실크 나노 입자의 제조 및 약물 전달 응용 프로그램

요약

나노 입자는 표시의 광범위한 유망 약물 전달 시스템이 등장하고있다. 여기, 우리는 역 설계 누에 나방 실크를 사용하여 실크 나노 입자를 제조 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 설명합니다. 이들은 실크 나노 용이 치료 페이로드이어서 약물 전달 애플리케이션을 위해 탐색 될 수있다.

초록

실크 때문에 뛰어난 기계적 특성, 생체 적합성 및 생분해 성뿐만 아니라, 트리거에 응답하여 보호하고이어서 페이로드를 분리하는 능력 의용 제약 어플리케이션을위한 유망한 생체 고분자이다. 실크 다양한 재료 포맷으로 제형 화 될 수 있지만, 실크 나노 입자로서 유망한 약물 전달 시스템이 등장하고있다. 따라서,이 문서 안정 실크 나노 입자를 생성하는 데 사용될 수있는 재생 실크 용액을 수득 리버스 엔지니어링 실크 고치 절차를 다룬다. 이러한 나노 입자는 후속 적 특징 약물 로딩 잠재적 항암제 전달체로서 탐구. 간단히, 실크 고치은 역, 고치를 검 제거하여 첫 번째 설계 실크 용해 다음과 수성 실크 솔루션을 산출하기 위해 정리된다. 이어서, 재생 된 실크 용액 실크 나노 입자를 수득 nanoprecipitation을 받는다 - 간단하지만 강력한 방법즉, 균일 한 나노 입자를 생성합니다. 실크 나노 입자의 크기, 제타 전위, 수성 매체의 형태 및 안정성뿐만 아니라, 화학 요법 페이로드를 포획 및 인간 유방암 세포를 죽일 수있는 능력에 따른 특징이다. 전반적으로 설명하는 방법은 잠재적 인 나노 의학 등의 사용을 포함하여 쉽게 응용 프로그램의 무수한에 대해 탐색 할 수 균일 한 실크 나노 입자를 얻을 수 있습니다.

서문

예를 들어, 단백질, 펩티드 및 작은 분자량 의약품 - - 세포 및 조직을 대상으로 나노 크기의 약물 전달 시스템은 종종 약물의 방출을 제어하는 ​​치료 및 페이로드의 다양한 세트를 전달하는데 사용된다. 이러한 치료 페이로드가 종종 리포좀 (덴드리머 포함) 수용성 고분자, 및 마이크로 및 나노 입자 ⁽¹⁾ 등 다양한 거대 분자 약물 캐리어에 통합됩니다. (일반적으로 1 nm 내지 1000의 크기 범위에서) 나노 입자 널리 특히 항암 약물 전달 ^2, 잠재적 약물 담체로서 탐구 중이다. 약물 전달을위한 더 많은 나노 입자는 현재 임상 시험 ^(4)를 입력 할 수 있도록 일상적인 임상 ^3에 아브 락산의 성공적인 도입 (120 나노 미터 크기의 알부민 기반 나노 입자 파클리탁셀로드), 필드 촉매했다. 고형 종양은 일반적으로 그 N을 의미하는 가난한 림프 배수를 표시하고 새는 혈관이200 nm의 최대의 anoparticles 수동적으로 정맥 투여 후 이러한 종양을 대상으로한다. 이 수동 타겟팅 현상은 향상된 침투성 및 보존 (EPR) 효과라고 먼저 1986 ^{5에보고되었다.} EPR 효과가 주어진 약물 투여 할 때의 종양 미세 환경 내 약물 농도의 50 ~ 100 배 증가로 이어질 수 약물 페이로드 캐리어가없는 고분자 약물 전달체 방식이 아닌 무료로 약을 사용하여 제공됩니다. 항암 약물 전달을 위해 설계된 약물 - 로딩 된 나노 입자는 종양 미세 환경에 도달해야하고, 약물이 목적하는 치료 ^효과를 달성하기 위해 ³ 종종 일반적으로 세포 내 이입 흡수하여 특정 세포 내 구획을 입력한다. 세포 내 약물 전달을 위해 디자인 된 나노 입자는 세포 내로 게이트웨이뿐만 아니라 약제 내성 기전을 극복하기위한 경로로 엔도 시토 시스를 이용한다. 나노 입자에서 약물 방출은 종종 특히 오에 설계나노 입자 캐리어의 pH 응답 (리소좀의 pH 약 4.5) 캐리어 ^(7)에서 페이로드를 해방 약물 방출 또는 리소좀 효소에 대한 트리거 역할을 할 수 리소좀에서 ccur (즉, lysosomotropic 약물 전달) ^6.

