HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

요약

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 ⁺ T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

초록

HIV-1 타고난 감지 형질 수지상 세포 (올라가고)에 감염된 CD4 ⁺ T 세포의 직접 접촉을 필요로한다. 이 과정을 연구하기 위해, 여기에 설명 된 프로토콜 T 세포주 (MT4) 또는 이종 주요 CD4 ⁺ T 세포 중의 감염을 감지하기 위해 신선하게 절연 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 형질 수지상 세포 (PDCS)를 사용한다. 적절한 감지를 보장하기 위해, PBMC는 혈액 수집 및 사용 감염된 T 세포의 최적 비율 직후 격리되어 필수적이다. 또한, 다중 파라미터 유세포 염색 PBMC 시료 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함하는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 컨트롤의 개수는 생존 및 PDCS의 기능을 평가하기 위해 포함될 수있다. 이들은 수신자 같은 수용체의 공지 된 작용제 (TLR) 경로로 세포 반응을 평가하고 spon의 부족을 확인, 특정 표면 마커의 존재를 포함taneous 타입 I 인터페론 (IFN) 생산. 이 시스템에서 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고은 18 ~ 22 시간 동안 96 웰 플레이트에서 HIV-1에 감염된 세포와 공동 배양. 이러한 공 배양 후 상청액으로부터 HEK-블루 IFN-α / β 세포에서 ISGF3 경로의 활성화를 모니터링함으로써 생리 활성의 타입 I IFNs의 수준을 결정하기 위해 사용된다. 종래와 공 배양 조건에서, 표적 세포는 감염된 세포의 백분율, 특정 표면 마커의 수준 및 감염된 세포의 차동 사멸을 포함한 다수의 파라미터를 측정하기 위해 유세포 분석을 흐르도록 실시 할 수있다. 이러한 프로토콜은 초기 타입 I IFN 생산을 수행하기 위하여 개발되었다하더라도, 이들은 잠재적 PDCS로부터 방출 다른 imuno - 조절 성 분자를 연구 및 HIV-1 타고난 센싱을 규제 분자 메커니즘에 추가 통찰력을 얻기 위해 사용될 수있다.

서문

입력-I ​​IFN 생산 올라가고는 바이러스 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인을 표현하고, 같은 선천성 및 후천성 면역 ¹ 사이의 중요한 연결 역할을합니다. 무 세포 HIV-1의 입자가 어두울 선천 면역에 의해 검출되는 반면, HIV-1 감염된 CD4 ⁺ T 세포를 효과적으로 PDCS ^(2)에 의해 감지된다. 감지기구는 PDC에 의한 바이러스 포집 및 내재화 뒤에 PDC에 감염된 T 세포 및 CD4 분자의 표면에서 바이러스 외피 당 단백질 (gp120의) 사이의 초기 접촉을 필요로한다. TLR7에 의해 전송 된 HIV-1 RNA의 후속 인식에서 MyD88 / IRF7 경로의 활성화를 유발하고 궁극적으로 IFN 생산 ^3-I를 입력 연결됩니다. 중요한 것은, TLR9에 의해 매개된다 PDCS에서 본 제 2 센싱 경로는, PDC 특정 표면 마커 BDCA2 ^4, 바이러스 성 당 단백질 gp120의 상호 작용의 저해된다.

