수술 상처에 상처 Exudate 생물 화학 중재자를 수집하고 측정

요약

이 문서는 cesarean 배달 후 수술 상처 부위에서 생화학 염증과 nociceptive 중재자를 수집하고 측정하기위한 방법에 대한 자세한 및 시각적 설명을 제공하고 있습니다. 이 인간 bioassay는 상처 혈청 시토 킨 농도와 상처 크린 시토 킨, chemokines 및 neuropetides에서 마약 매개 변화 사이의 상관 관계를 결정하는 데 사용되었습니다.

초록

우리는 수술 상처 부위에서 생화학 염증과 nociceptive 중재자를 수집하고 측정 할 수있는이 방법을 설명합니다. 특정 사이트 생화학 마커를 수집하는 혈청 및 수술 상처의 수준 사이의 관계를 이해하는 것이 중요합니다, 중재자 자료, 고통, 진통제 사용 및 관심의 다른 결과 사이의 연관 관계를 파악하고, 수술 상처 조직 및 주변 약물 관리의 효과를 평가 생화학. 이 방법론은 척추 마취를 선택 cesarean 배달을 진행하고 건강한 여성에 적용되었습니다. 우리는 환자의 통증 점수와 최대 48 시간 후 cesarean 배달에 대한 진통제 소비와 같은 시간 간격으로 상처 exudate 및 혈청 중재자을 측정했습니다. 이 방법 사용 우리는 신경 성장 인자 (NGF), 프로스타글란딘 E2 (PG-E2) 물질 P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, 등의 다양한 생화학 중재자를 감지 할 수있었습니다 IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1과 MIP-1β. 이 인간 수술 상처 bioassay를 적용 연구 상처 혈청 시토 킨 농도 나 시간이 릴리스 프로파일 사이에 상관 관계가 발견되지 않은 (J 고통 2008, 9. (7) :650-7) ¹ 우리는 또한 식별 할 기술의 유틸리티를 기록. 상처 시토 킨 콘텐츠에 약물로 인한 변경 사항 (Anesth Analg 2010, 111:1452-9) ^2.

서문

수술 절개 후, 거주 및 염증 세포를 마이그레이션하는 프로와 항 염증성 크린 시토 킨, prostanoids, neuropeptides과 고통을 시작하고 유지하기위한 중요한 chemokines을 뗍니다. 특정 사이트 생화학 마커를 수집하는 ^3,4 능력을 결정하는 것이 중요합니다 혈청 및 수술 상처의 수준 사이의 관계는, 중재자 자료와 수술 통증 사이의 복잡한 관계를 이해하고, 수술 상처의 생화학에 전신 및 주변 약물 관리 모두의 효과를 평가 할 수 있습니다. 연구 생화학 중재자의 체계적 측정에 초점을 맞추고하고 특정 사이트 출시 간주되지 않았습니다. 크린 시토 킨과 chemokines의 ^5,6 세럼 측정은 현지 수술 상처 생화학 이벤트 반영하며, 수술 부상하는 글로벌 조직 응답을 표시하지 않을 수 있습니다. 이 문서는 전나무했다이 방법에 대한 자세한하고 독특한 시각적 설명을 제공세인트 고통이 저널에 2008 년 참조.이 목성 기사의 ¹ 목적은 방법의 독특하고 시각적으로 향상된 설명을 제공하는 것입니다.

프로토콜

1. 연구 프로토콜

• 기관 검토위원회 승인 및 서면 정보 동의를 구합니다.
• 연구 행위에 대해 적절한 수술 인구를 선택합니다. 이 방법론은 cesarean 배달 상처에 적용되었지만 대부분의 수술 상처가 적절한 것입니다.
• 귀하의 연구 참여에 대한 포함 및 제외 기준을 고려하십시오. 수술 상처 감염의 높은 속도로 환자와 절차가 적합하지 않을 수 있습니다.
• 잠재적 인 confounders을 방지하기 위해 모든 환자에 대한 마취 및 수술 후 관리를 표준화.

