인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

요약

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

초록

만능 줄기 세포의 감 별 법으로 망막 안료 상피 세포 (RPE)를 직접 하는 강력한 방법을 설명 합니다. 제공 하는 상세 하 고 철저 한 프로토콜의 목적은 각 단계를 명확 하 게 설명 하 고이 분야에서 연구원에 게 쉽게 사용할 수 있도록. 이 프로토콜 필요 최소한의 또는 더 수동 해 부와 RPE의 동종 계층에서 발생 합니다. 여기에 제시 된 방법을 위해 효과적 이기 위하여 보였다 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 인간 배아 줄기 세포. 또한, 우리 cryopreservation 중간 셀 은행의 장기 저장을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 RPE iPSC 접시에 질병 모델링 또는 임상 응용 프로그램에 유용할 수 있습니다.

서문

망막 색소 상피 대뇌에 대 한 중요 한 지원을 제공 하는 색소 세포의 단층 이다. 망막 색소 상피 세포 (RPE) 비전, 빛을 흡수, 영양소와 이온 수송, retinoid 사이클링, 포토 리셉터 외부 세그먼트 먹어서에 있는 수많은 기능 그리고 성장 인자 분 비¹. 망막 dystrophies RPE 및 비전, 연령 관련 황 반 변성, 망막 화 등의 손실에 결과의 기능에 영향을 주는 다양 한이 있다. RPE의 만능 줄기 세포에서 생성 수 있습니다 이러한 눈 질병을 이해 하는 연구 하며 셀 요법²RPE의 무제한 소스를 제공할 수 있습니다. 사실, 여러 임상 시험 진행 RPE pluripotent 줄기 세포³에서 파생 된 사용 하는.

이 분화 프로토콜 Buchholz⁴ 에 의해 원래 기술 되었다 고 Clegg⁵에서 이전에 게시 방법에 근거 했다. 절차 정상적인 vivo에서 발달 과정 조작 인슐린 성장 인자 (IGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF-2; 통해 RPE 운명 향해 undifferentiated pluripotent 줄기 세포를 직접 모방 FGF-basic), 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 및 WNT 통로^4,5. 프로토콜은 크게 나왔고 97.77% ± 0.1% pre melanosome 단백질 (PMEL) 긍정적인 세포, 그리고 이종 무료 조건^6,7에 적응 되어 프로토콜에 늦게 WNT 통로 주 작동 근의 추가 의해 향상 됩니다. 결과 RPE 사본 및 단백질 수준 적절 한 극성으로 알려진된 RPE 성장 인자를 분 비 하는 포토 리셉터 외부 세그먼트⁸먹어서 수행 RPE 마커를 표현 하기 위해 표시 되었습니다. 이 프로토콜은 더 신속 하 고 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자⁸의 간단한 제거를 포함 하는 차별화의 "자발적인" 프로토콜 보다 안정적입니다. 또한, RNA 시퀀싱 데이터 표시 RPE이이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 그 얻은 일반적인 자발적인 방법⁸을 사용 하 여 매우 유사 하다. 14 일 메서드 Mazzoni⁹ (안료, 편광, phagocytic, 포스트 mitotic, 다각형)⁹에 의해 언급 "5 P의" 맞는 RPE 생성 합니다. 이 절차는 여러 실험실에서 재현할 것을 입증 했다, 그러나 최근 몇 년 동안^10,,1112 에 게시 된 몇 가지 추가 감독된 차별화 방법을 인정 하 길 ^{, 13}.

