마취의 ⁴ 줄어들 수 있습니다. 혈액 흐름의 자연과 evoked 변화를 계량하기 위해 우리는 각 혈관의 혈관 직경과 적혈구 속도를 모두 캡처하는 적응 라인 스캔 기법을 사용합니다. 두 광자 현미경을 사용하여 정량 혈액 흐름 이미징에 대한 자세한 ^{자료는, 12 3} 사용할 수 있습니다.

1 그림. 포트 윈도우를위한 절차. 포트 윈도우를 생성하기위한 절차의 순차적 단계 (에 K) 이미지. 자세한 지침은 텍스트를 참조하십시오. β = bregma와 λ = 람다. anesthetized 준비 이미징 동안 머리 보안을위한 (L) 볼트 및 너트 시스템. (M) 정의 깨어 준비를위한 크로스 바 헤드 마운트를 가공. 이 예제에서는 커넥터도 반복 electrocorticogram 녹음을 위해 이식되었다. (N)도식 다이어그램은 헤드 마운트 및 다양한 구성 요소의 위치 지느러미 전망을 보여주고 있습니다. 패널 L에 사용되는 너트는 패널 M. 두에서 사용하는 크로스 바에 대한 대안으로 의미 # 000 셀프 태핑 나사 것은 깨어 이미징 준비와 추가된 안정성을위한 크로스 바 장착으로 추가됩니다. 포트 윈도우의 단면을 보여주는 (O) 도식 다이어그램.

그림 2. 마우스 피질의 vasculature과의 연결 구조의 2 광자 영상. 모든 이미지는 윈도우 주입 ^10시 이일에 Thy1-YFP 마우스에서 포트 창문을 통해 수집되었다. vasculature ()과 dendrites (B)와 관련 thinned 두개골을 보여주는 코로나 방향으로 조직을 150 μm의 이상 최대한의 투영. 뼈 (파란색)가 900 나노미터 여기에 450 nm의 방출에서 두 번째 고조파 형광을 수집하여 감지되었습니다 ^{8. vasculature (적색)을 정맥 주사 70 kDa 텍사스 레드 dextran 6 시까지로 분류되었다. 뉴런의 돌기 분야 (녹색) Thy1-YFP 유전자 변형 마우스 라인 내생 있습니다. PIA 아래 서로 다른 깊이에서 수평 방향으로 조직의 50 μm의 이상 (CH) 최대한의 전망. 데이터 패널에 표시된 동일한 이미지 스택 출신 A와 B Dural 혈관 막 대뇌 피질의 표면 (C에서 화살표) 위에서 볼 수 있습니다.}

약어

ACSF은 = 인공 대뇌 척수
포트 = 광택 및 철근 thinned 두개골 창
YFP은 = 노란색 형광 단백질

^제가 설명한 절차가 현지 기관 동물 케어에 의해 승인되었다는 확인하고위원회를 사용하십시오.

토론

두 광자 포트 창을 통해 영상은 레이저 빛을 attenuates하고 더 깊이 ⁸ 시에 광학 aberrations을 추가 thinned 뼈 및 경질 통해 전송을 필요로합니다. 그러나이 단점에도 불구하고 최대 pial 표면 아래 250 μm의에 이미징 깊이는 900 nm의 여기를 구현할 수 있습니다. 그레이터 이미징 깊이는 원칙적으로 ¹³ 이상 여기 파장과 수도 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 완전한 craniotomy ^{14, 15과}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
대리인	인도의 루트	마우스에 대한 선량	존속 기간	노트	출처	심판 심판
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 μg / g	15-60 분	좁은 여유가 없다. 천천히 마취의 적절한 복용량까지 작동합니다. 필요에 따라 유도 선량의 10 %를 보완.	036093; 버틀러 Schein	7
케타민을 (Ketaset)는 Xylazine (Anased) 섞인	IP	60 μg / G (K) 10 μg / g (X) (동일 주사기에 혼합)	20-30 분	Xylazine는 근육 이완 및 진통제로 공동 주입된다. 필요에 따라 유도 선량의 50 %에서만 케타민을 보완.	(K) 010177, (X) 033,198; 버틀러 Schein	7
Isoflurane (Isothesia)	흡입	4 % 유도를위한 폐포 농도 (MAC)을 의미, 유지 보수 1-2% MAC	4-6 H.	70 % 산소 30 % 질소 산화물의 혼합물로 제공. 장시간 마취 회복을 늦추기 위해 이끌고 있습니다.	029403; 버틀러 Schein	26

ITEM	회사	카탈로그 # / 모델
Betadine	버틀러 Schein	6,906,950
Buprenorphine (Buprenex)	버틀러 Schein	031,919
플루오레신 isothiocyanate dextran, 2 MDA 분자량	시그마	FD2000S
이소 프로필 알코올	어부	AC42383-0010
Lactated 울리는의 솔루션	버틀러 Schein	009846;
Lidocaine 용액, 2 % (V / V)	버틀러 Schein	002,468
식염	버틀러 Schein	009,861
외과 우유	버틀러 Schein	014,325
텍사스 레드 dextran, 70 kDa 분자량	Invitrogen	D1864
Maxizyme	버틀러 Schein	035,646
DISPOSABLES
초경 털은, 1 / 2mm 팁 크기	파인 과학 도구	19007-05
Cottoned 팁 applicators	피셔 과학	23-400-100
유리, 아니 보호해. 0 두께	토마스 과학	6661B40
Cyanoacrylate 접착제	ND 산업	31,428 H04308
가스 살포기	Newegg	N82E16848043429
그립 시멘트 분말	Dentsply	675,571
그립 시멘트 용매	Dentsply	675,572
인슐린 주사기, 29.5 게이지 바늘로 0.3 ML 볼륨	버틀러 Schein	018,384
너트와 머리를 고정 볼트	Digikey	너트, H723-ND, 볼트, R2-56X1/4-ND
Opthalmic 연고	버틀러 Schein	039,886
메스 블레이드	피셔 과학	12-460-448
나사, 셀프 태핑 # 000	JI 모리스 회사	FF000CE125
실리콘 수족관 밀봉 재	완벽 제조	31,001
주석 산화물 분말	엄마의 광물	EQT-TINOX
장비
유리 학자	피셔 과학	08-675
현미경 해부	칼 자이스 혈구	OPMI-1 FC
전기 파워 드릴	Foredom 또는 Osada	K.1020 (Foredom) 또는 EXL-M40 (Osada)
전기 면도기	Wahl	시리즈 8900
집게, 뒤몽 안돼. 55	파인 과학 도구	11255-20
피드백 조절 열 패드	FHC	40-90-8 (직장 써미스터, 40 - 90 5D-02, H) 패드, 40-90-2-07 먹어
Isoflurane 기화기	Ohmeda	IsoTec4
펄스 산소 농도계	스타 생명 과학	MouseOx
미니어처, 드라이버	가렛 웨이드	26B09.01
Stereotaxic 프레임	Kopf 인 스트 루먼트	모델 900 (마우스 마취 마스크와 비 파열 귀에 바 있음)
외과 가위, 무딘 끝	파인 과학 도구	14078-10
초음파 세척기	피셔 과학	15-335-30