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요약

임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.

초록

유방암은 결국 말단 조직 및 항 종양 면역의 붕괴 지수 종양의 성장과 전이의 결과로, 개발 종양과 면역 체계 사이의 복잡한 세포의 상호 작용을 포함하는 이기종 질병입니다. 많은 유용한 동물 모델은 유방암을 연구하기 위해 존재하지만, 아무도 완전히 인간에 발생하는 질병의 진행을 요점을 되풀이하지 않습니다. 잠상 전이의 형성을 초래할 및 감소 생존 세포 상호 작용의 더 나은 이해를 얻기 위해, 우리는 면역 능력 마우스에서 성적인 성숙 후에 개발 및 구동된다 YFP-발현 유관 암종의 유도 성 형질 전환 마우스 모델을 생성 한 일관성, 내분비 독립적 인 발암 유전자의 발현에 의해. YFP, p53의 절제의 활성화, 그리고 K-RAS의 종양 형태의 표현은 성적으로 성숙한 처녀 암컷 생쥐의 유방 덕트에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스의 전달에 의해 달성되었다. 종양육주 종양 이벤트의 개시 후 나타나기 시작. 종양이 명확하게 한 후에 그들이 기하 급수적으로 성장을 시작하기 전에, 그들은 약 2 주 동안 천천히 진행. 7~8주 포스트 아데노 바이러스 주사 후 맥관은 원위 겨드랑이 림프절 YFP + 종양 세포의 최종 림프 침공, 말초 림프절 종양 질량을 연결 관찰된다. 침투 백혈구 인구는 αβ 및 γδ의 T 세포, 대 식세포 및 MDSCs의 존재를 포함하여 인간의 유방 암에서 발견되는 것과 유사하다. 이 독특한 모델은 침입 유방암을 치료하는 새로운 면역 개입을 설계하는 데 유용 할뿐만 잠재 전이 및 수면에 관련된 세포 및 면역 학적 메커니즘의 연구를 촉진 할 것이다.

서문

유방암은 세계 1,2 암 관련 사망 2의 두 번째 주요 원인에 걸쳐 여성에서 가장 일반적으로 발생하는 악성 종양이다. 복합 유전 3,4, 5 조직학 및 임상 표현형 6은 유방암의 다양한 아형을 특성화하기 위해 사용되며, 종종 생존 기간을 예측하는 수단으로서 사용된다. 유방암 여성의 큰 일대의 분석은 사망 환자 (약 80 %) 대부분이 기본 종양 7의 10 년 후 제거에서 재발 한 것으로 나타났다. 침윤성 암의 대부분의 경우, 림프 침공 강하게 가난한 결과와 질병 (8)의 공격적인 임상 경과에 상관 관계를 보여왔다.

때문에 유방암의 유전 적 표현형 복잡성, 질병의 전체 과정을 되풀이되었습니다 어떤 동물 모델이 없습니다. 인간 유방 종양 세포주가 자주 있었다이종 이식 또는 면역 결핍 생쥐의 침략 및 전이성 유방암의 소성을 9 모델로 사용된다. 유익한 비록 그것이 크로스 종 그래프트 때문에, 이러한 모델은 전체 종양 미세 환경의 영향을 왜곡 면역 압력의 부재하에 발생. 이러한 쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV)과 유청 산성 단백질 (WAP) 등의 유선 특이 적 프로모터에 의해 구동 유도 유전자 변이가 유방암의 유전 적 특성에 대한 지식의 엄청난 금액을 기여했다. 그러나, 이들 프로모터의 조직 특이 적 발현은 일반적으로 인간의 유방암에서 과발현되는 암 유전자의 발현을 반영하지 않는 유도 유전자 변이의 가변 식의 결과, 내분비 계 10-16 그들의 반응성에 의해 손상된다. 암 유전자의 MMTV 구동 식의 내분비 조절을 극복하기 위해, 무디 등. 가슴에 노를 과발현 조건, 독시 싸이클린 유도 모델을 생성상피 17. 이 모델은 회귀 분석과 재발을 연구하는 종양 형성 후 노를 deinducing 유용하지만 일관성, 장기 발암 유전자의 발현을 일정 독시사이클린 관리가 필요합니다. 사용할 수있는 다양한 관련 유방 종양 모델의 포괄적 인 논의는 Vargo-Gogola 등. (10)에 의해 검토에서 찾을 수 있습니다