PDC의 TLR7 및 TLR9 감지 경로는 잠재적으로 부정적인 ILT7 ^5라는 또 다른 PDC 특정 표면 억제 수용체와 (또한 Tetherin 또는 CD317 지정) BST2의 결합에 의해 조절 될 수있다. BST2은 PDCS 및 일부 암 세포의 표면에서 높은 수준으로 발현하지만, 이러한 B 세포, 대 식세포 및 T 세포와 같은 다른 세포 유형에서 상대적으로 낮은 수준이다. 중요한 BST2은 형질 전환 된 세포주의 수뿐만 아니라 인간 및 뮤린 기원 ^(6)의 일차 세포 배양 물에서 타입 I IFN에 의해 유도 될 수있다. 그 외에도 면역 조절 기능에서, BST2 최근에 HIV-1의 방출을 억제하는 것으로 발견되었고, 다른 하나는 감염된 세포 표면 ⁽⁷⁾ 상에 가교 미성숙 바이러스 입자로 바이러스 입자를 포위. HIV-1의 경우에, 인코딩 된 부속 바이러스 단백질 U (VPU)의 BST2 길항제로서 작용하는 것으로 하였다. 그것은 VPU는, HIV-1 감염 세포의 세포 표면에서의 테더의 사이트를 BST2 downregulates 것으로 여겨진다활성을 보내고,이 개념은 ^{8,9 도전} 하였지만, 결과적으로 바이러스의 분리를 강화하고 ⁷ 퍼졌다. VPU, 다수의 부재하에 완전한 형태 및 성숙한 자손 HIV-1의 입자가 세포 표면에서 유지된다. 이 닿는 입자가 면역 감지 효과적인 목표를 나타낼 수 있는지 여전히 의문으로 남아있다. 또한,이 표면은 VPU에게 BST2 수준을 변조함으로써 PDCS에서 타입 I IFN 생산 dysregulate 수 있는지 불명확하다.

HIV-1 센싱을 평가하기위한 초기 연구는 일반적으로 타입 I IFN의 불량한 ^3,10-12 유도제 간주되는 무 세포 HIV-1 입자를 사용하여 수행 하였다. 최근의 연구는 PBMC를하고 올라가고 효율적으로 HIV에 감염된 CD4 + T 림프구 ^2,13,14를 감지하는 것이 좋습니다 감안할 때, 우리는 여기에 체외에서 HIV-1에 감염된 세포의 인식에 따라 올라가고에 의해 트리거 타고난 반응을 측정하는 간단한 방법을 설명합니다.

프로토콜

일반 공지 사항

심지어 제어 된 세균 감염은 PBMC를 감지 할 수 있으므로, 어떤 항생제없이 배양에서 세포를 유지하는 것이 중요하다. 세균 등의 센싱 요소는 특정 HIV-1 촬상 트리거 그 구별 될 수없는 배경 인터페론 생산을 유도 할 것이다. 또한, 모든 셀들은 통상적으로 마이코 플라스마 오염의 부재에 대해 시험 할 수있다.

가능하면 항상 독소가없는 솔루션을 사용합니다.

상이한 세포의 유세포 특성화 공동 배양에 사용되는 (PBMC를는 올라가고, MT4 및 CD4 ⁺ T 세포)는 선택적 단계이지만, 주어진 실험의 적절한 해석에 필요한 유용한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 추천.

감염된 표적 세포의 제조 (1)

1. RPMI 1640 메디칼 인간의 CD4 ⁺ T 세포 라인 MT4 유지RPMI-1640은 완전 배지이라 함, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충.
2. 주요 CD4 ⁺ T 세포의 분리.
   1. 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리.
   2. 제조자의 권고 다음의 CD4 ⁺ T 세포를 음성 선별 키트를 사용하여 CD4 ⁺ T 림프구를 분리.
   3. RPMI-1640 완전 배지에서 48 시간 동안 PHA-L (5 μg의 / ㎖)와 CD4 ⁺ T 림프구를 활성화하고 유지하는 세포는 재조합 IL-2 (100 U / ml)로 보충. 차 T 세포 오일 게시물 격리를 감염.
3. 표적 세포 (MT4 T 세포주 또는 일차 이종 CD4 ⁺ T 세포)에 감염.
   1. HIV-1 바이러스 T 세포를, 문화를 공동 감염 이틀 전에. 여기에 기술 된 특정 실시 예에서 pNL4.3-GFP_ires_Nef 야생형 (WT) 또는 pNL4.3 GFP_ires_Nef 델타 - VPU (dVpu) 바이러스를 사용 하였다. 이 바이러스 균주는 GRE를 나타냅니다형광 단백질 (GFP)는 VPU를 표현하는 능력 만 다른 동종 전염성 분자 클론을 -marked 갖추고 있습니다.
   2. 감염 (MOIs)의 다른 다중도를 사용하여 공동 문화에 대한 감염의 비슷한 수준의 문화를 선택합니다. 공동 배양 하루 계측법 감염의 마커로서 유동에 의해 GFP + 세포의 비율을 결정한다. 공동 문화에 대한 20-50% 감염된 세포의 범위 만 문화를 사용합니다.