물질의 많은 다른 클래스는 나노 입자 (예를 들면, 금속 및 다양한 유기 및 무기 재료)를 생성하는데 사용될 수있다. 그러나, 바이오 폴리머는 그들의 알려진 생체 적합성, 생분해 성 및 낮은 독성 ^(8)의 매력 물질을 부상하고있다. 많은 바이오 폴리머는 알부민, 알긴산, 키토산과 실크를 포함하여, 탐구되고있다. 이들 중, 실크 약물 전달 시스템 ^(9)에 발전을위한 유망한 경쟁자로 떠오르고있다. 다양한 유형의 실크 (예를 들어, 봄 빅스 모리) (예를 들어, Nephila의 clavipes) 거미와 누에를 포함하는 절지 동물의 숫자에 의해 생성된다. 누에 실크 훨씬 더 exten를 사용sively 거미 실크보다 누에가 완전히 길 들여진 때문에 그 실크 따라서 재생 가능한 원료를 나타냅니다. 누에 실크는 식품의 약국 (FDA)은 특히 봉합 재료로서 인간의 사용을 위해 자료를 승인이다 이는 인간에서 강력한 안전 기록을 보유하고 생체 내에서 ^열 분해하는 것으로 알려져있다. 실크의 분해 프로필 12 개월 이상 (높은 결정 성 실크) 시간 (저 결정 실크)의 범위를 미세 조정할 수 있습니다. 실크 분해물 무독성이며, 본체 ^(10)에서 대사된다. 실크 구조가 제어 된 약물 방출을위한 좋은 재료로 만들어 작은 분자량 화합물 및 고분자 단백질 약물 ^(11)에 결합하는 능력을 부여한다. 단백질 약물 (예, 항체) 면역 시스템에 의한 변성, 응집, 단백질 분해 절단 및 클리어런스에 민감하다. 그러나, 실크 인해 나노 다시의 완충 능력에 치료 용 단백질을 안정화gions 및 나노 스케일 ^(11)에서 수분을 조정하는 능력. 이러한 독특한 기능은 물리적 보호를 제공하고 페이로드의 이동성 ^(11)을 줄이고 일반적으로 다른 (바이오) 폴리머로 볼 수 없습니다. 예를 실크 기반 하이드로 겔 ^(12), 영화 ^{13 ~ 15과} 나노 입자 ^{(16, 17)에} 대한 많은 항암 약물 전달 시스템, 지금 ^{(18, 19} 참조 검토)이 기능을 이용하기 위해 개발되었습니다

여기서, 실크 나노 입자는 오랜 기간에 걸쳐 크기 및 전하를 결정하는 것을 특징으로 하였다. 독소루비신, 임상 적으로 관련된 항암 약물, 약물 - 로딩 된 나노 입자 실크 처리 트리플 제외 인간 유방암 세포에서의 약물 충전 및 세포 독성 연구를위한 모델 약물로서 사용 하였다.

프로토콜

봄 빅스 모리 고치에서 리버스 엔지니어링 실크 해결 방법 1. 준비

참고 :이 방법은 다른 곳에서 ^12,27 설명 프로토콜을 기반으로합니다.

1. 5mm X 5mm 조각으로 가위 말린 고치의 5g을 잘라. 어떤 오염 층을 제거합니다.
2. 탄산나트륨 4.24 g을 달아 증류수 끓는 물 2 L에 신중을 추가합니다.
   주 :이 0.02 M 탄산나트륨 용액을 산출한다.
3. 끓는 탄산나트륨 용액에 절단 누에 고치 조각을 추가하고 60 분은 실크 섬유를 degum하는 끓인다. 균일 한 샘플 처리를 보장하기 위해 때때로 실크 저어.
4. 고무질 제거 실크를 제거하고 20 분 동안 증류수 1 L로 세척한다; 세정 공정을 3 회 이상 반복한다.
5. 세척 된 실크를 제거하고 물기를 제거한 다음 풀어 / 손으로 실크를 뽑아 잘 짠다. 건조 하룻밤을 방송하는 흄 후드에 묶이지 실크를 놓습니다. 이것은 일반적 고무질의 3.6 g을 수득ILK 섬유.
6. 다음 날, 5g 공기 건조 고무질 제거 실크 섬유를 무게와 50 ㎖ 비이커의 바닥에 단단히 실크 팩.
7. 신선한 9.3 M의 LiBr 용액을 준비합니다. 4 ml의의 LiBr 비율에 1g 실크를 사용하여의 LiBr의 실크 섬유를 녹여. 증발을 방지하고, 실크 완전히 60 ° C를 용해 할 수 있도록 알루미늄 호일로 실크의 LiBr 샘플을 커버한다. 이 단계는 4 시간까지 소요 때때로 교반하여 도움을 받는다.
8. 5 분 동안 물에서 투석 카세트 (3500 다 분자량 컷 - 오프)을 젖은. 15 주사 용액 15 ml의 투석 카세트에 실크의 LiBr 용액과 공기 방울을 제거하기 위해 바늘과 주사기를 사용한다.
9. 증류수 1 L에 대해 투석하고 (즉, 첫날 3 변경)하고 다시 다음 아침과 저녁에 (즉, 두 번째 날의 변경), 다시 1, 3, 6 시간에서 물을 변경 다음날 아침 (세 번째 날 즉, 1 변경).
10. 실크 soluti를 수집투석 카세트와 원심 분리기 9,500 X g에서 5 ° C에서 20 분 동안 용액으로부터합니다. 뜨는을 복구하고 두 번 더이 원심 분리 과정을 반복합니다.
11. 빈 무게 보트 (W1)의 무게를 결정하고 실크 액 1ml를 추가합니다. 다시 (W2) 무게를 기록하고 밤새 60 ºC에서 계량 보트를 떠나하여 샘플을 건조. 다음으로, 전체 건조 중량 (W3) (건조 실크와 무게 보트)를 결정합니다. 실크 용액의 농도 (/ w는 V)이다 %는 = (W3-W1은 / W2-W1은) × 100.

리버스 엔지니어링 실크 솔루션에서 실크 나노 입자의 2. 준비

1. A> 75 % (v / v)의 아세톤 용액을 유지하면서 실크 솔루션 적하 (/ V w) 아세톤에 5 %를 추가합니다. 예를 들어, 5 % (9)를 가하여 (W / V) 실크 용액 34 ml를 적하 아세톤 (50 방울 / 분의 속도로 10 μL / 방울).
2. 4 ℃에서 2 시간 동안 48,000 XG에서 침전물을 원심 분리기.
3. 뜨는을 기음과 PELLE를 재현 탁제 주걱으로 펠렛을 빠지 후 증류수 20 ㎖를 첨가하여 증류수 t. 주걱에서 펠렛을 제거하기 위해 피펫 팁을 사용합니다. 30 초 동안 30 % 진폭으로 초음파 프로브를 사용하여 두 개의 초음파 사이클 다음 20 초간 증류수로 용량의 원심 분리 관 상단을 볼 텍싱 후.
4. 적어도 두 번 원심 분리 및 재 부유 단계를 반복합니다.
5. 사용까지 4 ° C에서 2.3 및 저장에 설명 된대로, 증류수 (6) 용액에 펠렛을 재현 탁. 세포 배양 연구에, 실크 나노 입자 주식은 감마 ^(17)를 조사 할 수 있습니다.