우리의 목표는 전체 C57BL / 6 배경에 트레이스 유방암의 마우스 모델을 개발되었음을, 돌연변이 이벤트 모델 면역 압력의 존재하에 초기 종양 형성의 영구적 유도 후. 우리는 TP53의 floxed 대립, 그리고 K-RAS의 종양 형성하고, YFP를 포함하는 형질 전환 생쥐의 유방 덕트에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스를 소개했다. 크레 식 TP53, 많은 유방암 18에 자주 변이 된 유전자를 절제 특히 YFP 표현뿐만 아니라 K-RAS의 종양 대립을 유도유방 유관 상피. K-라스의 돌연변이는 유방암 환자 19,20의 단지 6.5 %에서 발생하는, 유방암에서 자주 있지만, 그러한 인간 유방 종양에서 라스 신호 통로의 구성 적 활성에있어서 Her2/neu 및 EGFR 결과, 상류 키나제의 과발현 21-23. 많은 유방 종양 세포주에서 라스 신호 전달 경로의 활성화는도 24, 25을보고되었다. 우리는 종양 형성의 개시 및 성적 성숙, 처녀 암컷 생쥐에 크레-재조합 효소를 발현하는 아데노 바이러스의 췌관 내 주입의 기술을 설명합니다. 유방암의이 모델은 7 ~ 8 한달 겨드랑 림프절로 림프의 침략과 전이에, 느린 종양의 진행의 약 8 주 후에 기하 급수적으로 늘어날 명백한 병변을 개발하고 있습니다. 이 마우스가 전체 C57BL / 6 배경에 있습니다 및 YFP - 표현 종양 세포가 말초 림프절 추적하기 때문에,이 모델은 CE를 연구하는 중요한 도구를 제공합니다llular 및 면역 학적 잠재 성 전이의 메커니즘과 전이성 유관 유방암의 치료에 대한 새로운 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 위 스타 연구소 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 형질 전환 마우스의 생성 및 유지

  1. C57BL / 6 마우스에 적어도 10 세대 역 교배하여 전체 C57BL / 6 배경 (28)에 LSL-K-RAS tm4Tyj 26 (혼합 된 배경에 인간의 암 컨소시엄의 NCI의 마우스 모델에서 얻은) Trp53 tm1Brn 27 품종. 추적 할 수있는 종양의 전이, 품종 B6.129X1-GT는 (사) 26Sor TM1 (EYFP) (전체 C57BL / 6 배경에 잭슨 연구소에서 얻은 LSL - EYFP) 감옥 / J 이중 형질 전환 LSL-K-RAS의 G12D와 / + p53의에 loxP /에 loxP 마우스.
    참고 : 형질 전환 LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP /에 loxP 생쥐 종양 K-RAS 및 내인성 p53의 궤적의 전사적으로 침묵 대립 유전자 측면을 노릴에 loxP 사이트가 크레 매개 절제술, 종양 K-RAS의 과발현시되도록 돌연변이와 p53의 절제 아치입니다eved.
    참고 : LSL - EYFP 마우스 YFP 정지 카세트가 적출 된 조직에서 YFP의 표현 크레 매개 절제술의 결과에 따라 강화 된 황색 형광 단백질 (YFP) 그것을위한 유전자 측면을 노릴 정지 코돈이 포함되어 있습니다.
    1. LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP /에 loxP 마우스 또는 LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP / 췌관 주사에 대한에 loxP LSL - EYFP 마우스를 얻기 위해 유전자 변형 쥐를 번식.
      주 : K-RAS의 동형 접합 삭제와 마우스는 자궁 내에서 사망 LSL-K-RAS G12D / + 때문에 마우스가 p53의에 loxP /에 loxP과 이형에 대한 동형 접합으로 사육된다. 췌관 내 주사에 대한 최소한 6 - 주 이전 순진한 처녀 암컷을 사용합니다.
      참고 : 유전자형의 동형 접합의 프라이머가 p53의 대립 유전자를 floxed p53의 - T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ')와 p53의-T011-REV (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). 그들은 391 BP에서 야생형 대립 유전자를 생산하고 p53의 461 BP (29, 30)에서 대립 유전자를 floxed.
      주 : K-RAS의 돌연변이 형태를 감지 할 수있는 프라이머 oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ')와 oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3')이다. 그들은 600bp에서 검출 된 돌연변이 밴드를 생산하고 있습니다.
      주 : YFP 리포터 삼중 형질 전환 마우스를 들면, 프라이머 ( '(5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3, 야생형 대립 유전자) (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3)'ROSA 카세트를 검출하고, 공유 대립하는 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') floxed 대립 유전자와 야생형 대립 유전자의 600 bp의 320 BP에서 밴드의 증폭 결과.