2. Nociceptive 및 염증성 생물 화학 중재자 컬렉션

• 폐쇄 (다른 조직 레이어로 간주 될 수 있습니다)을 상처 직전에 피하 층에 ON-Q SilverSoaker (I-흐름, 레이크 포레스트, CA)와 ON-Q PainBuster를 삽입합니다. ON-Q PainBuster 고통 구호 시스템은 지속적으로 두 ML / H의 속도로 정상적인 생리 기능을 제공합니다. 통신사가 빗 할 수 있습니다로 ined 또는 국소 마취제와 비 steroidal 안티 - inflammatories과 같은 관심 마약에 비교했다.
• 지정된 시간 지점에서 상처 exudate의 흡인 할 수 있도록이 시스템에 표준 세 방향 꼭지를 포함시킵니다. 지속적인 주입이 응고에서 카테터을 방지하고 exudate 샘플을 생산하기 위해 시스템의 안정성을 향상시킵니다. exudate의 흡인이 어려운 경우 (가지 경우 약 5 %), 상처 위에 부드럽게 밀어 (예를 들어, 환자를 앉아하거나 드러 누어) 피사체의 위치를 변경 0.5-1 ML 정상적인 생리에 찬 물을 사용하거나이 박탈 고려 카테터 1-2cm.
• 프로토콜 (예, 1, 4, 6, 24, 및 cesarean 배달 후 48 시간)에 의해 지정된 시간 지점에서, 기음과 상처 exudate 1 ML를 철회 할 수 있습니다. proteinase 억제제의 30 μl를 포함하는 폴리에틸렌 컵에 exudate를 전송합니다. 우리는 우리의 목적을 위해 완벽한 Proteinase 억제제 (Bioscience 로슈, 팔로 알토 (Palo Alto), CA)를 사용했습니다.
• 연구 프로토콜에 의해 지정된 동일한 시간 간격으로, 혈액의 10 ML를 수집합니다. 우리는 리튬 헤파린을 포함하는 혈액 수집 관을 사용했습니다, 우리 기관에서이 녹색 얹은 유리 튜브입니다. 혈액 샘플에 proteinase 억제제의 추가 300 μl를 추가합니다.
• 컬렉션의 1 시간 이내에 10 분 3,000 rpm으로 얼음과 원심 분리기에 샘플을 넣어.
• -20 ° C.에서 표준 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 혈청과 상처 supernate과 장소를 제거

3. 검정 분석

• 일단 모든 연구 exudate과 혈청 샘플은 해동과 동시에 샘플을 분석, 수집 및 저장됩니다.
• 우리는 크린 시토 킨과 멀티 플렉스 면역 분석법을 사용하여 chemokines을 측정했습니다. 멀티 플렉스 immuno-검정 기술은 우리가 작은 (50 μl) 볼륨 샘플에서 분석 수많은 analytes을 할 수 있습니다. 멀티 플렉스가 엘리사를 얻은 사람들과 비교 결과를 생산하고 있습니다. 우리는 17 플렉스 바이오 PlexTM 시스템 (BioRad, Herc을 사용한우리의 분석을위한 ules, CA). 이 분석은 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터페론 α (INFα), 인터루킨 1β (IL-1β), 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 4 (IL-4), 인터루킨 5 (IL-5를 측정 할 수 있습니다 ), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 7 (IL-7), 인터루킨 8 (IL-8), 인터루킨 (IL-10), 인터루킨 12 (IL-12), 인터루킨 13 (IL-13), 인터루킨 17 (IL-17), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립 세포 대 식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 단핵구 chemoattractant 단백질 1 (MCP-1) 및 대 식세포 염증성 단백질 1 (MIP-1β). 신경 성장 인자는 바이오 플렉스 아민 커플 링 키트 17 플렉스 판에 추가하여 NGF DY256 항체를 측정 하였다.
• 좋은 품질 분석을 위해 각 측정은 복제에서 변경해야합니다. 각 analyte 표준 곡선은 (0.20의 농도에서, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 PG / ML 플러스 제조업체에서 제공하는 참조 analytes를 사용하여 생성됩니다정상 생리에 대한 제로 표준). 표준 곡선은 각 실행에 포함되어 및 샘플 농도는 바이오 플렉스 Manager 소프트웨어를 사용하여 계산됩니다.
• 물질 P 및 프로스타글란딘 E2의는 높은 감도 엘리사 키트를 사용하여 측정 하였다. 우리는이 분석을 위해 분석 설계 주식회사 (앤 아버, 미시간)를 사용했습니다. 제조업체의 사양에 따라 복제의 분석을 수행합니다.

결과

이 방법 사용 우리는 상처 exudate와 플라즈마의 IL-5를 제외하고 위에서 설명한 모든 생화학 중재자를 감지 할 수있었습니다. ^1,2 일부 추가 크린 시토 킨은 (TNFα IL-4, IL-17, 플라즈마에서 발견되지 않은 INFγ , GM-CSF).보고 연구 측정 크린 시토 킨과 chemokines의 ¹ 시간 코스는 24 시간 관찰 기간 동안 지속 된 처음 몇 시간 내에 대지 .. ^{1,2는하지만,} NGF는 동안 꾸준히 증가에 도달, 일...

토론

위에서 설명한이 방법은 상처 exudate에서 생화학 염증과 nociceptive 중재자를 감지 할 수있을만큼 민감한 것으로 발견되었습니다. 여러 시간 지점에서 샘플링하면 우리는 시간이 지남에 따라 이러한 중재자의 변화. ^1,2 우리는 순차적으로 수술 상처 exudate의 염증과 nociceptive 중재자의 릴리스 프로파일을 측정 할 수있는 다른 사람의 수술 상처 분석을 인식하지를 관찰 할 수있다. 수술 절개 사?...