실크 나노 입자 농도 3. 결정

1. 4 ℃에서 2 시간 동안 48,000 XG에 원심 분리기 실크 나노 입자.
2. 30 초 동안 30 % 진폭으로 초음파 두 사이클이어서 증류수 3 mL를 모든 나노 입자를 수집한다.
3. 2 mL 및 1 ml의 많은으로 실크 나노 입자의 3 ㎖ 주식을 분할하고 홍보로 전송2 ml의 튜브 전자는-무게. 2 mL의 샘플의 총 중량을 기록한다. 사용까지 4 ° C에서 1 ml를 많이 저장; 이 1 ㎖의 시료 검량선을 생성하는 데 사용된다.
4. 다음 스냅 동결과 밤새 동결 건조기에서 2 ml의 실크 나노 입자를 많이 동결 건조. 동결 건조 후, 2 ㎖의 튜브를 닫고 다시 무게를 측정하고, 2 mL의 샘플에 원래 존재 실크 나노 입자 (mg)의 ​​양을 계산한다.
5. 5 점 검정 곡선 (0.04-7 ㎎ / ㎖)를 생성하기 위해 증류수 1ml를 실크 나노 스톡을 희석. 샘플 흡광도 최대를 초과하지 않았는지 확인하십시오.
6. 600 nm에서 각각의 표준 희석의 흡광도를 결정합니다. 이것은, 96 웰 플레이트 설치 프로그램을 사용하여 수행됩니다. 표준 곡선 농도 (㎎ / ㎖)에 비해 플롯 흡광도. 이어서 현탁액 실크 나노 입자의 농도를 결정하기 위해 통상적으로이 표준 곡선을 사용한다.

독소루비신로드 실크 나노 입자의 제조 4

1. 독소루비신 용액의 조제
   1. 증류수 8 ml의 독소루비신의 HCl 1.2 mg을 녹이고.
   2. 116 μg의 / ㎖ (0.2 μmol / ㎖)의 작업 주식을 산출하기 위해 증류수로 10 ml의 최대합니다.
2. 독소루비신로드 실크 나노 입자의 제조
   1. 10, 30 또는 50 밀리그램 / 2 ML 튜브 실크 나노 입자 ml의 200 μL와 0.2 μmol / ㎖ 독소루비신 용액 2 ㎖를 섞는다.
   2. 회전 믹서 (25 ° C) 실온에서 밤새 실크 독소루비신 서스펜션을 품어.
   3. 다음, 30 분 동안 194,000 XG에서 실크 - 독소루비신 현탁액을 원심 분리기. 증류수로 독소루비신로드 실크 나노 입자를 세척하고 두 번 더이 절차를 반복합니다.
   4. (이 샘플은 포위 효율을 결정하는 데 사용된다) 상층 액을 풀 전량 참고.
   5. 증류수에 독소루비신로드 실크 나노 입자를 재현 탁 4 ºC 유엔에서 빛과 가게에서 보호사용 참깨.
3. 캡슐화 효율 의약품로드의 결정
   1. 피펫 검은 미세 적정 플레이트로 단계 4.2.4에서 뜨는 200 μL.
   2. 고정 광전자 설정에서 독소루비신 관련 형광을 측정하기 위해 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용.
   3. 590 내지 485 nm의 발광 파장에 여기 파장을 설정 한 후 형광 값을 기록한다.
   4. 독소루비신 교정 곡선을 생성합니다. 확인 측정 (고정 광전자 증 설정에 예) 동일한 기기 설정을 취득한다. 검량선을 사용하여, 결합 된 상청액 독소루비신 농도를 계산한다. 3 개의 독립적 인 실험에서이 측정을 반복합니다.
   5. 캡슐화 효율을 결정하기 위해 식 (1)을 사용하여 :
      

실크 나노 5. 특성입자

1. 갓 준비 및 저장 실크 나노 입자의 크기와 제타 전위의 평가.
   1. 4 ° C, 25 ° C에서 증류수에 보관 실크 나노 입자.
   2. 동적 광산란 (DLS)을 이용하여 0 일, 14 일 및 28 일에 실크 나노 입자의 크기 및 제타 전위를 측정한다. 단백질 ¹⁷ 증류수 1.33과 1.60로 굴절률을 설정합니다. 사용자 인터페이스 소프트웨어 입자 크기를 계산한다.
2. 주사 전자 현미경에 의한 실크 나노 입자의 형태 학적 평가 (SEM).
   1. SEM의 스터브로 카본 접착제 디스크를 삽입하고,이어서, 실리콘 웨이퍼를 부착.
   2. 1 ㎎ / ㎖의 농도로 실크 나노 입자를 희석. 피펫 실리콘 웨이퍼 상에 샘플 10㎕를가, -80 ° C에서 샘플을 고정하고, 밤새 제조자의 지시에 따라, 동결 건조 시스템을 사용하여 동결 건조.
   3. 코트 골드와 샘플은 20 nm 두께까지 층저 진공 스퍼터 코터.
      참고 : 악기 설정은 모델에 따라 다릅니다. 여기에 사용 된 모델은 완전히 자동화 된 사항이며 두께에 의해 작동합니다.
   4. 5 kV로의 주사 전자 현미경 40,000 배의 배율 이미지 샘플.

컨트롤의 생체 외 세포 독성 및 독소루비신로드 실크 나노 입자 6.

1. 실크 나노 입자에 노출 후 세포 생존 능력.
   1. 10 % v / V를의 FBS와 RPMI 1640 문화 MDA-MB-231 세포. 조직 배양 접시에 세포는 폴리스티렌을 처리하고 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기에서 품어. 정기적으로 2-3 일마다 80 %의 합류에 하위 문화.
   2. 96 웰 플레이트에 2 × ¹⁰⁴ 세포 / cm ^2의 밀도로 MDA-MB-231 세포를 플레이트. 세포가 밤새 복구 할 수 있습니다.
   3. μg의 자유 확산 독소루비신 0.001 (i)를 추가, (ⅱ) 0.001 mg의 실크 나노 입자를 0.1 mg의 실크 나노 입자96 웰 플레이트 (최종 부피 잘 당 100 μL)에 μg의 독소루비신 0.001-1로드.
   4. 세포 생존 및 (3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 PBS에서 (MTT 5 ㎎ / ㎖)에 72 시간을 추가하여 반 최대한 억제 농도 (IC _50)을 결정한다. 인큐베이션을 5 시간 동안주의 깊게 피펫으로 우물을 드레인 디메틸 설폭 100 ㎕로 포르 마잔을 용해. 560 nm에서 흡광도를 측정한다. 3 개의 독립적 인 실험에서이 측정을 반복합니다.
      주 : 미처리 컨트롤의 흡광도 값은 100 %의 세포 생존율에 대한 기준 값으로 작용한다.
2. 실크 나노 입자에 노출 된 세포의 SEM.
   1. 2 × ¹⁰⁴ 세포 / ^㎠의 밀도로 멸균 된 유리 커버 슬립의 종자 MDA-MB-231 세포. 세포가 밤새 복구 할 수 있습니다. 72 시간 동안 원하는 치료 조건에 세포를 노출시킨다.
   2. 디 씻어 30 분 동안 PBS의 2 % v / V를 글루 타르 알데히드와 세포를 수정잠잠 물 두 번, 에탄올 시리즈 탈수, 다른 곳에서 ²⁸ 설명 된대로 중요한 점은, 샘플을 건조.
   3. 금과 샘플 두꺼운 저 진공 스퍼터 코터를 사용하여 20 nm의 업층 코트 스퍼터.
      참고 : 악기 설정은 모델에 따라 다릅니다. 여기에 사용 된 모델은 완전히 자동화 된 사항이며 두께에 의해 작동합니다.
   4. 5 kV의 이미지 및 700 배 배율의 전자 가속을 이용하여 SEM 샘플.

결과

이전 ¹⁷ 설명 된대로 데이터를 통계적으로 분석 하였다. 학생의 t 검정 여러 샘플 페로 니의 다중 비교 사후 시험 다음 샘플 쌍과 분산 (ANOVA)의 일방 분석을 위해 사용 하였다. 다음과 같이 별표는 통계적 유의성을 의미한다 : * P <0.05 ** P <0.001. 모든 데이터는 독립적 인 실험의 수를 나타내는 표준 편차 (SD) 및 괄호 안의 숫자 ± 평균 값으로 표시하고 있습니다.

토론

다양한 방법은, 초 임계 이산화탄소를 ²¹ 건조 모세관 미소 도트 ^(23)을 인쇄 ^(22)를 염석 스프레이 ^(20)를 혼합 한 폴리 비닐 알코올을 포함한 실크 나노 입자를 생성 할 _수있는이 침전 ²⁴ nanoprecipitation ^16,25 (참고 ^26에서 검토). 그러나 nanoprecipitation 인해 전반적인 단순성 실크 나노 입자를 생성하는 가장 인기있는 방법이다. 따라서 본 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11		DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system