프로토콜

1. 프로토콜의 하루 14 일 0 시 약 준비

1. 다음 중간 구성 요소 준비: 100 x N2 보충의 2 개 mL의 1 mL을 추가 하 여
   1. 망막 차별화의 만들 100 mL 매체 (RDM) 50 x B27 보충, 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) Dulbecco의 96 mL에 x 100의 1 mL ' s 수정 필수 매체/영양소 혼합 F12 9 (DMEM/F12).
   2. 게 10 mL의 멸 균 물, vortexing, 볼륨 살 균 물 10 mL에 8 mL에 NIC의 녹이는 1.221 g 1 M 니코틴 (NIC)의. 멸 균 필터 솔루션.
2. 다음 성장 요인 및 작은 분자 준비:
   1. Reconstitute 재조합 마우스 머리, 인간 dickkopf WNT 신호 통로 억제제 1 (DKK-1), 100 µ g/ml 각 0.1% 소 혈 청 알 부 민에 IGF-1 (BSA) 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS). 필요에 따라 약 수와 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장소.
   2. 다시 10 µ g/mL 및 재조합 형 인간/마우스/쥐 Activin A를 100 µ g/mL 각 PBS에 0.1 %BSA FGF-기본 구성. 필요에 따라 약 수와 최대 1 년-80 ° C에서 저장소.
   3. Reconstitute 수 5402 (FGF 수용 체 특정 티로신 키 니 아 제 억제 물) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase 키 3, GSK-3β, 억제제) 10 m m 각 디 메 틸 sulfoxide (DMSO). 약 수와 최대 1 년 또는 6 개월,-20 ° C에 게 각각.
3. 하루 0 / 하루 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (EDTA PBS의 1 L 당 0.2 g), 1 X PBS-/-다음을 얻기 없이 칼슘 또는 마그네슘, pH 7.4 (PBS), 1 x 트립 신 같은 분리 효소 (TDE) DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE 지원 매체 (RSM), 및 Y-27632 dihydrochloride (10 µ M에서 사용).

2. : 0 하루 차별화 Pluripotent 줄기 세포 통로의

뿌리고 전에 약 80% 합류 급지대, 혈 청 없는 조건에서

1. 성장 줄기 세포 식민지.
   참고:이 단계를 최적화에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
2. 코트 12 잘 플레이트 세포 외 매트릭스 기반 하이드로 겔 (ECMH) 제조 업체의 권장 사항에 따라와. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.
3. RDM와 PBS-/-성장 요소를 추가 하기 전에 하루에 0 하 고 37 ° C에 물 욕조에 따뜻한 필요한 양의 약 수. 실내 온도에 EDTA를 가져올.
4. 는 10mm NIC, 50 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1으로 따뜻하게 RDM 0 하루에 필요한 성장 인자를 추가합니다. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC의 100 µ L, 머리의 5 µ l, 1 µ L DKK-1, 그리고 IGF-1의 1 µ L RDM의 10 mL.
5. 모든 차별화 된 식민지에서 차별 화를 위한 passaged 줄기 세포 형태에 따라 제거를 선택 합니다. P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 수동으로 제거 하는 차별화 된 셀.
   참고: 식민지 내의 불투명 셀 뿐만 아니라 식민지 사이 Fibroblastic 셀 제거할 차별화 된 셀을 나타냅니다. 차별화 된 셀에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
6. 12-잘 접시 (1:4)의 4 우물으로 6 잘 플레이트의 단일 잘 통과.
   참고:이 단계에서 줄기 세포를 뿌리고에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
   1. 줄기 세포에서 줄기 세포 중간 발음 하 고 씻어 미리 데워 공영-/-의 2 개 mL를 한번 우물.
   2. 발음 PBS-/-와 린스 각 세 번 잘 6 잘 플레이트의 당 EDTA의 1 mL.
   3. 부드럽게 접시를 기울기 고 EDTA를 발음. 중간 셀 리프팅 피하기 위해 어떤 식으로든에서 접시를 선동 하지 마십시오.
   4. 3 세척 후 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 3-5 분에 대 한 후드에 실 온에서 품 어. 이 잠복기 동안 접시를 방해 하지 마십시오.
   5. 는 EDTA를 발음 하 고 여분의 매체의 0.5 mL와 함께 시드 것입니다 잘 당 RDM의 1 mL를 추가 합니다. 예를 들어 12-잘 접시의 4 우물에 접시를 RDM의 4.5 mL 6 잘 플레이트의 1 세척.
   6. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 세포를 분리. 원뿔 튜브에 있는 모든 셀을 수집 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 RDM 셀 triturate. 셀의 큰 덩어리를 분리 하지만 단일 세포 현 탁 액을 triturate 하지 마십시오. 셀에 피펫으로에 균등 하 게 배포 합니다. 접시에 뚝을 방지 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료.
   7. ECM 코팅 12-잘 접시 (잘 당 세포 현 탁 액 1 mL)에 셀 씨.
   8. 우물에 걸쳐 균등 하 게 셀을 앞뒤로 접시 기울기. 부드럽게 장소에서 37 ° C, 5% CO ₂ 셀 문화 인큐베이터에서 다음 중간 변경까지.
   9. 참고 정확한 시간. 매일 같은 시간에 변경 중간.

3. 하루 1 ~ 14: 추가의 성장 요인

1. 1 일: 모든 우물 (우물 당 1 mL)에 매체 변경 RDM을 사용 하 여 0 (단계 2.4 참조)에 대 한 성장 인자 성분과.
2. 주 2: 10 mm NIC RDM (우물 당 1 mL), 5 ng/mL FGF-기본, 10 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC, FGF-기본 5 µ L, 머리의 1 µ L, DKK1의 1 µ L 및 i g f 1의 1 µ L의 100 µ L RDM의 10 mL.
3. 주 4: 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, DKK1의 1 µ L 및 IGF-1의 1 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL.
   참고:이 단계에서 세포는 confluent 관찰.
4. 주 6: 5402 100 ng/mL activin A와 10 µ M 수 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 activin A의 10 µ L 및 10 µ L의 수 5402 ~ 10 mL RDM 추가.
5. 일 8, 10, 12: 3 µ M와 100 ng/mL activin A, 10 µ M 수 5402, RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경 CHIR99021. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, 10 µ L의 수 5402, 및 CHIR99021의 3 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL.

4. RPE의 통로 0에 농축 하루

1. 코트 6 잘 플레이트 성장 인자와 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH를 감소. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.
2. 약 수 필요한 DPBS의 볼륨과 RDM의 농축 및 37 물 욕조에 따뜻한 음 당 1 mL ° C. 가져와 37의 실내 온도 따뜻한 필요한 볼륨 RSM, 항균 약, 및 Y-27632의 TDE ° c.
3. 추가 항균 성 시 약 그리고 Y-27632 0.5 x 및 RSM 각각 10 µ M 작곡. 첫 번째 4-7 일 동안이 매체를 사용 하 여 첨부 파일을 개선.
4. Aspirate 지출된 매체에서 우물 및 미리 따뜻하게 RDM (성장 인자 필요)의 당 1 mL을 추가.
5. 해 현미경을 사용 하 여 수동으로 해 부와 P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 모든 비 RPE 세포 떨어져 다쳤어요.
   참고: 예의 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오.
6. RDM 발음 해 부, 후와 모든 파편 세포. 잘 당 미리 따뜻하게 DPBS의 1 mL로 두 번 세척.
7. 12-잘 접시의 당 TDE의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 부드럽게 접시에서 셀을 제거 하려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 품 어. P1000 피펫으로 부드럽게 셀/TDE 정지를 3-4 회를 위아래로 pipetting으로 triturate를 사용 하 여 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.
8. 셀/TDE 정지 Y-27632 없이 미리 따뜻하게 RSM에 1시 10분 희석. 실 온에서 5 분 동안 173 x g에 세포 현 탁 액을 원심.
9. 발음 셀 펠 릿에서 매체와 10 µ M와 RSM에 셀 resuspend Y-27632 (1 mL 당 잘 농축).
10. 변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.
11. 씨 셀 성장 인자 감소 ECM 코팅 플레이트 1 x 10 ⁵ 셀/cm ² 10 µ M와 RSM의 4 mL Y-27632.
12. 10 µ M는 RSM 바꿉니다 Y-27632 셀 시드 후 48 h 대체 미디어 (예: 월요일과 목요일에) 매 3-4 일을 계속. 10 µ M를 교체 하지 마십시오 4-7 일 후 Y-27632.
13. 37 ° C, 5% CO ₂ 28 ~ 35 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 대체는 RSM 매 3-4 일 (예: 월요일과 목요일에) 계속.

5. 성숙: 통로 1과 2의 RPE

참고: 괄호로 표시 된 볼륨의 6 잘 플레이트 또는 T75 플라스 크 1에 대 한 표시 됩니다.

1. 통로 0의 28 ~ 35 일 사이 코트 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH와 6 잘 플레이트 (T75 플라스 크).
2. 약 수 DPBS 볼륨 RSM 필요 하 고 37 물 욕조에 따뜻한 실내 온도에 ° C.가지고 TDE.
3. Aspirate 우물에서 매체와 세척 잘 두 번와 함께 보낸 미리 따뜻하게 DPBS의 2ml (10 mL).
   참고: 10 µ M를 사용 하지 마십시오 Y-27632.
4. 발음 DPBS TDE의 1 mL (5 mL)을 추가 하 고. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO ₂ 배양 기에 넣습니다. 부 화, 후 보기 세포 세포를 확인 하는 거꾸로 한 현미경에 계약 하 분리.
5. 부드럽게 잘 또는 플라스 크의 밑면에서 셀을 제거는 적절 한 크기의 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여.
6. P1000 팁 (10 mL 혈 청 학적인 피펫으로)를 사용 하 여 부드럽게 triturate 셀/TDE 정지 아래로 3-4 회를 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.
7. 는 RSM에 셀 서 스 펜 션 1시 10분 희석. 린스 잘/플라스 크 희석된 세포 현 탁 액에 추가 하는 RSM의 2 mL (5 mL)을 예약.
   참고: 초과 25 분 효소 노출 시간을 허용 하지 않습니다
8. 173 x g 실 온에서 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심.
9. 셀 펠 릿에서 매체를 발음 하 고 RSM의 1 mL (5 mL)에 셀 resuspend
10. 변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.
11. 1 x 10 ⁵ 셀/cm ² 4 mL (15 mL) RSM의 ECMH 코팅 접시에 셀 씨.
12. 30 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 변화는 RSM 3-4 일 마다 계속.
13. 하루 30 구절 구절 1 ~ 2에서에서 셀에 위의 절차 (단계 5.2-5.11)을 반복.

6. 중간 셀 은행 만들기:의 Cryopreservation 통로 2 일 3-5 RPE

참고: subconfluent (50%) 이며, 안료를 회복 하지는 하는 동안 셀 Cryopreserve.

1. Cryopreservation 매체의 볼륨 10% DMSO 3 x 10 ⁶ 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 계산 셀의 수에 따라,.
2. 수행 단계 5.2 5.8입니다. 3 x 10 ⁶ 셀/mL에 10 %DMSO cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend 고 1.2 mL 극저온 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL.
3. -1 ° C/min에서 멋진 하룻밤-80 ° C에서 배치 하는 설계 된 냉동 컨테이너에 극저온 튜브를 배치 합니다. 장기 저장을 위한 액체 질소에 전송.
   참고: 이러한 셀 녹고 시 통로 3 될 것입니다. 셀을 특성화 하기 전에 30 일에 대 한 문화. 씨앗 통로 3 RPE 1.5 x 10에서 ⁵ cm ² 녹고 시 당. ^{2 , 4 , 6 , 7}

결과

이 메서드는 RPE의 균질, 안료, 및 cuboidal 단층의 생산에 결과. 그림 1 에 타임 라인 이미지 그림2에 해당 합니다. 그림 2A같이 줄기 세포 식민지 식민지 또는 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀 정의 된 가장자리와 밀접 하 게 포장 된다. 그림 2B 에 subconfluent는 미숙한 RPE의 표현을 제공 합니다. 만약 셀 이미 confluent이 단계에서 그들은 차별화 과정에 중요 한 계획을 확장할 수 없습니다. 심각 하 게 subconfluent 셀 수 설정 하는 단층 고 단단한 접속점, 상피의 형성 됩니다. 이 합류를 최적화 하는 방법에 대 한 내용은 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 그림 2C 표시 비-RPE이 분화 과정 중 발생할 수 있는 두 가지 가장 일반적인 유형의 형태: 신경 또는 fibroblastic 패치. 그것은 정의 fibroblastic 같은 패치는 거의 해 현미경에 반투명 반면 이러한 신경 패치 해 현미경에 특히 불투명 표시 해야 합니다. 그것은 더 쉽게 합성 가벼운 현미경과 해 현미경에 그들을 식별 하는 에탄올 증거 실험실 펜 조직 문화 접시에 이러한 영역을 표시 하려면 유용할 수 있습니다. 그림 2D-F 특성 밝은 테두리, 조약돌 형태학 및 RPE의 건강 하 고 성숙한 문화를 나타내는 착 색을 표시 합니다. 그림 3 은 단계 대조와 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 묘사 하는 완전히 성숙한 RPE의 다른 모습을 보여 더 높은 확대 이미지입니다. 통로 3 일간 30, 세포는 RNA, 단백질 표정, 성장 인자 분 비, 표현과 먹어서^{2,4,6 등 이전 출판물에서 설명 된 특성에 대 한 ,7}. 이러한 characterizations 이러한 이미지에 표시 하는 셀은 뿐만 아니라 안료 cuboidal, 하지만 또한 phagocytic, 포스트 mitotic 그리고 편광 보여줍니다.

그림 1:. 성장 요인의 추가 및 RPE의 성숙에 대 한 타임 라인. 성장 인자는 하루 0-14에서에서 12-잘 접시에 추가 됩니다. RPE 성숙은 6 잘 플레이트 또는 30 일 후 재개 (통로 3 일간 30)에 농축의 날부터 T75 플라스 크에서 경작 된 화살표는 효소 셀 뿌리고 나타냅니다. (A-E) 아래 그림 2에 이미지에 해당 하는 타임 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 대표적인 형태 및 RPE 성숙의 합류. 유도 만능 줄기 세포 감 별 법 (A)에 뿌리고 직전. 하루 2 (B)에서 일 14;에 선택 제거 농축 전에 미 숙 RPE 세포 subconfluent 비 RPE 패치 (흰색 화살표 표시) 패치 또는 불투명 "리본" (C)으로 표시 됩니다. RPE 통로 0, 1 및 3 일 30에에 (D, E 및 F). 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: RPE 통로 3에 성숙: 하루 30 Cuboidal 형태학 단계 대조 (A)에 묘사 된 고 밝은 필드 (B)에 묘사 된 착 색. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드는 피더, 혈 청 없는 문화 메서드에서 두 인간의 배아 및 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 최적화 되었다. 1998 년에 인간 배아 줄기 세포의 초기 절연 하 고 2007 년에 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 파생, 이후 다양 한 줄기 세포 배양 방법 되었습니다^{14,,1516, 개발 17}. 이러한 메서드는이 차별화에 취약 줄기 세포 식민지 생산 충분 해야 한다. 제대로 파생 하 고 유지 pluripotent 줄기 세포를이 방법의 적용에 알려진된 제한이 있다.

가장 중요 한 단계는 차별화 (2.5 단계)의 0에 줄기 세포와 수동의 해 부 하루 14 (4.5 단계) 과정에 대 한 잠재적인 필요성의 뿌리고. 줄기 세포 식민지에서 차별화 된 세포를 제거 하 때, 켄트¹⁸에서 이미지를 참조 하십시오. 같이, 식민지와 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀¹⁸이 프로토콜 시작 하기 전에 제거 해야 하는 차별화 된 셀을 나타냅니다. 정의 된 가장자리와만 undifferentiated, 단단히 포장 식민지 차별 화를 위한 passaged 해야 합니다.

잘 (단계 2.6.7) 당 시드 줄기 세포 수가 줄기 세포 통과 따라 단일 셀 서 스 펜 션에 triturated 수 없습니다 고 수 없습니다 정확 하 게 계산 된 hemocytometer를 사용 하 여 사실에 의해 복잡 합니다. 80 %confluent 줄기 세포의 근사는 12-잘 접시의 4 우물에 뿌리고 1 6 잘 플레이트의 잘 표시 됩니다. 성장 율 등 줄기 세포 라인의 차이점 미숙한 RPE 일 0 ~ 4 사이의 합류를 도달 하는 얼마나 빨리 발생할 수 있습니다. 줄기 세포는 정확한 합류에 RPE를 생산할 예정 이다 하지만 셀 수확량 부정적인 영향을 세포가이 단계에서 너무 부족 하는 경우. 미 숙 RPE 세포 하루 4 주 1에 거의 100% 합칠 약 40-50% 합칠 이어야 한다. 셀 4 또는 6 일까 confluent 단층을 생산 하지는 경우 0에서 프로토콜 높은 시드 밀도에서 반복 한다. 예를 들어 6 잘 플레이트의 1은 0에서 12-잘 접시의 4 우물에 passaged 미 숙 RPE의 하루 4에서 100% 합칠을 하지 않는 경우 0에 1:3 또는 1:2 통로에 시드 줄이거나 더 confluent 될 줄기 세포 허용 전에 뿌리고. 여러 셀 라인 비교 일관 된 시드 밀도 설정 하는 것이 중요 하다.

