96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

요약

여기서, 우리는 96 웰 세포 배양 접시에 반 처리량 세포 이동 분석을 수행 할 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 셀 단층에 일관성 스크래치 상처를 만들 수있는, 빠르고 간단하고 경제적 인 방법이다.

초록

셀 마이그레이션 / 분석 부상은 세포 이동 및 혈관 신생 및 종양 전이 등의 생물학적 과정을 공부하기 위해 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 분석에서, 세포가 합류 단층을 형성하기 위해 재배 및 기계적 상처는 장치와 긁힘에 의해 생성된다. 다음에 무 결함 영역을 향해 세포의 이동 속도는 촬상에 의해 모니터링 될 수있다. 우리 8 채널 기계적 wounder은 세포 이동 분석법과 관련된 대부분의 문제를 해결하도록 설계된다. 첫째, 우리의 wounder 쉽게 고압 증기 멸균 또는 일반적인 소독제로 살균 할 수있다. 둘째, 개별 조절 핀도 선명하고 재현성 상처가 생성 될 수 있도록, 세포 배양 플레이트에 접촉 허용한다. 셋째, wounder 양측의 안내 바는 각각의 웰에서 일관된 상처 위치를 보장한다. 더 wounder의 더 나은 핸들링을 제공 할뿐만 아니라 크로스 contaminat을 최소화하기 위해 부상에 대한 일회용 플라스틱 피펫 팁의 사용이온. 결론적으로, 우리 셀 wounder은 표준 96 웰 배양 접시를 사용하여 세포 이동 분석을 수행하기위한 사용자 친화적이고 재생 가능한 장치 연구를 제공 할 수있다.

서문

세포 이동은 배아 발생, 신경, 혈관 신생, 창상 치유, 점막 수리, 정상적인 발달 및 질병 상태 하에서 ¹ 상피 간엽 - 천이 같은 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 이것은 시그널링 분자 상호 작용, 세포 편광 세포 골격 재구성 매트릭스 리모델링 막 돌기 동적 세포 - 세포 부착 ² 변조 등 다양한 인터페이스 및 세포 내 사건의 조정을 포함하는 복잡한 과정이다. 세포 이동을 연구함으로써, 세포 이동과 관련된 생화학 적 경로를 선도 화학 또는 생체 분자의 발견 및 확인을 결정할 수있다. 이러한 기본적인 공정은 이러한 질병 치료 약물 표적 같은 다양한 애플리케이션을위한 프록시로서 유리하게 사용될 수있다.

상처 분석법은 세포 이동 분석 ^(3)의 하나이다. 여기서,셀들의 각각의 샘플은 부분적으로 셀 영역을 덮는 마이그레이션하는 무 결함 영역을 생성하기 위해 기계적인 방법에 의해 제거 될 것이다. 특정 시점에서 회수의 비율을 모니터링한다. 샘플의 많은 수를 처리 할 때, 이러한 샘플 내에서 실험 비용 및 교차 오염 등의 문제가 문제가 될 수 있습니다. 많은 상용 도구와 분석은 세포 이동 ^{4, 5, 6을} 연구 할 수 있지만, 그들 중 많은 사람들이 비싸고 복잡한 장비가 필요하고 개선이 여전히 필요하다. 이러한 이유로, 8 채널 기계적 셀 wounder (도 1)가 개발되고있다.

우리 8 채널 기계적 셀 wounder은 상술 한 문제점을 해결하기에 몇몇의 고유 특징을 포함하고있다. 이것은 96- 웰 배양 플레이트 형식으로 분석 부상 / 세포 이동을 수행 할 수있는 유연성을 제공한다. 조정 번지iding 바 설계는 스크래치 영역을 각 웰의 중앙에 위치되는 것을 보장한다. wounder는 배양 접시의 다양한 브랜드에 적용되도록 또한, 가이드 바의 높이를 조정할 수있다. 마지막으로, 상처 조절 핀 디자인과 동시에 재현성 상처 ^{(7, 8)을} 달성하기 위해 배양 접시 표면과 피펫 팁의 짝수 접촉 할 수있다.

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프로토콜

Wounder의 부품 1. 소개 (그림 1)

1. 동일한 거리에있는 상처 핀을 고정하여 핀 홀더를 준비합니다. 피펫 팁을 잡고 위아래로 조절 상처 핀을 이동하여 팁 높이를 조정합니다.
2. 96- 웰 배양 플레이트의 다른 브랜드의 조절, 안내 막대를 장착하고 상처 면적이 고정 된 위치에있을 것을 보장한다.
3. 육각 나사를 조여 조정 상처 핀을 고정합니다. 양단에 육각 소켓 헤드 캡을 조여 위치에 안내 바 수정.