옵션 단계 : 같은 BST2, 그리고 CD4 같은 관심의 분자 / 리간드의 표면 발현을 평가하는이 시점에서 유세포 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 항 CD4_PerCP / Cy5.5 1 μL 및 안티 BST2_A660 1 μL를 추가 세척 용액 100 ㎕에 0.5 × ¹⁰⁶ T 세포를 재현 탁. 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어. 연구가 VPU 매개 BST2 길항 작용의 역할을 평가 대상으로하는 경우, HIV-1 입자를 수행이때 방출 분석은 앞서 설명한 ^15.

세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고)를 감지 2. 분리 및 농축

주 : PBMC를 사용이 감지되면, 채혈 후 반 시간 내에 분리를 시작하고 적시에 그것을 수행. 공동 문화 또는 PDC 농축 즉시 PBMC를 사용합니다.

1. 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리.
   선택적 단계 : 그 갓 격리 PBMC를 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함 확인하는 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 ㎕에 10 ⁶ 된 PBMC를 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루, (골수 세포) 항 CD14-PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL와 (PDC의) 반 ILT7_PE 1 μL (T 세포)의 1 μl를 추가합니다. 품다세척 용액 유동 세포 계측법 세척 전에 4 ° C에서 45 분 동안 튜브,.
2. 제조업체의 권장 사항은 다음 PDC 부정적인 선택 키트를 사용하여 올라가고을 풍부. 그것은, 빠른 작동 차가운 세포를 유지하고, 미리 냉각 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 이는 PDC 최대 활성을 보장뿐만 아니라 세포 표면과 비특이적 세포 표지 항체에 캐핑을 방지 할 것이다.
   1. 순도, 농축 비율 (예 : ILT7과 BDCA2 등) pDC- 특정 표면 마커의 상대적인 양을 확인하기 위해 갓 격리 올라가고의 다중 매개 변수 유세포 분석을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 μL에 ¹⁰⁴ PDCS을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루의 1 μL, 안티 CD14_PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL 및 안티 ILT7_PE 1 μl를 추가합니다. (PBS, 5 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어mM의 EDTA, 5 % FBS). 40 % 순도의 PDC 최소 (출발 물질이 0.4 % PDC가있는 경우, 이는 100 배 농축 동등한 것)를 권장합니다.

감염된 CD4 ⁺ T 세포와 감지 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고) 3. 공동 문화

1. 웰당 ⁽¹⁰⁶ 세포 / ml로 희석) 감염된 T 세포의 30 μL로하여 PBMC를 220 μL 또는 PDCS 220 μL (850,000 세포 / ml로 희석) (100,000 내지 500,000 세포 농도 범위 / ㎖)을 혼합 U-바닥 96 웰 플레이트.
   1. 혼자 컨트롤, 판 PBMC를 또는 올라가고 및 T 세포로. RPMI 1640 완전 배지 잘 250 μL의 볼륨을 조절합니다.
   2. TLR7 및 TLR9 경로의 알려진 효능에 대한 세포 반응을 평가합니다. 이를 위해, PBMC를 접시 220 μL은 U 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 또는 (100,000 내지 500,000 세포 / ml 범위의 농도에서) PDCS 200 μL (850,000 세포 / ㎖로 희석) 및 (TLR7 작용제를 추가 IMIquimod, 최종 농도 2.5 μg의 / ㎖) 또는 TLR9 작용제 (2,216의 CpG ODN-A, 최종 농도 5 μM). 37 ° C에서 배양 한 세포 및 5 % CO _2, 18 ~ 22 시간 동안 후술 공동 배양 유사한 방식으로이를 처리한다.
2. 37 ℃에서 동시 배양 물을 인큐베이션하고, 5 % CO _2, 18 ~ 22 시간 동안, 다음 V 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴다. 400 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
   1. 평면 바닥 96 웰 플레이트에 상층 액을 전송합니다. 상청액을 -80 ℃에서 보관하거나 즉시 타입 I IFN 검출을 위해 사용될 수있다.
   2. 2 % 파라 포름 알데히드의 공 배양 세포를 재현 탁하고 유세포 분석기를 사용하여 분석한다. 크기 및 과립의 차이로 인해, MT4 세포는 앞으로 산란 (FS) 프로파일 대 그들의 측면 산란 (SS)를 기반으로 한 PBMC 또는 올라가고 쉽게 구별된다. 프라이 머리 T 세포를 표적으로 감염된 세포를 사용하는 경우, 이들은 같은 CSFE 같은 임의의 셀 추적 염료 종래의 공동 배양을 염색 할 수있다.
3. HEK-블루 IFN-α / β 리포터 세포를 사용하여 생체 활성 타입 I IFN의 측정.
   주 : 이러한 세포 I은 신호 전달 경로를 완전히 IFN 활성 형을 얻기 위해 인간 및 STAT2 IRF9 유전자 HEK293 세포의 안정한 형질 감염에 의해 생성되었다. 또한 유도 ISG54 프로모터를 β / IFN-α의 제어하에 분비 알칼리 포스 파타 아제 (SEAP) 리포터 유전자를 포함한다. 유형 I IFN 이러한 세포의 자극은 JAK / STAT / ISGF3 경로를 활성화하고 SEAP의 생산을 유도한다.
   1. 10 % FBS 보충 된 DMEM에서 HEK-블루 IFN-α / β 세포를 유지한다. 180 μL의 최종 부피, 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 50,000 세포의 밀도로 그들을 접시.
   2. 중복에 각 웰에 공동 배양 상층 액의 20 μl를 추가합니다. 각 판은 내부 표준 컨트롤 세트 (인간 IFNα, 2500 U / ml의 100 U /에서 최종 농도)가 필요합니다. 18 일 동안 37 ° C, 5 % CO _2에서 인큐베이션 플레이트-22의 시간.
   3. 효소의 존재 퍼플 / 블루에 핑크에서 변경 정량화 - 블루 용액을 이용하여 알칼리 포스 파타 아제 활성의 수준을 결정합니다. 제조업체의 권장 사항은 다음 정량화 - 블루를 준비합니다. 평면 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에이 용액 180 μl를 추가합니다. 각 웰 또한 유도 HEK-블루 IFN-α / β 세포 상층 액 20 μL를 추가 한 색상 표준 IFN의 대조군 웰에 개발 될 때까지 37 ° C의 배양기에서 배양 플레이트.
   4. 620-655 nm에서 분광 광도계를 사용하여 SEAP의 수준을 평가하고 IFN 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽 법에 의해 형-I IFN의 농도를 결정한다.

결과

도 1에 기술 된 공 배양 시스템은 HIV-1의 감지 타고난 대조 시험을 허용한다. 때문에 일차 세포의 가변 특성으로 인해, 이는 골수와 T 세포 (각각 CD14 ⁺ 및 CD3 ^+)의 정상 비율은도 2a에 도시 된 예에서와 같이, 관찰하는 것이 중요하다. 또한, (비 - 활성화 T 세포에 비해 더 높은 FS CD3 레벨) 활성화 T 세포의 낮은 숫자는 갓 격리 된 PBMC 배양 물에서 바람직하다. 여러 세포 유형 사이의 비율이 비정상적인 PBMC를 인해 지속적인 감염의 결과로서 이미 활성화 된 표현형 종종 시험관 가능성에 적절한 선천성 면역 반응을 마운팅 불가능하다. 가장 중요하게는, PDCS의 상대적인 비율은도 2b에 도시 된 바와 같이 평가 될 필요가있다. 이 비율이 0.2 ~ 1.2 %에 따라 다를 수 있지만, 이상 감지 표현형은 extre 모두 관찰된다이 범위의 행. 그림 2B (92 %, 72 %)에서에서 두 가지 예에서 볼 수 있듯이 부정적인 선택을 사용하는 PDC의 농축은 종종 50~95% PDC의 순도를 얻을 수 있습니다. 전체 실험의 전형적인 예는도 3 및도 4에 도시된다. 이 예에서, MT4 세포를 공 배양 (도 3a)의 시간에 30 %의 감염을 달성 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 델타 VPU에 감염되었다. 전술 한 바와 같이, 오직 WT 바이러스 감염 표면 BST2의 상당한 하향 조절 (도 3b)였다. 때문에 크기와 입도 (granularity)에서의 차이로, MT4 세포는 유동 세포 계측법 (그림 4A)에 의해 PBMC를 쉽게 구별 할 수 있습니다. 공동 문화 배양 한 후, 타입 I IFN (그림 4B)의 HIV-1에 감염된 세포 출시 상당한 양의 접촉 알려진 TLR7이나 TLR9 작용제와 PBMC를 접촉 만 PBMC를. 어떤 IFN는 PBMC를 공동 CU에서, 혼자 PBMC를 검출되지 않았다모의에 감염된 MT4 세포와 ltured, 또는 단독으로 감염된 MT4 세포 (그림 4B)에서. 여기에 제시된 실시 예에서, 한 PBMC에 의한 HIV-1 감염 MT4 세포의 타고난 감지 크게 VPU의 존재 하에서 감소되는 것으로 밝혀졌다.

그림 1 :. 실험 설계의 개요도 SUP : 상층 액을 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2 : 갓 격리 된 PBMC와 ENR의 표현형 특성iched PDCS. (A) 골수 세포와 건강한 공여자로부터 단리 된 PBMC에서 관찰 된 T 세포의 정규 분포 (골수 세포의 백분율은 55~65% 사이 % 및 T 세포 사이의 범위 10-20한다). PBMC를 시료 표면의 CD14 (골수 계통 마커) 및 CD3 (T 세포 마커)를 인식 형광 - 복합 항체를 사용하여 염색 하였다. (B) 올라가고의 표현형 특성. 농축 PDCS에 앞서 PBMC를 내의 셀들의 총 수 (도시 예에서는 0.99 %)의 % 0.2에서 1.2 사이 사이에 나타낸다. 이들 세포를 세포 표면에 존재하는 이러한 BDCA2 ILT7 및 특정 마커의 발현에 기초하여 식별 될 수있다. 음성 선별 크게 PDCS 수가 풍부 및 CD14 ⁺ 골수 세포 (보충 보인 두 예에서 92 % 및 72 %에 도달하는)와 같은 잠재적으로 해로운 오염을 제거하는데 사용될 수있다. CLI큰 이미지를 보려면 여기를 CK.

도 3 :. pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 dVpu 감염 MT4 감염된 배양 물 내의 세포의 HIV-1 감염 대상 MT4 세포의 특성 (A) 백분율 GFP 양성 세포의 백분율에 의해 측정. 감염된 세포에서 (B) BST2의 세포 표면 발현은 표면 염색 후에 평가 하였다. 회색 가득 히스토그램 미리 면역 된 토끼 혈청 (흠 제어)로 염색 모의 - 감염된 세포를 나타내고; 나머지 히스토그램은 항 -Bst2 클론 토끼 혈청으로 염색 된 세포를 나타냅니다. 실선과 히스토그램 제어 GFP 네거티브 (NEG) 세포를 나타냅니다; 점선 히스토그램 감염된 GFP 양성 (POS) 셀들에 대응한다. 독감 평균orescence 강도 (MFI) 값을 각 샘플에 대해 표시된다. 유동 세포 계측법 그림 2에 설명 된대로 수행하고 분석 하였다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

도 4 :. 갓 격리 된 PBMC 감염된 MT4 T 세포의 공동 배양 된 PBMC와 MT4 T 세포 사이의 단독 MT4 T 세포 관찰 FS / SS 프로필, 단독으로 한 PBMC 또는 공동 배양 유세포의 (A)와 비교. 때문에 크기와 입도 차이에 따라, MT4 T​​ 세포는 유세포 분석기를 이용하여 공동 배양 물에서 PBMCs를 쉽게 구별 할 수있다. (B) TLR와 PBMC를 자극 후에 릴리스 타입 I IFN의 양의 대표적인7 TLR9 작용제 (전), 또는 모의 또는 pNL4.3-GFP_ires_Nef (WT) 또는 dVpu에 감염 표시된 MT4 세포와 공동 배양 후. 원시 데이터는 OD ₆₅₀ 값을 표시하고 해당 converseion는. / ㎖ U로 표시 IFN 농도-I를 입력 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 최근의 보고서 ^(18)에 기술 된 바와 같이, VPU를 표현하는 능력 만 다를 GFP 표지 된 HIV-1 바이러스 감염된 T 세포의 검출을 측정한다. 그러나, 이들 방법은 쉽게 잠재적 타고난 센싱을 변조 할 수있는 다른 바이러스 유전자 결여 태그없는 바이러스뿐만 아니라, 바이러스의 검출을 연구하기 위해 수정 될 수있다. GFP를 발현하지 않는 사용 바이러스가 감염된 표적 세포의 백분율은 P24 (캡시드)로서, 세포 염색 공동 - 배양 세포 계측법 및 ELISA 또는 P24에 의해 흐르기 전에 다른 수단에 의해 결정되어야하는 경우. 더욱이, 이러한 프로토콜은 가능한 세포주 및 일차 전지를 포함하는 다양한 상이한 타겟 T 세포와 함께 사용될 수있다.

HIV-1 센싱을 연구하는 데 이른 방법과 비교할 때,이 논문에서 설명하는 방법은 여러 가지 이점이있다. 무엇보다도 이것은 다수의 그룹 무 세포 HIV-1 (P)에 의해 확립 된기사 유형-I IFN ^2,13,14의 가난한 유도한다. 또한, 초기 연구는 생산 타입 I IFN의 양을 정량화하기 이전 IFNα ELISA 기반 방법에 의존했다. 이러한 검출 기술의 한계는 IFNβ와 IFNα의 다른 유형을 바라보며 이전 IFNα ELISA 키트 대부분은 단지 한 종류의 IFNα를 측정한다는 것이다. 설명 리포터 세포주의 사용은 한 번에 측정 할 수있는 인간의 타입 I IFNs의 모든 형태의 생체 활성 농도 등이 제한을 극복한다. 기술은 IFN EL​​ISA 키트의보다 새로운 세대 및 타입 I IFN 다량 쉽게 검출 할 수있는 많은 도너 덜 비싼 매우 민감하다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 쉽게 ELISA를 다른 타입 I IFN 판독 방법에 사용하기 위해 적응 될 수있다.

중요한 단계 : 모든 세포의 구성 요소 (목표와 이펙터 모두)의 품질을 엄격하게 제어하는​​ 것이 중요하다. 잠재적 인 오염에도 asymptomatic은 모니터링하고 제어 할 필요가있다. 우리는 앞서 언급 한 바와 같이, 무증상 세균 오염을 항생제 제어, 및 마이코 플라스마와 같은 잠재적으로 다른 세포 내 병원균은 HIV-1 감염, 유형 I IFN, 즉 생산 후 관찰 된 것과 유사한 면역 반응을 생성 할 수 있습니다. 또한, 모든 시약은 LPS 또는 다른 잠재적 독소가 없어야합니다. 인간 샘플은 종종 정상 감지에 영향을 미칠 수있는 기본 지속적인 감염에 의해 프라이밍 될 수 있으므로 마찬가지로 한 PBMC 및 PDCS의 모니터링은 또한 중요하다. 우리는 항상 제안 된 음성 대조군, 모의 감염된 세포와 같은 표적 세포의 유무뿐만 아니라 공동의 문화를 포함하는 것이 좋습니다. 감염된 세포의 생존도 유형-I IFN가 사멸 세포 ^2,14와 공동 배양 다음 생성되지 않기 때문에 적절한 PDC 감지 중요하다.

기술의 하나의 중요한 한계는 갓 절연 일차 전지에 대한 요구이다. 이 절차는 없었다중 이전에 냉동 또는 문화에 보관 된 PBMC를 또는 올라가고를 사용하여 테스트. PBMC를의 분리는 노동 집약적이며,이 세포는 매우 제한된 수명을 가지고있다. 인간의 피와 함께 작업하는 동안 또한, 혈액 매개 병원체에 대한 보호를위한 표준 프로토콜이 사용되어야한다. 갓 고립 된 인간 세포를 포함하는 작업과 관련된 변화의 여러 소스가 종종있다. 이들 중에서 도너 간에서 발생한 도너 이들 세포를 분리하도록 구현 상이한 절차 및 상속 가변성이다. 이 도너 간의 변동을 방지하는 것이 불가능하지만, 이러한 TLR7 및 TLR9 경로의 공지 된 효능에 대한 응답을 측정하는 등의 제안 양성 대조군의 사용은이 실험을위한 중요한 내부 제어를 제공 할 것이다. 우리는 반응 TLR7 경로는 HIV-1 ^(3)에 대해 적절한 응답을 요구하면서 TLR9 경로의 효능을 강력 응답, 건강 PDC 응답과 상관 될 수 있다는 것을 관찰했다.

2를 기반으로 SS = "jove_content">. 실험 설계에 필요한 경우 셀 선택 과정 후 항체의 자유 유지하지만, 음성 선별 (PDC 특정 표면 마커의 고갈이 필요한 상황에서 예를 들면), 양성 선별 이상이 바람직하다. 고립 된 올라가고 문화의 급속한 세포 사멸을받을. 이 세포를 필요로 실험은 오랜 기간 동안 배양하기 위해서는, 문화 미디어는 IL-3로 보충 할 수있다. 이러한 사이토 카인은 PDC 증식을 유도하고 이들 세포 ^사멸을 억제한다 ^(16). 이 PDC 성숙 또는 분화로 이어질 수 있기 때문에, IL-3 사용은 엄격하게 제어 할 필요가있다.

여기에 설명 된 방법은 타고난 감지시 관련된 초기 단계를 재현하기 위해 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고와 목표 HIV-1에 감염된 세포를 결합합니다. 이 방법은 의심 할 여지없이 EXPLOR에 도움이 될 것입니다HIV 감염과 관련된 전자 초기 선천성 면역 이벤트. 연관된 프로토콜 타입 I IFN 측정 목적이기는하지만 쉽게 감염된 세포의 인식에 PDCS로부터 방출 다른 생체 활성 분자를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 다음은 포함 할 수있다 : 유형 III 인터페론 (IFN-λ) 및 케모카인의 CXCL10, 사염화탄소, 및 CCL5 ⁽¹⁷⁾ (예 : TNF-α와 IL-6 등) 염증성 사이토 카인.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MT4 cells	NIH AIDS Reagent Program	120	This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	Wisent	350-000-CL
DMEM	Wisent	319-005-CL
FBS	Wisent	080-150
Ficoll-Pâque Plus	Myltenyi	17-1440-03
CD4+ T cell isolation kit II	Myltenyi	130-091-155
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II	Myltenyi	130-097-240
PHA-L	Sigma-Aldrich	O2769
Human rIL-2	NIH AIDS Reagent Program	136	This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.
Imiquimod	Invivogen	TLRL-IMQS
ODN 2216 CpG-A	Hycult Biotec	HC4037
Human IFNα	PBL Interferon source	11100-1
QUANTI-Blue	Cedarlane	REP-QB2
Flow cytometry (Antibodies/reagents)
Fc blocking solution (composition below):			Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)
10% Goat serum	Sigma-Aldrich	G 9023
10% Rabbit serum	Sigma-Aldrich	R 9133
10% Mouse serum	Sigma-Aldrich	M 5909
2.5 mg/ml human IgG	Sigma-Aldrich	I 4506
anti-CD3_Pacific Blue	Biolegend	300417
anti-CD14_PE-TxRed	Life Technologie	MHCD1417
anti-BDCA2_APC	Myltenyi	130-090-905
anti-ILT7_PE	Biolegend	326408
anti-CD4_PerCP/Cy5.5	Biolegend	317427
anti-BST2_Alexa 660	eBioscience	50-3179
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P 6148
Cell strainer	BD Falcon	352340
Cyan ADP instrument	Beckman Coulter	CY20030