하루 14에 수동 절 개 단계가입니다 비 RPE 세포는 문화 (그림 2C)에 존재 하는 경우에 필요. 프로토콜에 CHIR99021의 추가, 이후 많은 pluripotent 줄기 세포 라인에 작은 수동 절 개가 필요합니다. 일부 준비 신경 패치의 높은 발병 률을가지고 그리고 그 세포를 제거 하는 것이 중요. RPE 0 통과 통로 3에서 가능한 경우, 모든 비 RPE 세포를 제거 하는 충분 한 시간을가지고 차별화 프로토콜 반복 가능 하다. 이 자주 발생 하지 않습니다 하지만 그것은 필요할 때 하루에 14에 있는 해 부 단계를 최적화할 수 있습니다 참고로 여기 언급.

비용 뿐 아니라 문화 방법, 효율, 정량화에서 변화 하는 RPE 분화 프로토콜의 다양 한 고 기능성 평가, 후자는 되었습니다 검토 철저 하 게². 우리는 14 일 방법의 효능, 적응성, 및 셀 라인^4,,78의 넓은 범위에 적용 여기서 설명 선호 합니다. 이 프로토콜에서 cryopreservation 단계는 또한 나중에 사용, 실험에 많은 많은 변화를 피하는 중간 셀 은행을 만드는 주요 이점을 제공 합니다. 12-잘 접시의만 4 우물에서 시작 해 서, 그것이 통로 0에서 6-잘 접시와 통로 1과 2에 T75 플라스 크로 확장 가능 합니다. 통로 2 일 3-5에 셀 여전히 subconfluent 그리고 안료, 회복 하지는 가능 하다 cryopreserve 세포의 수백만의 수만 하 고 성숙한 RPE, 지정 통로 3 일간 30을 해 동 하, RNA 식, 단백질 표정, 성장 인자를 확인 하기 분 비, 식 균 작용, 등등입니다. 우리는 또한 최대 13 구절 ¹⁹RPE 확장 프로토콜을 설립 했다.

앞으로 봐서,이 방법은 iPSC 눈 질병의 모델링 및 생성 RPE 세포 치료에 대 한 유용 있을 것입니다. IPSC 질병 모델링에 관해서는이 프로토콜 RPE CRISPR 수정 같은 환자에서 수정 되지 않은 컨트롤 라인에서 생산 하는 실험실에서 사용 현재 됩니다. 또한,이 프로토콜은 합성 기판 및 세포 치료에 필요한 좋은 제조 관행을 준수 하는 데 유용 이종 무료 조건에 적응할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet	Baker	model: SG603A-HE, type: A2, class: 2	6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood	Labconco	Model 3970405	laminar flow bench top
dissecting microscope	Nikon	SMZ 1500	heated stage
air-jacketed CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC	37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope	Olympus	IX53
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
DMEM/F12	Gibco	10565042
N2 Supplement	Gibco	17502048
B27 Supplement	Gibco	17504044
NEAA	Gibco	11140050
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide	Sigma	N0636
Recombinant mouse noggin	R&D systems	1967-NG-025
Recombinant human DKK-1	R&D systems	5439-DK-010
Recombinant IGF-1	R&D systems	291-G1-200
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A	Peprotech	120-14E
SU5402 FGF inhibitor	Santa Cruz Biotechnology	sc-204308
Name	Company	Catalog Number	Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free	Corning	356237	extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free	Corning	354277	growth factor reduced ECMH
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA)	Gibco	15040066
DPBS	Gibco	14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium)	Gibco	10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)	Gibco	12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium)	Lonza	BW04-743Q
Y-27632	Tocris	12-541-0 (1254)
CryoStor CS10	BioLife Solutions	210102	cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial	Corning	430487
Mr. Frosty (freezing container)	Nalgene	5100-0001	freezing container
Normocin	Invivogen	ant-nr-2	antimicrobial reagent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other Equipment
Pipet-aid	Drummond	4-000-101
12-well culture plate	Corning	CLS3516	Used during differentiation.
T75 flask	Corning	430641	Used during RPE maturation.
6-well culture plate	Corning	CLS3513	Used during RPE maturation.
cell scraper	Corning	08-771-1A	Used during passages.
cell strainer	Falcon	352340	Used during passages before cell count.