2. 수술 준비

  1. 최대 75 % EtOH로 모든 주사 전후를 압력솥 청소 수술 재료.
  2. 동물 시설 내에서 소각 방에 깨끗하고 정돈 된 실험실 벤치에서 수술을 수행합니다. 최대 75 % EtOH로 다음에 광범위한 스펙트럼 살균제 용액으로 수술 현미경의 무대와 다이얼 등의 모든 표면을 닦아주십시오.
  3. 달아 멸균 식염수에 케타민 (80 ~ 100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (8 ~ 10 ㎎ / ㎏)의 혼합의 복강 내 주사로 쥐를 마취.
  4. 그들은 마취하에 이동하는 동안 부드럽게 5 분 동안 방해받지 자신의 새장에 다시 마우스를 놓습니다. 이 시간 동안 바이러스 석출물을 생성 (프로토콜 3 참조).
  5. 발가락 핀치에 의해 고통에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 부드럽게 과도한 각막 건조를 막기 위해 수의학 연고 마취 된 마우스의 눈을 커버.
  6. 그들이 회복하기 시작 때까지, 저체온증을 방지 수술하는 동안 낮은 열 설정 가열 패드에 마취 마우스를 배치하십시오.
  7. 통증 관리를 들어, 마우스는 수술 후 24 시간 전에 1 ㎎ / kg으로 피하 투여 멜 록시 캄.

3. 바이러스 석출물의 생성

주의 : 아데노 바이러스 벡터는,이 수정 및 복제 할 수 없습니다되었지만,의 위험감염. 주의 아데노 바이러스를 처리합니다. 모든 직원은 적절 BSL2의 지침에 따라 아데노 바이러스를 폐기, 췌관 내 주입 후 BSL2 에이전트를 처리하는 기관의 지침에 따라 교육을 받아야한다.

  1. 저장 아데노 바이러스는 3 ㎖ 아데노 바이러스 입자의 PFU 7 10 X 2.5과 16 동물을 주입하기에 충분한 4 × 10 8 PFU 각각의 분량 씩 냉동 -80 ° C에서 바이러스 주식을 집중했다.
  2. 주사를 시작하기 전에 약 15 ~ 20 분까지 드라이 아이스에 아데노 바이러스 분주을 저장합니다.
    참고 : 반복 동결 해동 사이클을 피하고, 바이러스 역가가 각주기 사이에 크게 떨어지면.
    주 : 아데노 침전이 프로토콜을 수정하여 형성되어 앞서 설명한 31.
  3. 멸균 분자 수준의 물 50 ㎖, 4 ° C에서 멸균 조건 및 저장에 탄산 수​​소 나트륨 및 필터 244 MG와 보충과 함께 MEM 분말 504 ㎎의 재구성
      <리> 4 ℃에서 멸균 조건 및 상점에있는 분자 수준의 물 및 필터 50 ㎖에 칼슘 클로라이드 1.5 g을 첨가하여 염화칼슘 용액을 준비
    1. 10 ㎖의 최종 부피를위한 멸균 수있는 충분한 3 % 자당과 4 × 108 PFU 아데노 바이러스를 함유하는 분취 액 크레 섞는다. 바이러스에 MEM 34 mL를 넣고 가볍게 섞는다. 그 후, 염화칼슘 용액 4 mL를 넣고 가볍게 섞어 15 ~ 20 분 동안 실온에서 품어.
    2. 스토어 침전물을 형성 할 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 아데노 바이러스. 침전물이 형성되지 않는 한, 아데노 바이러스의 해동 및 확장 시간 동안 얼음이나 실온에 보관하지 마십시오.
      참고 : 즉시 C. ° -80에서 제거 후 침전는 아데노 바이러스 나누어지는 해동 및 제작을 시작 할 수없는 경우 이전 수술에 자당, MEM과 염화칼슘을 혼합하는 것도 가능하다 자당, MEM, 칼슘이 나누어지는은 아데노 바이러스를 추가 할 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 저장할 수 있습니다.
      참고 : 바이러스 입자는 약 1 시간 동안 안정하다.
    3. 이전에 각각 주입, 부드럽게 확인 바이러스 입자를 혼합하기 위해 튜브를 가볍게. 10 ML의 주사기로 바이러스 입자의 3 ㎖ (2.5 × 10 7 PFU)를 그려 및 췌관 주입 마우스를 준비합니다.

4. 바이러스 입자의 췌관 주입

  1. 부드럽게 깨끗한 해부 현미경의 조명 무대에 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 별도의 광원과 복부 측면을 조명하고 각각의 유두 주변 (C57BL / 6 여성에 표시) 모피의 작은 흰색 패치에 의해 왼쪽 4 번째 또는 오른쪽 9 일 사타구니 유선을 찾습니다.
  2. 멸균 에탄올을 적신 솜으로 부드럽게 유두를 문질러 멀리 젖꼭지에서 머리를 취소하고 주사 부위를 소독을 면봉. 그들이 찾을 어려운 경우, 부드럽게 유두를 노출하는 제모 크림이나 사용 가위의 두꺼운 층을 적용합니다.
  3. 젖꼭지를 덮고 각질 플러그, 밀도 죽은 피부 세포의 층을 제거합니다. 유두가 노출되면 각질 플러그는 해부 현미경으로 쉽게 볼 수 있어야합니다.
  4. 미세 수술 집게로 유두를 확보하고 각질 플러그를 제거하는 가벼운 힘으로 당기십시오.
  5. 집게 사이의 젖꼭지를 안정.
  6. 조심스럽게 90도에서 덕트 운하를 cannulating, 집게 사이에 바늘을 삽입합니다. 유방 조직을 통해 복부 뱃속의 장액의 세포막에 침투를 방지하기 위해 약간 바늘 (이하 2mm)의 경사를지나 유두를 입력합니다.
    1. 너무 깊이 바늘을 삽입하지 마십시오. 분사의 적절한 깊이를 보장하기 위해, 부드럽게가 위로 당기면 바늘의 가장자리를 따라 젖꼭지를 그리기, 덕트의 루멘에 삽입 한 후 바늘을 빼냅니다.
      참고 : 주입의 시각화가 어렵다, 따라서 practic이 단계 전자는 트리 판 블루를 사용하는 것이 좋습니다.
  7. 바늘이 적절하게 유방 덕트에 배치되면, 조심스럽게 주사기를 들고 손의 엄지 손가락으로 주사기를 던지는에 의해 (아데노 바이러스 크레 2.5 × 10 7 PFU) 바이러스 침전물의 3 ㎖를 놓습니다. 액체가 추가 될 때 유두가 약간 팽창한다.

5. 마우스의 복구

  1. 이 마취에서 회복하기 시작할 때까지 주입 후 가열 패드에 다시 마우스를 놓습니다.
  2. 마우스가 복구되면, 깨끗한 새장에 다시 배치하고 전체 복구 및 움직임을 모니터링 할 수 있습니다.
  3. 24 시간 췌관 내 주사 후 피하에 1 ㎎ / ㎏에서 멜 록시 캄을 관리 할 수​​ 있습니다.

6. 모니터링 종양의 진행 상황

  1. 확대와 팽창을 위해 하루에 30에서 주입 된 유선을 촉진하다.
    1. 종양의 진행을 모니터 한 번 부어 확대 유방 GLAN 모든 5~7일D가 관찰된다.
  2. 만져서 알 수있는 종양 (약 50~60일 포스트 아데노 바이러스 주입) 표시하면 종양의 성장 속도론에 대한 모든 3~4일 종양의 볼륨을 측정합니다.
  3. 종양의 부피가 생쥐의 체중의 10 %를 초과 할 때 마우스를 안락사.

결과

유방 유관 트리의 성공적인 타겟팅은 이전에 트리 판 블루 (적절한 주입 기술 (그림 1A) 또는 (적절한 바이러스 준비와 감염을 확인 mCherry을 표현하는 아데노 바이러스를 확인하는 방법의 주사 후 32 바와 같이 유선의 전체 마운트를 준비하여 시각하실 수 있습니다 유관 상피 세포,도 1b).

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그림 1. 트리 판 블루 또는 아데노 바이러스 mCherry.)를 주입하여 유 방 땀 샘의 췌관 대상으로하는 전체 마운트, 트리 판 블루는 3 시간의 포스트 분사를 제조 하였다 함께 이전에 유선 번호 4의 주사 후 유선의 32을보고 시각화 / 확인 전체 유관 타겟팅나무. 이미지는 mCherry을 표현하는 아데노 바이러스 2.5 × 10 7 PFU를 주입하여 아데노 바이러스와 유관 상피의 4 배 확대. B) 감염이다. 마우스는 intraductally 주입하고, 사일 포스트 분사, 유선의 전체 마운트는 유관 트리의 바이러스 감염을 확인하기 위해 제조 하였다. 이미지 4X 배율입니다. MG는 LD가 유관, 또는 주 덕트이며, TD 터미널 덕트이며, 유선입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

종양이 p53의에 loxP 유도하는 경우 /에 loxP LSL-K-RAS의 G12D / + 형질 전환 생쥐 종양은 유방 동맥이 확대 부어 될 것입니다 주위에 40 일까지 나타나지 않을 것입니다. 그것은이 관찰 될 때마다 5-7일 종양 성장을 모니터링 palpations를 시작하는 것이 필요하다. 우리 손에, 유선 경화는 항상 종양 개발의 발병을 앞에. 종양은 추가로 2 주 동안 천천히 진행됩니다. 56 일의 주위에 시작, 종양 (그림 2B) 기하 급수적으로 증가하기 시작합니다. 이 시점에서, 그것은 (그림 2A 및 3A) 정상 종양의 진행에 마우스 변화에 약간의 마우스가있을 것이기 때문에 운동 연구가 필요한 경우는 매 3 일마다 종양의 부피를 측정하는 것이 중요합니다. 큰 복부 질량은 종양이 신체의 중량의 10 % 이상을 초과하는 경우에 생쥐는 안락사해야하는 후 (도 2A, 2B 및 3A) 일 (80)에 의해 명백해질 것이다. 담암 마우스로부터 3 클론의 cDNA를 분석 mesothelin의 발현을 밝혀 아세포-8, Her2/neu와, 에스트로겐 수용체 α (그림 2C).

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p53의에 loxP에서> 그림 2. 종양 개발 /에 loxP LSL-K-RAS G12D / + 마우스 80 일 크레을 표현하는 아데노 바이러스를 주사 한 후 종양의 아데노 바이러스 크레.) 두 가지 예와 intraductally 주입했다. 마우스는 / 크레을 표현하는 아데노 바이러스 2.5 × 10 7 PFU를 주어진 80 일 후 종양 개시, 큰 종괴는 동물. B) 일반적인 종양 반응 속도와 p53의에 loxP에서 유도 된 종양에 대한 촉진 계획의 복부 측면에서 돌출 시각하실 수 있습니다 에 loxP LSL-K-RAS의 G12D / + 마우스. C) p53의에 loxP /에 loxP LSL-K-RAS G12D / + 마우스 같은 균질화 된 종양에서 파생 된 세 가지 종양 세포 클론의 특성. RNA 추출 및 RT-PCR 분석을위한 합성 된 cDNA를, mesothelin, 아세포-8, Her2/neu와, 프로게스테론 수용체, 에스트로겐 수용체-α, 에스트로겐 수용체 β-액틴을 β 할 특정 프라이머를 사용 하였다.TPS :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간의 유방암 세포의 미세 환경과 유사하게, 우리는 αβ 및 γδ T 세포의 침투뿐만 아니라 종양으로 골수 유래의 억제 세포 및 대 식세포 (도 4)를 관찰했다. 겨드랑 림프절로 배출하는 혈관은 종양이 주입이 수행 된 전체 유방 조직 (그림 3A)을 포괄하는 성장하기 전에 충혈되기 시작합니다. 종양 세포의 림프 침략과 전이 LSL - EYFP 마우스와 LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP /에 loxP 마우스를 횡단하여 추적 할 수 있습니다. 크레 매개로 절단 한 후, YFP (높고 낮은 두)를 발현하는 종양 세포는 종양에서 발견되고 배수 액와 림프절 (그림 3B)에을 전이 추적 할 수 있습니다. 원위 겨드랑이 림프절로의 전이가 확인되었다성공적으로 종양 베어링 LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP /에 loxP 마우스 (데이터가 표시되지 않음)이 사이트에서 종양 세포주를 배양하여.

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겨드랑 림프절에 종양과 잠재 전이의 그림 3. 형성. 종양의 진행의 서로 다른 속도를 가진 3 개의 선진 유방 종양의 A) 예. 결국 화살촉, 폼 및로 나타낸 고체 질량은 전체 복부 유방 조직의 크기로 성장한다. 종양은 유방 조직에 국한 상태로 유지하고 침입 또는 복막 구멍을 덮고있는 근육에 연결하는 관찰되지 않습니다. 흰색 화살촉으로 표시 사타구니와 겨드랑이 림프절, 간 표면 상복부 정맥의 울혈 분명 있습니다. 7~8주, 일 후전자 액와 림프절로 인해 YFP 긍정적 인 종양 세포의 전이는 유동 세포 계측법에 의해 겨드랑 림프절에 시각화 할 수있는 화살표. B로 표시되는 종양 세포의 림프 침공,)로 확대되기 시작한다. LSL-K-RAS G12D / + p53의에 loxP /에 loxP LSL - EYFP 마우스는 아데노 바이러스 크레의 췌관 전달에 의해 종양 및 YFP의 활성화를 유도하기 위해 사용되었다. 액와 림프절 80 일째 아데노 바이러스 주입으로 종양 세포의 림프 침공을 확인하려면 표시된 림프절과 장기 수확 및 림프구의 마커 염색 YFP의 발현을 조사 하였다. CL은 림프절을 배수 반대측 nontumor를 나타냅니다. 결과는 종양 세포가 말초 겨드랑이 림프절을 끼치고 나타내는 CD45 부정적인 종양 세포상의 게이팅을 나타낸다. 숫자는 전체 인구의 %의 YFP 양성 세포를 나타냅니다. larg의를 보려면 여기를 클릭하십시오어 이미지.

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그림 4. 면역 마우스 유전자 변형 유방 종양에 침투. 마우스 유방 종양은 균질화 및 CD45, CD3, γδTCR, CD11b를하고 GR1에 염색 하였다. 숫자는 전체 종양 (63.5)에서 긍정적 인 백혈구 %를 차지, 총 CD3 + (46.7), 총 CD3의 부정 (40.1), 총 CD3 + γδ + (T 세포 γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), 총 GR1 높은 CD11b를 (MDSC, 28.6) 및 총 CD11b를 GR1 낮은 (대 식세포, 18.5)은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

때문에 마우스와 췌관 주사 기술의 해부학, 우리는 대상 (을)를 찾아F 유 방 땀 샘 (4)과 9 (그림 5)는 가장 일관된 결과를 신뢰할 수있는 주사를 얻을 수 있습니다. 그러나, 글 랜드는 수술을 수행하는 기술자의 취향에 따라 대상이 될 수 있습니다.

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그림 5. 유방 덕트의 번호. 유방 덕트 4, 9는 그림에 빨간색으로 강조 표시하고 마우스 화살표로 표시됩니다. 우리 손에, 우리는 주사, 이러한 유방 덕트에서 수행 우리는 유사한 반응 속도와 함께 개발 종양을 대상으로. 그러나 다른 모든 유방 조직 쉬운 사실을 발견했습니다 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 절차의 성공은 훈련받지 않은 실험자에 대한 어려울 것이다, 췌관 내 주사시 적절한 기술에 달려있다. 우리의 실험실에서 경험이 풍부한 연구자는 일반적으로 유방 종양 대중에게 그들이 아데노 바이러스 주사를 관리하는 시간의 79 %를 얻을 수 있습니다. 주입에 문제가 상당히 지연, 변수 또는 결석 종양 개발 될 수 있습니다. 바늘이 너무 깊이 부적절한 각도로 삽입되어있는 경우, 유관 운하를 놓칠 수있다. 이는 유방 조직을 통해 복측 체강 액성 막으로의 침투를 방지하기 위해, 약간 바늘 (이하 2mm)의 경사를지나 젖꼭지를 입력하는 것이 중요하다. 또한, 바이러스 침전물의 이상 3 ㎖의 바늘이나 주사도 얕은 배치는 유선과 의도하지 않은 종양의 유도 외부 바이러스 준비의 유출이 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은 약간 deepe 젖꼭지에 바늘을 삽입하는 것이다R 3mm, 천천히 경사의 끝에서 2mm까지 백업 덕트 중 주사기를 그려보다. 이는 유방 조직이 대신 마우스의 복강 (그림 1A)를 둘러싼 근육의 대상으로되어 있는지 확인합니다. 바이러스가 덕트로 토출 될 때, 바이러스 성 침전물 없음 누출 손실이 없도록 또한이 주사기의 가장자리 젖꼭지 스트레치 것이다.

주입의 시각화는 어렵고,이 단계에 대한 실천을 권장합니다. 우리는 종양 발달의 높은 penetrance 결과 실제로 다음 성공적인 주사의 증가를 관찰 하였다. 이 기술은 처녀 암컷 nonlactating 사용하기 때문에 기본 덕트 운하를 공개 젖꼭지를 덮고있는 각질 플러그를 제거하는 것이 중요합니다. 우리는 덕트의 내부에 트리 판 블루 또는 다른 멸균 추적 염료를 주입하고 유관 TR의 대상 확인하는 전체 유방 마운트를 준비하여이 단계를 연습하는 것이 좋습니다EE. 또한, 시약의 췌관 내 주입을 설명하는 다른 프로토콜은 적절한 기술을 개발하는 데 유용 할 수있는, 33, 34을 발표되었다. 유관 루멘의 바이러스 준비 또는 감염 문제도 mCherry 표현하는 아데노 바이러스를 사용하여 조사 할 수있다. 사출 기술이 최적화 될 때까지 비 형질 전환 마우스는 이들 목적들 각각에 대해 사용될 수있다.

모든 유선 종양을 시작하는 데 사용 할 수 있지만, 우리는 우리가보다 효율적으로 타겟팅의 결과로, 이러한 분비에 적절한 주사를 수행하는 것이 더 쉽습니다 때문에 믿고 유선 3 또는 9를 대상으로 가장 일관된 성장률을 달성 덕트. 왼쪽 4 번째의 근접 또는 배수 서혜부 림프절에 바로 9 번째 사타구니 젖샘 종양 진행의 서로 다른 시간 점 중 항 종양 면역 반응을 검사하는 것이 유용합니다. 원심 사이트를 모델링에 잠재 전이를 추적하기 위해 transgenic 마우스는 LSL - EYFP 마우스 교차했다. 종양이 진행되면서 종양이 기하 급수적으로 (그림 3A)을 성장하기 시작하기 전에, 겨드랑 림프절에 종양을 연결하는 혈관은 약 오주 약간 부풀어 오른 될 것입니다. 결국 7-8 주 후에, 림프 침공 겨드랑 림프절 (그림 3a 및 3b)에서 종양의 성장에 발생합니다. 리포터 생쥐 및 크레에 loxP-기술을 사용하여, YFP 혼입는 종양 진행을 통하여 원위 사이트로 연결을 전이 종양 세포를 추적하는 플랫폼을 생성한다. 이는 잠상 전이를 촉진 셀룰러 및 후생 유전 학적 메카니즘 해명을 목표로 연구를 촉진 할 수있다. 우리 손에, 유방 종양 세포 라인은 유관 상피의 대상 확인, 아세포-8, mesothelin, 에스트로겐 수용체-α 및 Her2/neu와를 표명했다. 그러나, 유도 된 돌연변이에 인한 어려움과 주사의 변화에​​ 따라, 우리는 추천모델 번 종양의 조직 학적 특성은 물론 실험실에서 확립된다.

유방암 같은 치명적인 질환 및 퍼베이시브 1,2이므로, 정확하게 종양 및 호스트 사이의 복잡한 상호 작용을 다시 요약 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 유방 종양의 완전 backcrossed C57BL / 6 쥐 모델을 설명합니다. 첫째, 원시 세포에서 종양을 유도하여, 우리는 종양 전체 면역 미세 환경에서 자연적으로 진화 할 수 있습니다. 고급 마우스 유방 종양의 면역 미세 환경은 일반적으로 (그림 4) 인간의 유방암에서 관찰 된 αβ의 인구와 γδ T 세포, 골수 유래 억제 세포, 대 식세포를 되풀이되었습니다. 우리가 난소 종양을 유발하는 아데노 바이러스 크레을 사용하여 이전에 게시 한 바와 같이, 우리는 바이러스 감염이 해당 종양의 침윤과 종양의 진행 28 무시할 영향을 미쳤다 것으로 나타났습니다. 둘째, 내분비 독립암 유전자의 발현은 종양 세포가 표적 유전자의 발현 수준을 지속적으로 높은 것을 보장한다. 셋째, 잠재 성 돌연변이를 활용하여, 우리는 종양 진화의 정확한 시간 추적을 용이하게하기 위해 종양 발생의 타이밍을 제어 할 수있다. 이 모델의 응용 프로그램은 종양 세포 생물학에 대한 연구를 포함, 종양 미세 환경, 항 종양 면역 반응, 새로운 치료제의 효능도 평가 요인에 대한 연구. 크레-에 loxP 시스템의 가용성을 통해,이 기술은 유방 종양의 개시 및 진행에 추가적인 돌연변이의 다양한 배열을 조사하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다. 우리는이 모델의 사용은 유방암의 생물학에 대한 이해를 향상시키고 궁극적으로 전이성 유방암을 치료하기위한 새로운 치료로 이어질 수 있기를 바랍니다.

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작품은 NCI 보조금 RO1CA157664 및 RO1CA124515에서 지원하고, 유방암 얼라이언스 수상했다. 우리는 위 스타 유동 세포 계측법 핵심 시설, 위 스타 이미징 시설에서 제임스 헤이든, 그들의 귀중한 기술 지원을 위 스타 연구소 동물 시설의 전체 직원의 제프리 파우스트, 데이비드 암브로스, 스콧 와이즈에게 감사의 말씀을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Trp53tm1Brn Transgenic mice
K-rastm4Tyj Transgenic mice		Obtained from NCI mouse models of human cancer consortiumMice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-

Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J

Transgenic mice		Jackson Labs006148
Primers p53loxP/loxPIntegrated DNA Technologies5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+Integrated DNA Technologies5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoterIntegrated DNA Technologies5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expressionIntegrated DNA Technologies5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expressionIntegrated DNA Technologies5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expressionIntegrated DNA Technologies5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expressionIntegrated DNA Technologies5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expressionIntegrated DNA Technologies5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expressionIntegrated DNA Technologies5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expressionIntegrated DNA Technologies5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-CreGene Transfer Vector Core from the University of IowaAd5CMVCreStore aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherryGene Transfer Vector Core from the University of IowaAd5CMVmCherryStore aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringeHamilton company701RN10 μl syringe, RN series.
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needleHamilton company7803-0533 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forcepsDumont52100-58Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powderCellgro50 012 PBStore at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium BicarbonateFisherS233Add to MEM and filter stearilize
Calcium ChlorideSigmaC4901Minimum 96%, anhydrous

참고문헌

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer
Posted by JoVE Editors on 10/20/2014. Citeable Link.

A correction was made to Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Protocol section 3.1 was updated from:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

to:

3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80°C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 µl of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.

Protocol section 3.3.2 was updated from:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

to:

Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 µl. Add 34 µl of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 µl of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.

Protocol section 3.4 was updated from:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

to:

Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 µl (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 µl syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.

Protocol section 4.7 was updated from:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

to:

When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 µl of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.

Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:

10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

to:

10µl syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

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