2. 핀 홀더의 폭을 설정한다 (그림 2)

1. M5의 육각 렌치 육각 소켓 헤드 캡을 풉니 다.
2. 가이드 바 96 웰 배양 플레이트의 폭 딱 맞도록 상기 핀 홀더의 양측에 고리를 조절하는 적절한 번호를 삽입한다.
   참고 : 코닝과 이와키 플레이트가 큰 반지 1 쌍의 작은 반지 1 쌍을 필요로한다. 팔콘과 눈크 (PL)ATES 큰 반지 1 쌍을 필요로한다.
3. 육각 소켓 헤드를 체결하면 안내 막대를 해결하기 위해 모자.

3. 안내 바 조정 (그림 3)

1. 멸균 10 μL 플라스틱 피펫 팁으로 부상 핀을 맞 춥니 다.
2. M5의 육각 렌치 육각 소켓 헤드 캡을 풉니 다.
3. wounder를 잡고 96- 웰 배양 플레이트의 한 컬럼에 상처 핀에 담갔다.
4. 간신히 우물의 바닥을 터치 팁의 모든 때까지 안내 바의 높이를 조정합니다.
5. 육각 소켓 헤드 캡을 조입니다. wounder 이제 완벽하게 배양 접시에와 핀이 우물의 중간에 잘 배치되어 있는지에 맞는지 확인합니다.

핀 4. 교정

1. 평면 멸균면 (즉, 페트리 접시)에 수직 wounder를 잡고 M3 육각 렌치로 모든 육각 나사를 풉니 다.
2. 균등하게 평면 멸균 표면을 만지지 팁의 모든 때까지 wounder을 누릅니다.
3. 위치에 핀을 고정 다시 육각 나사를 조입니다.
4. 평면 멸균 표면에 부드럽게 wounder을 눌러 각 팁의 균일 성을 확인합니다.

5. 긁는 셀 단일 플라이 (그림 4)

1. 0.1 % 젤라틴 - 코팅 된 96- 웰 세포 배양 플레이트에 시드 인간 제대 혈관 내피 세포. 매체 (199)의 배양 세포는 20 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.09 g / L의 헤파린 보충. 밤새 사용하기 전에 37 ºC에서 5 % 이산화탄소 가습 배양기에서 세포를 유지한다. 세포는 상처 전에 100 % 포화 상태에 도달한다.
2. 가장 왼쪽 (또는 오른쪽) 문화 판의 같은 열에서 각 웰의 측면의 상처 팁을 놓습니다. 우물의 반대편에 걸쳐 wounder를 밀어; 상처 팁 잘 하단을 터치 있는지 확인합니다.
3. 모든 열에 대한 긁힘 (단계 5.2) 반복합니다.
4. , 폐기 t 상처 후그는 중간 각 잘 신선한 매체를 포함하는 시험 화합물로 대체합니다.

6. 데이터 수집 및 이미지 분석

1. 디지털 카메라 이미지 (예 10X 대물 렌즈)와 저전력 현미경을 사용하여 세포 단층에서 기계적 상처와 전체 웰 즉시 (t = 0 시간)을 상처 후.
2. 원하는 경우, 시험 화합물을 첨가하고 원하는 시간 동안 배양. 이미지 원하는 배양 시간 (t = ΔH) 후 다시 상처 면적 전체도.
3. 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어 (사용 https://imagej.nih.gov/ij/ )은 자유형 도구를 사용하여 이미지의 상처 면적을 측정한다.
4. 상처 봉합의 비율을 계산한다 :
   

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결과

이 8 채널 기계적 wounder은 세포 이동 분석을 수행하기 위해 세포 단층을 긁어 구성된다. 그것은 특별한 교육을받지 않은 분 안에 96 웰 플레이트 세포 긁힘 분석을 수행 할 수있는 사용자 친화적 인 장치입니다. 이 wounder 약 600 ㎛의 균일 한 폭과 날카로운 가장자리 세포 단층에 감긴 영역을 도입 할 수있다 (도 5 및도 6). 상처의 폭은 피펫 팁의 브랜?...

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토론

우리의 세포 wounder는 기존의 세포 이동 분석의 문제를 해결하는 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 8 채널 기계적 셀 wounder은 고압 증기 멸균에 의해 멸균 될 수있는 긴 수명과 높은 등급의 스테인레스 (스틸 304)로 이루어진다. 시판 96- 웰 배양 판의 거의 모든 상업용 브랜드 때문에 조정 안내 막대이 기계적 세포 wounder 함께 사용될 수있다. 조정 안내 바의 설계는 찰 영역을 각 웰의 중앙에있?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	Nunc	167008	Other brands of 96-well cell culture plate can also be used
P10 pipette tips	Axygen	301-03-051	Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound
Wounder	R&P Technology Limited
Medium 199	Sigma	M2520-1L	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Fetal bovine serum	Gibco	26140079	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3393	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391	For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells.