마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

요약

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

초록

먹어서 조직 개발 및 유지 보수, 뿐만 아니라 호스트 방어에 핵심적인 역할 그리고 캡처, 봉투 및 큰 입자를 삼 켜 걸 골격의 급속 하 고, 수용 체-중재 재배열을 포함 한다. Phagocytic 수용 체, 하류 신호 경로 이펙터로 GTPases 같은 확인 되었습니다, 있지만 불분명 하 게 남아 있는 특정 수용 체-중재 phagocytic 이벤트의 동적 cytoskeletal 개장. 4 년 전, 식 균 작용, Fcγ 수용 체 (FcγR) 및 보완의 수용 체 (CR)-에 의해 exemplified의 두 가지 메커니즘 먹어서 중재, 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 발견 했다. 면역 글로불린 G (IgG) 바인딩-FcγRs opsonized 입자가 완전히 동봉 하 고 셀에 철회 된다 전에 처음 입자 주위 소위 phagocytic 컵을 형성 하는 얇은 막 확장의 돌출을 트리거합니다. 반면, 보완 opsonized 입자 보완 하는 수용 체에 바인딩을 다음 식으로 표시 됩니다. 먹어서, phagocytic 컵 형성, 침 몰의 이러한 두 가지 모드는 문학에서 잘 설립 되었다. 그러나, 두 가지 모드 사이의 구분 보고서 보완 수용 체-중재 먹어서 그 다양 한 막 돌출을 유발 수 있습니다 흐리게 되 있다. 이미징 기술을 높은 해상도의 가용성, 먹어서 분석 실험은 필요한 있도록 어떻게 특정 phagocytic 수용 체의 실시간 3D (3 차원) 시각화 중재 하십시오 개별 입자의 통풍 관. 더 일반적으로 먹어서, 끝점 분석 실험 등의 연구에 대 한 접근을 사용, 입자 및 식 세포의 인터페이스에서 일어나는 이해 하는 기회를 놓치지. 여기 phagocytic 분석 실험, 저속 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법, 단일 phagocytic 이벤트의 3D 이미지를 허용 하는 사용 하 여 설명 합니다. 또한, 우리는 명확 하 게 이미지 Fcγ 수용 체-또는 수용 체-중재 먹어서 보완을 분석을 설명 합니다.

서문

불가사리 유 충, 1882 년, phagocytic mesenchyme 셀 Metchnikoff의 관찰과 먹어서¹의 그의 이론의 후속 개발 하기 전에 20 년 1862, 혈액에 의해 불용 성 염료 입자의 engulfment에서에서 어니스트 Haeckel 설명, Thetis fimbris (테 티 스 fimbria), 육 식 바다 민 달팽이 (어니스트 Haeckel 종의의 셀. Radiolarien (Rhizopoda radiaria)을 다이:의 Monographie; Druck und Verlag 폰 게오르그 Reimer, 베를린, 1862). 그 이후 세포질으로 채택 하 고 세포 핵 주위 축적 했다 입자를 포함 하는 막 돌출 명시적으로 설명 하 고. 이상 100 년 후, 카 플 란에 의해 선구적인 연구 먹어서²의 적어도 2 개의 형태학 상으로 다른 메커니즘 했다 제안 했다. 카 플 란 했다 스캐닝 전자 현미경 복 막 마우스를 사용 하 여 대 식 세포는 IgG opsonized 양 적혈구까지 도달 하 고 단단히 덮여 입자는 얇은 막 확장을 사용 하 여, 처음에 컵 모양의 기한 섭취 구조입니다. 이후 말라 역학³차단 하 알려져 B 세포 침투성 곰 팡이 독 소 cytochalasin에 의해 폐지 되었다 phagocytic 컵 형성 말라 합이 필요 합니다. 반면, 양 적혈구 세포 보완 opsonized 등장 막 확장의 생성 없이 대 식 세포에 직접 하지만, 일부 이미지를 막 주름 침 몰 입자의 바로 근처에서 볼 수 있다. Phagocytic 컵 형성, 달리 보충 수용 체-중재에서 침 몰 했다 insenstive cytochalasin B 치료². 카 플 란에 의해 설명 된 실험에서 보완 opsonization 수행한 잠복기 면역 글로불린 M (IgM) 라는 양 적혈구 혈 보완 C5-종속 터미널에 의해 circumvents 보완 C5 불충분 한 쥐에서 혈 청으로 복잡 한 보완.

카 플 란에 의해 식별 먹어서, phagocytic 컵 형성, 침 몰의 두 가지 모드는 필드^{4,,56,7,8,9 설립된 의견 되고있다} . 그러나, 초 고해상도 이미지 Munthe 카스 외 에 의해 비슷한 연구로 서², 카 플 란 의해 원래 연구에 사용 ¹⁰, phagocytic 이벤트의 스냅샷을 제공. 최근 리뷰, Rougerie 외. ¹¹ FcγR 및 CR 중재 먹어서 형태학 차이점을 명확히 해야 유지 및 보완 수용 체-중재 입자 통풍 관²중 막 주름 관찰 되었습니다 또한, 강조 했다. 입자 캡처에서 유전자와 결합 하 여 국제화에 걸친 단일 phagocytic 이벤트의 라이브 셀 이미징 마우스 모델을 수정, 크게 식 세포 캡처하고 입자 섭취에 대 한 우리의 이해를 향상 시킬 수 있습니다. 한 가지 방법은 고속 원자 힘 현미경 (AFM) 초 고해상도 (10-20 nm) 지형 영상 살아있는 세포의 수는 사용 될 수 있습니다. 최근, 고속 AFM 시스템¹² 는 개발 되었습니다, 저 잡음으로 빠르게 이미징 셀 표면에 적합. 이 기술은 장점이 셀 고정 및 한계점의 건조 필요로 하는 전자 현미경을 스캐닝과 달리 짧은 간격 (초)으로 측정 될 수 있다 생활의 그 고해상도, 지형 및 기계적인 매개 변수 셀입니다. 또 다른 방법은 시간 경과 3D confocal 현미경 검사 법, phototoxicity 및 표백 제한 요인 중 녹음 비록 널리 사용할 수 있는 것입니다. 이 이렇게 매우 다양 한 그리고 높은 공간 해상도와 단면 광 수 이며 엄청난 다양 한 유전자 인코딩된 형광 단백질을 포함 하 여 형광 프로브로에 특별 한 유연성을 가능 하 게. 여기 우리가 먹어서 분석 실험 시간 경과 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 특정 수용 체-중재 phagocytic 이벤트의 고해상도 spatiotemporal 수 있도록 설명 합니다.

프로토콜

프로토콜 동물 보호 지침 뿐만 아니라 우리 지역 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1입니다. 거주 마우스 복 막 대 식 세포의 고립

1. 희생 마우스 (3-4 개월 (중 성별); 예: C57BL/6 변형) 휘발성 마 취 isoflurane의 과다를 사용 하 여 (> 5% 공기에서) 또는 이산화 탄소¹³뒤에 자 궁 경관 탈 구. 마 취의 유도 발 철수 반사의 손실에 의해 뿐만 아니라 righting 반사¹⁴의 손실에 의해 쉽게 평가 될 수 있다.
2. 청소 후 물에 80% 에탄올과 마우스의 배, 중간 피부 절 개를 만들고 기본 복 부 벽을 노출.
3. Peritonium와 게와 2 x 4.5 mL 차가운 행 크의 버퍼링 된 소금물 (HBSS), 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}5 mL 플라스틱 주사기를 통해 없이 구멍으로 24 G 플라스틱 카 테 터를 놓습니다. 주입, 동안 두고 약 0.5 mL 잔류 HBSS (5-4.5 mL (주입) = 0.5 mL) 경우에서 주사기에 조직 카 테 터의 끝으로 빨려 고 퇴 학. 폴 리 프로필 렌 14 mL 라운드 하단 관과 상 온에서 6.5 분 300 x g 에서 원심 분리기에 aspirated 정지를 전송 합니다.
   참고: 플라스틱 카 테 터의 끝은 무딘은 바늘에 비해 복 부 내용에 부상 최소화. 일반적으로, 다음 부드러운 복 부 마사지, 8 mL 복 막 세포 현 탁 액은 복 막 구멍에서 검색할 수 있습니다.
4. 삭제는 상쾌한 고 1 mL 중 탄산염-무료 RPMI 1640 매체 20 mM Hepes, 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제, 페니실린 (100 단위/mL)와 스 (100 µ g/mL), 준비 등의 복 셀 resuspend 100 x 페니실린/스 1: 100 희석 이 일반적으로 약 6 x 10⁶ 셀/mL의 농도 제공합니다.
   참고: 격리 된 복 막 세포의 약 30%는 대 식 세포, 반면 다른 (더 작은) 세포는 림프 톨, 주로 B 세포.

2. 채널에 복 막 세포의 시드 슬라이드

1. Fibronectin 코팅 채널 슬라이드의 prefilled 채널 (볼륨, 100 µ L)으로 100 µ L 정지 pipetting 응집 감소를 아래로 세포 현 탁 액, 후 플라스틱 (100 µ L 채널은 크기 (길이 x 너비 x 높이): 50 m m x 5 m m 0.4 m m).
   1. 채널 슬라이드의 두 저수지 중 하나에 1 mL 보충 하는 혈 청 RPMI 1640 (Hepes) 매체를 추가, 슬라이드, 기울기 및 다음 다운스트림 저수지 (그림 1)에서 중간 발음 하 여 챔버를 프리 필.
      1. 기포 제거 원치 않는, 또는 두 저수지 중 하나에 1-2 mL 매체를 추가, 단단히 저수지 캡 적용 뚜껑에 리듬 엄지 압력을 통해 공기를 밖으로 양수 하 고, 필요한 경우, 슬라이드를 기울이기 하 여 채널에서 공기의 긴 스트립. 공기를 추방 후 세척제 저수지와 슬라이드 기울기 (와 매체를 포함)는 채널에 다시 빨려 공기를 피하기 위해 모자를 제거 하기 전에 하향.
2. 품 어 채널 슬라이드, 셀, CO₂ 의 부재에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 습 한 챔버에 시드 (CO₂ HCO₃이후 필요 하지 않습니다-/CO₂ 버퍼 시스템은 Hepes로 대체). 채널 슬라이드 8 슬라이드를 보유 하는 선반에 편리 하 게 놓일 수 있다. 최대에 10 이상의 있지만 일반적으로 6-8 슬라이드 한 마우스에서 준비가 되어 있습니다.
3. 랙 제거와 RPMI 1640 중간 포함 중 탄산염, 페니실린/스로 서 10% 태아 둔감 한 혈 청, 보충에 대 한 각 슬라이드에 RPMI 1640 (Hepes) 매체를 교환 합니다.
   1. 슬라이드를 기울기와 낮은 저수지에서 그리고 위쪽 저수지에서 매체를 먼저 발음. 다음, 저수지 중 하나에 새로운 매체의 1 mL을 추가, 채널을 통해 흘러가 후 다운스트림 저수지에서 슬라이드와 aspirate 매체를 기울이고.
   2. 이 세척 (중간 교환) 단계 후 1 mL 매체는 저수지 중 하나를 추가 하 여 채널 슬라이드를 작성.
      참고: 매우 간단 하 고 효과적인 솔루션 exchange 및 비 부착 한 세포 제거는 채널 슬라이드를 사용 하 여 단계를 세척입니다. RPMI 1640 (중 탄산염) 매체는 일반적으로 5% CO₂ 하룻밤 열 및 pH 균형을 보장 하기 위해 미리 incubated note.
4. 5% CO₂습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어. 다음 날에 실험을 수행 합니다.

3입니다. 인간의 혈액 세포의 고립

1. 하루에 2 (두 번째 날의 실험, 절연된 복 막 대 식 세포의 하룻밤 부 화 후), heparinized 관으로 건강 한 기증자 로부터 1-2 mL 주변 정 맥 혈액을 수집. 1 mL 둥근 바닥 2.0 mL (폴 리 프로필 렌) microcentrifuge 튜브, 18 ° C (경험적 설정)에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기로 전송, 상쾌한 (플라즈마와 버 피 코트)를 제거 하 고.
2. 부드럽게 sedimented 붉은 혈액 세포의 100 µ L를 발음 하 고 수정 된 RPMI 1640 (Hepes) 매체 (아래 설명 참조) 둥근 바닥 2.0 mL microcentrifuge 관에서이 볼륨 1:1 혼합. "1:1" 튜브를 레이블을 지정 합니다.
   참고: 셀을 분리 후 하루에 2 (분석)에 대 한 사용 RPMI 1640 (Hepes) 매체를 포함, 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (100 단위/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 1 m m N-(2-mercaptopropionyl) 글리신 (감소 시키기 위하여 phototoxicity)입니다. 여기서 부터는,이 매체 이라고에 "수정된" RPMI 1640 (Hepes) 매체.
3. 2 mL에 1:1 희석된 적혈구 현 탁 액의 4 µ L 플라스틱 RPMI 1640 (Hepes) 매체, 사전 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 pipetted (이 단계를 반복 2 튜브를 준비 하는 즉, ). 각 튜브 "4:2000" 상표. 얼음에 "1:1" 및 "4:2000" 튜브를 놓습니다.

4. 대 식 세포 원형질 막의 라벨

1. CO₂ 배양 기에서 시드 채널 슬라이드를 제거 하 고 수정 된 RPMI 1640 (Hepes) 매체에 대 한 각 슬라이드에 RPMI 1640 (중 탄산염) 매체를 교환. 다음, CO₂의 부재에서 37 ° C에서 촉촉한 챔버에 세포를 놓습니다.
   참고: 야간 보육 세척 후에, 세포의 대부분 채널에서 제거 됩니다. 나머지 부착 세포의 대부분은 대 식 세포, 면역 형광 염색 법 또는 형태학 상으로 안티-F4/80 항 체를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 약 마우스 주민 복 막 대 식 세포의 95%는 긍정적인 F4/80.
2. 항 체 (4 ° C에서 저장 된) 1:40 수정된 RPMI 1640 (Hepes) 매체에 놓여있는지 녹색 레이블이 반대로 마우스 F4/80 희석. 슬라이드, 틸트 및 슬라이드의 100 µ L 채널의 개통으로 항 체 혼합물의 (드롭) 100 µ L를 플라스틱 ( 그림 1참조). 다운스트림 저수지로 흐르는 매체 발음 37 ° C (CO₂없이, 습도 환경)에서 20 분에 대 한 셀을 품 어. 인큐베이션 기간 동안 레이블을 인간의 적혈구 (5 항 참조).
   참고: 위의 언급, CO₂ 필요 하지 않습니다 HCO₃이후-/CO₂ 버퍼 시스템 Hepes로 대체 됩니다.
3. 후 20 분 부 화 시간 (동안 인간의 적혈구 스테인드 opsonized), 세척 1 mL을 추가 하 여 슬라이드 수정 RPMI 1640 (Hepes) 매체 중 저수지와 후 채널을 통해 이동 했다 매체를 발음에 의해 촉진 슬라이드 기울이기 단기 저장을 위해 1 mL 매체를 추가 하거나 (즉, 입자 (opsonized 붉은 혈액 세포)에 pipetting 및 저속 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법에 의해 식 균 작용 이미징) 실험을 진행 합니다.

5. 라벨 인간의 혈액 세포의 원형질 막

1. (섹션 4.2) 후 녹색 붙일 레이블된 안티-F4/80 항 체와 세포의 슬라이드 배양 직후 인간의 혈액 세포의 라벨을 시작 합니다. 부드러운 혼합 후, "4:2000" 튜브 (섹션 3.3 참조) 중 하나에서 400 µ L를가지고 고 (둥근 바닥) 2.0 mL microcentrifuge 튜브로 분배. 37 ° C의 주위에 따뜻한 서 스 펜 션에 대 한 시간을 허용 (단락 아래 참조). 0.4 µ L 오렌지/레드 형광 플라즈마 막 얼룩 (aliquots-20 ° C에 저장)을 추가 하 고 혼합 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   참고: 층 류 후드 안에 온수 알루미늄 블록 슬라이드를 준비 하는 동안 열 손실을 최소화 하는 데 유용 합니다. 튜브 난방 블록와는 별도의 구멍 우물에 배치 될 수 있습니다 또는 통합, 온수 알루미늄 플레이트를 작업 공간으로 사용할 수 있습니다.
2. 5 분 잠복기 후 1600 µ L 수정 RPMI 1640 (Hepes) 매체 (2.0 mL microcentrifuge 관을 채우기)를 추가 하 여 첫 번째 세척 단계를 준비 합니다.
3. 18 ° C (경험적 설정)에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 튜브 원심 소형 빨간 펠 릿 아래쪽 튜브의 벽 (즉, 오프 센터)에 표시 되어야 합니다. 튜브를 회전 하는 펠 릿은 위쪽으로 직면 하 고 있다 고 조심 스럽게 1-1.5 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 연속 (2 단계)에 상쾌한의 모든을 제거 합니다.
4. 발음은 상쾌한, 후 2000 µ L 수정 RPMI 1640 (Hepes) 중간 혼합 (resuspend 세포), 추가 하 고 위의 원심 분리와 상쾌한 포부 단계를 반복 합니다.
5. 수정 된 RPMI 1640 (Hepes) 매체의 400 µ L로 펠 릿 (원형질 막의 스테인드과 2 x 세척 적혈구)를 resuspend. PMS (플라즈마 막 얼룩에 대 한 약어) 튜브 라벨.
   참고: 또는, 더는 pH에 민감한 rhodamine 파생의 succinimidyl 에스테 르 산 성 pH에서 형광 인간의 붉은 혈액 세포를 사용 하는 수 강하게. 이 경우에, 형광 강도 또한 역할 phagosome 성숙의 입자 내 면 후.

6. opsonization 인간의 적혈구와 마우스 면역 글로불린 G (IgG)의 (라벨)

1. 추가 1 µ L 마우스 (IgG2b) 단일 클로 널 (클론 HIR2) 반대로 인간 CD235a (1 mg/mL) 항 체 (-20 ° C에서 저장 된) 포함 하는 플라즈마 멤브레인 PMS (섹션 5.2-5.5 참조), 표시 된 튜브 얼룩진 인간의 적혈구 400 µ L 매체에. CD235a (glycophorin A 라고도 함)은 erythroid 계보 특정 막 sialoglycoprotein.
2. 8 분 참고 IgG 원인 교착 (셀 clumping)와 인간의 적혈구의 그 opsonization 37 ° C에서 품 어. 교착 opsonization 시각적 표시기 역할을 할 수, 하지만 그것은 단일 phagocytic 효과의 이미징에 대 한 바람직하지 않다입니다. 우회 교착, 반복적으로 혼합 사용 하 여, 예를 들어 변수 셀 정지 (1 분 마다) 20-200 µ L 볼륨 피 펫 200 µ L을 설정 합니다.
   1. 8 분 잠복기의 끝, 원하는, 세척 하는 경우 녹색 붙일 incubated macrophage 슬라이드 안티-F4/80 항 체 라는, 1 mL와 함께 수정 RPMI 1640 (Hepes) 매체. 세척 단계 후 채널 슬라이드의 두 저수지 매체의 무료 인지 확인 합니다.

7. 이미징 원형질 막 먹어서 스테인드 및 인간의 적혈구 세포 IgG-코팅

1. 안티-CD235a 항 체 (6.2 단원)로 8 분 부 화 후 플라스틱 원형질 막 얼룩이 지 고 IgG opsonized 인간의 적혈구 세포 형광 녹색 안티-f 4와 함께 표시를 포함 하는 슬라이드의 채널에 포함 된 100 µ L 정지 / 80 항 체 (4 단계) 따라서, 빨간색 형광, IgG opsonized 인간의 적혈구 녹색 형광 식 세포 (macrophages)에 추가 됩니다.
2. 최대한 빨리 인간의 적혈구 추가한 탑재 채널 슬라이드 회전 디스크 confocal 현미경에 (37 ° C로 설정 단계 인큐베이터) 60 X 통해, 예를 들어 이미지에 대 한 / 1.49 기름 침수 렌즈. 입자 1 분 이내 정착 하기 시작 하는 때문에, 가능한 한 빨리 이미징 시작 합니다.
   참고: 사용 하 여 형광 구슬 100의 직경 nm, 측정, 포인트의 분석에 의해 확산 기능, x의 XY 해상도 = 0.22 μ m, y = 0.23 µ m (488 nm 레이저) 및 x = 0.27 µ m, y = 0.27 µ m (561 nm 레이저). 그러나, 살아있는 세포의 시간 경과 3D 이미징 동안 photobleaching 및 phototoxicity를 줄이기 위해, 우리는 2 x 2 비 닝을 사용 하 여 공간 해상도 타협. 감도 (신호 대 잡음 비율 개선) 및 허용 프레임 속도 증가 binning 하지만 공간적 해상도.
3. 완벽 한 초점을 사용 하 여 (또는 유사한) 녹음 동안 초점 드리프트를 방지 하기 위해 시스템. 완벽 한 초점 시스템을 활성화 한 후 바로 위에 coverslip macrophage lamellipodial 돌출에 초점을 오프셋된 컨트롤 사용 하 여 (아래 참고 참조) 채널 슬라이드의. 이 초점 수준은 해당 z = 0 µ m. 받기 Z-스택-1 µ m에서 16 µ m 0.8 µ m 단계에서 22의 Z 슬라이스로 금액. Z-스택 얻어질 수 있다, 예를 들어 1 스택 (각 채널)에 대 한의 모든 15 16 분의 총에 대 한 s.
   참고: 더 이상 녹음 기간 photobleaching 때문에 주로 이미지 품질의 손실에서 고통. Z-스택 두 채널의 각각에 대 한 인수: 대 식 세포는 488 nm 레이저 (녹색 채널)을 사용 하 여 몇 군데와 인간의 적혈구 561 nm 레이저 (빨강 채널)을 사용 하 여 몇 군데 있다. 이 방법을 사용 하 여, 대 식 세포 IgG opsonized 인간의 적혈구 다른 timepoints에 복용의 다양 한 플레이 얻어질 수 있다 (예를 들어 그림 2참조).
   참고: (2 x 2 비 닝)와 시스템의 일반적인 설정 됩니다: 녹색 채널 (20.5% 레이저 (50 mW, 488 nm) 전원, 101 감도 (0-255 범위) 및 200 ms 노출 시간); 빨강 채널 (10.5% 레이저 (50 mW; 561 nm) 전원, 101 감도 (0-255 범위) 및 98 ms 노출 시간).
   참고: 채널 슬라이드 하단의 #1.5 유리 coverslip와 유리, 동일한 광 속성으로 동일한 두께와 폴리머 이지만, 특히, 재료는 가스 침투성의 이점이 있다.

8. 이미징 스테인드 원형질 막 및 보수 코팅 인간의 적혈구 세포의 식 균 작용

1. 원형질 막 보수 opsonize 얼룩이 지 고 IgG opsonized 인간의 붉은 혈액 세포 마찬가지로 섹션 5와 6을 제외 하 고, 수정 2 mL RPMI 1640 (Hepes) 중간으로 1:1 희석된 적혈구 현 탁 액의 pipetting 4 µ L 대신 섹션 3.3에 설명 된 대로 수정 1 mL RPMI 1640 (Hepes) 매체로 4 µ L 플라스틱 및 그에 따라 튜브 4:1, 000을 레이블. 따라서, 인간의 적혈구는 2 배 더 많은 집중.
2. 섹션 4와 5 단계를 진행 하지만 인간의 혈액 세포의 4:2,000 희석 주식 보다는 4:1,000와 함께 시작 (4:1, 000와 4:2,000를 참조 하십시오 처음 1:1 희석된 인간의 적혈구 섹션에 설명 된의 후속 희석 3.1 그리고 3.2)입니다.
3. C5 null 마우스 (예를 들어, B10 희생. D2-Hc⁰ h 2^d h 2-T18^c/oSnJ; 잭슨 실험실) (> 5% 공기에서) isoflurane 흡입 잘린, 및 수집 혈액에 의해. 우리는 일반적으로 둥근 바닥 14 mL 플라스틱 튜브 isoflurane 흡입 및 잘린 직후에 혈액의 약 0.8 mL 똑.
4. 1 시간 후 혈액 응고 완전히 때는 2.0 mL microcentrifuge 튜브 및 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에 잔여 액체를 전송 합니다. 이후에, 신중 하 게 노란 혈 청을 수집 합니다. 일반적으로, 우리는 적어도 200 µ L C5 null 혈 청을 복구합니다. 얼음에 C5 null 혈 청을 놓습니다.
5. 원형질 막의 4 분 인큐베이션 스테인드 IgG와 인간의 적혈구, 후 (집중 x 2에 게 주는), 안티-CD235a 항 체의 또 다른 1 µ L을 추가 셀 서 스 펜 션의 50 µ L를 취할 하 고 50 µ L C5 null을 포함 하는 별도 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 혼합 혈 청입니다. 계속 반복적으로 아래로, 6.2 단원에서 또 다른 4 분 pipetting 혼합 (각 1 분). 따라서,이 단계 후 인간의 적혈구 8 분의 총에 대 한 안티-CD235a 항 체와 incubated 되었습니다.
   참고: C5 null 혈 청으로 4 분 잠복기 클래식 보완 캐스케이드를 활성화 하 고 opsonize는 죽 습 요인에 의해 나 iC3b 하는 C3b로 인간의 적혈구에 충분 하다.

9. 확인의 IgG-고 C3b-opsonization 인간의 혈액 세포의

1. 염소 반대로 마우스 (보조) IgG 항 체로 녹색 또는 빨간색 형광 fluorophore에 활용 된 세포를 배양 하 여 마우스 안티-CD235a (IgG2b; 참조 섹션 6.1) IgG 항 체와 인간의 적혈구의 opsonization를 확인 합니다.
   1. 인간의 혈액 세포의 400 µ L 정지를 1 µ L 마우스 안티 CD235a IgG 항 체와 1 µ L 붙일 레이블된 반대로 마우스 이차 항 체를 추가 하 고 8 분 동안 37 ° C에서 품 어. 그 후, 두 번 (에서 섹션 5.2-5.5) 씻는 다.
   2. Resuspend 400 µ L로 셀 펠 릿 수정 RPMI 1640 (Hepes) 채널에 서 스 펜 션의 매체와 피펫으로 100 µ L confocal 형광 이미징 ( 그림 1C참조) 슬라이드.
      참고: 셀 것 이다 덩어리 (agglutinate) 세척과 물의 resuspension, 하지만 세척 언바운드 이차 항 체 때문에 배경 형광을 줄일 필요가 있다.
2. 인간 적혈구, opsonization 미리 마우스 IgG와 함께 분류 하 고 인 큐베이 팅 C5 null 마우스 혈 청, C3b/iC3b 사용 하 여, 예를 들어,와 쥐 반대로 마우스 C3b/iC3b/C3c 항 체는 이차 항 체, 예를 들어와 염소 반대로 쥐 IgG 항 체 활용 확인 녹색 형광 fluorophore 하.
   1. 흠 없는 인간의 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 섹션 8에서 단계를 반복 합니다.
   2. 반대로 마우스 C3b/iC3b/C3c 항 체 (50 µ L IgG 라는 인간의 적혈구 + 50 µ L C5 null 마우스 혈 청) 100 µ L 혼합물에 놓여있는지 표시 0.25 µ L을 추가 하 고 8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   3. 두 번 세척, 100 µ L 수정 RPMI 1640 (Hepes) 매체와 피 펫 채널에 정지 confocal 형광 이미징 (그림 1C 참조) 슬라이드에 펠 릿을 resuspend.

결과

저속 회전 confocal 현미경 검사 법에 의해 식 균 작용의 이미징에 사용 되는 채널 슬라이드의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 인간 적혈구 (hRBCs)는 물 들일 붉은 형광 플라즈마 멤브레인 마커 CellMask 오렌지, 절연된 마우스 주민 복 막 대 식 세포 (Ms) 녹색 형광 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 안티-F4/80 항 체 ( 표시 됩니다 반면 그림 2),이 마우스 대 식 세포의 특정 마커로 플라즈마 멤브레인 레이블로 제공. 인간 적혈구 IgG (IgM) 안티-CD235a 항 체 (CD235a, 일컬어 glycophorin, A는 이다 단백질 특히 인간의 붉은 혈액 세포에 표현)과 세포를 배양 하 여 마우스 IgG (mIgG), 또는 마우스 IgM (mIgM), opsonized 될 수 있습니다. 빨간 형광 인간의 적혈구와 제시 하는 녹색 형광 세포의 시간 경과 3D 이미징 단일 입자 phagocytic 이벤트 (그림 2)의 시각화 수 있습니다. 단일 phagocytic 이벤트의 가까운 관측 입자 캡처 및을 섭취 delineated 될을 수 있습니다. 예를 들어 mIgG opsonized 인간의 붉은 혈액 세포의 macrophage filopodium, 얇은, 손가락 같은 투영에 의해 캡처 (그림 3A; Horsthemke 그 외 여러분 참고 관찰 될 수 있다 ¹⁵). 또한, phagocytic 컵 형성 동안 인간의 적혈구의 압박 관찰 될 수 있다 (그림 3A). MIgG opsonized, 신선한 마우스 혈 청 또는 mIgM opsonized, 인간의 적혈구의 도입에 따라 hemolytic 막 공격 복합물의 대형에 절정 클래식 보충 폭포를 방 아 쇠. 보충 중재 된 용 혈의 활동 CellMask 오렌지와 Calcein 듀얼 스테인드 세포 이미징 하 여 측정할 수 있습니다. 녹색 형광 cytosolic Calcein는 급속 하 게 혈 (그림 3B) 동안 셀에서 발표 됩니다.

그림 1: 채널 fibronectin 코팅 슬라이드 처리. (A) A 채널 슬라이드 구성 슬라이드 50 m m x 5 m m 0.4 mm. 채널은 두 개의 저수지 중 하나에 1-2 mL 매체를 적용 하 고 슬라이드를 기울이기 prefilled 처음 크기와 채널에 의해 연결 된 두 개의 저수지. (B) 모자 부 화 하기 전에 저수지에 놓일 수 있다. 모자를 편리 하 게 사용할 수 있는 셀과 채널을 뿌리기 전에 원치 않는 공기 방울 밖으로 펌프. (C) 공기 거품 없는 100 µ L 채널 채널의 입으로 직접 매체를 pipetting으로 채울 수 있습니다. 이 단계는, 예를 들어 종자 세포 슬라이드에 또는 추가 gfluorophore (형광 그린)-마우스 대 식 세포 마커 뿐 아니라 막 라벨으로 활용 된 안티-F4/80 항 체. (D)로 붙일 시드 채널로 opsonized 인간의 적혈구, 같은 입자를 pipetting 스테인드 대 식 세포, 슬라이드는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 될 수 있습니다. 및 저속 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법 수 수행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 식 균 작용의 시간 경과 3D 이미징. (A) 회로도 마우스 (m) 안티-CD235a 면역 글로불린 G (mIgG) 항 체, 및 레이블된 hRBCs 마우스 대 식 세포 (Ms), 하의 프레 젠 테이 션 스테인드 (레드 형광) 인간의 적혈구 (hRBCs) 플라즈마 멤브레인의 opsonization를 보여주는 녹색 형광 fluorophore 활용 된 안티-F4/80 항 체로 (녹색 형광) 표시. (B) 시간 경과 이미지 (XZ 조회), 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법, phagocytic 컵 형성 및 mIgG opsonized hRBCs의 섭취에 의해 얻은. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 3 차원 복원 mIgG opsonized hRBCs을 섭취 하는 세포를 보여주는. B. 그리드 간격 대표 (는 timepoints의 3)에 대 한 해당 XZ 뷰 표시 됩니다 5.07 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3:는 filopodium에 의해 입자의 캡처. 마우스 대 식 세포는 마우스 면역 글로불린 G (mIgG)를 캡처를 보여주는 디스크 confocal 현미경 검사 법을 회전 시켜 얻은 시간 경과 이미지-opsonized 인간의 적혈구 (hRBC) filopodium (상단 패널에서 화살표)를 통해 손가락 같은 투영. Note는 적혈구 phagocytic 컵 형성 동안 일찍 그것의 crenations를 잃는다. 또한, phagocytic 컵 엔벌로프된 붉은 혈액 세포 (낮은 패널에 화살표로 표시 됨)를 집어넣은 것으로 보인다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

먹어서 분석 실험, 특히 끝점 및 높은 처리량 분석 실험의 대다수 팬 들은 어떻게 입자는 실제로, 덮여 캡처하고 섭취의 시각화의 정보를 제공 하지 않습니다. Munthe 카스 외 에 의해 선구적인 연구 ¹⁰ 과 카 플 란² 는 1970 년대에서 현저 하 게 다른 cytoskeletal 개편 IgG opsonized 보완 opsonized 입자 (양 적혈구) 대의 식 균 작용에 참여 했다 제안 했다. 여기 우리가 먹어서 분석 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 단일 phagocytic 이벤트의 고해상도, 실시간 이미징 수 있도록 설명 합니다. 우리의 모델 이것은는 마우스 주민 복 막 대 식 세포, 최소한의 처리와 격리 될 수 있는 그리고 우리가 입자 갓 고립 된 인간의 적혈구 사용. 그러나, 먹어서 분석 실험 마우스 골 수 유래 세포 또는 호 중구, 마우스 대 식 세포 세포 선, 인간 monocyte 파생 된 세포 또는 인간의 말 초 혈액 호 중구 등 다른 식 세포에 적용할 수 있습니다. 인간의 식 세포 또는 마우스 호 중구, 붙일 항 체 라는 대안 붙일 레이블된 안티-CD14 항 체 (인간 monocytes/대 식 세포)¹⁶ 또는 안티-Gr-1 (Ly-6 G) 항 체 (마우스 등 필요한 것 호 중구)입니다.

Unopsonized 인간 적혈구, 전통적으로 사용 양 적혈구, 같은 점에서이 세포는 하지 (또는, 적어도, 아주 드물게) 섭취 마우스 복 막 대 식 세포에 의해 불활성 있습니다. 이렇게 하면, 폴리스 티 렌 구슬, 달리 낮은 배경 활동. 인간 적혈구는 편리 하 게 마우스 IgG 또는 IgM 단일 클론 항 체에 대 한 CD235a 사용 하 여 면역 글로불린과 opsonized 수 (A glycophorin), 인간의 적혈구 (적혈구) 및 erythroid 선구자^17, 의 특정 마커 ¹⁸. 병렬 분석 실험에 붙일 레이블된 반대로 마우스 IgG 또는 IgM 이차 항 체 opsonization 확인에 적용할 수 있습니다. IgG 및 IgM 항 체 클래스는 hemagglutinins, agglutinate 적혈구를 일으키는 원인이 되는 물질 (항 체). 교착을 피하기 위해, 우리 일시적으로 세포 현 탁 액 8 분 잠복기 동안와 함께 혼합 안티-CD235a 항 체, 다음 우리는 혼합된 정지 직접 슬라이드를 추가 대 식 세포를 포함 하 채널 (fibronectin 코팅 슬라이드) 세척 단계 없이 . 세척 단계 교착을 강력 하 게 촉진 하는 원심 분리 하 여 적혈구의 침전을 포함 한다. 인간 적혈구 opsonizing, 전에 우리 닥터지 오렌지/레드 형광 프로브 플라즈마 멤브레인 레이블을. 이 조사는 시간 경과 기록의 시작 부분에 밝은 형광 하지만 신호 점차적으로 페이드, 아마 크게 photobleaching¹⁹때문. 또한, 대 식 세포와 슬라이드의 fibronectin 코팅 약하게 오렌지/레드 형광 녹음 동안 될 수 있습니다. 이 문제는 아마도 때문에 라벨링 후 인간의 혈액 세포의 불충분 한 세척. 닥터지 형광 플라즈마 멤브레인 마커를 사용 하 여, 대신 인간의 적혈구의 아민 반응 succinimidyl 에스테 르^15,20를 사용 하 여 pH에 민감한 rhodamine 파생으로 표시 수 있습니다. 이 형광 강도 증가 감소 pH^15,20, 하지만이 방법은 반응 에스테 르 준비는 현재 불리는 phagosome 성숙의 시각화를 허용의 이점이 있다 비싼 고 수성 매체에서 재구성 후 불안정.

IgG opsonized 인간의 적혈구 (Fcer1g 녹아웃) 쥐는 NOTAM²¹ 또는 Fcer1g-/-절연 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 확인 될 수 있다 FcγRs 통해 섭취 됩니다. NOTAM 세포 IgG opsonized 인간의 적혈구, 바인딩 하지만 부족 ITAM (immunoreceptor 티로신 근거한 활성화 주제)-중재 Fcer1g 녹아웃 세포 표면 FcγRs. IgG를 표현 하지 않는 반면, 식 균 작용을 유도 하는 데 필요한 신호- IgM opsonized 인간의 적혈구 수 수 또한 opsonized C3b (어떤은 iC3b에 죽 습)와 보완 C5 null 마우스에서 갓 고립 된 혈 청을 가진 세포 배양에 의해 또는 (야생 형 혈 청 하면 용 혈). IgG와 IgM opsonins 활성화 클래식 보완 캐스케이드 (막 공격 복합물) 공과 셀 세포의 형성에 이르게 합니다. 쥐 부족 보완 C5, 보충 폭포 C3 분열을 보완 하기 위해 진행 하지만 C5 convertase 터미널 통로 진작 하는 데 필요한 기판 부족. 우리가 간단한 분석 실험 보완 캐스케이드의 활동을 측정 하기 위해 개발. 즉, 인간의 적혈구 형광 레드, 원형질 막 마커 및 녹색 형광, cytosolic fluorophore 공동 레이블이 될 수 있습니다. 막 공격 복합물의 대형, 시 보완 구성 요소 C5-C9에 의해 형성 된 cytosolic fluorophore는 급속 하 게 (초)는 cytosol에서 잃었다. 보충 폭포의 끝-효과 기 (cytolysis) 함수의 시각화 표시 4 분 보육 시간 C3b/iC3b opsonization 인간의 적혈구에 대 한 충분 한. 병렬 분석 실험에서 인간의 혈액 세포의 C3b/iC3b 코팅 쉽게 반대로 마우스 C3b의 혼합물을 적용 한 후 평가 고 붙일 이차 항 체 라는 될 수 있습니다. 이 경우에, 세척 단계는 언바운드 형광 항 체를 제거 해야 합니다. 세척 단계는 교착을 촉진, 원심 분리에 의해 셀 sedimentaion를 포함 한다 비록 성공적인 opsonization confocal 현미경 검사 법에 의해 쉽게 평가 될 수 있다. 보충 수용 체-중재 먹어서 어느 적용 IgG-몇 군데 수 / iC3b opsonized 인간의 붉은 혈액 세포 NOTAM 또는 Fcer1g-/-대 식 세포 또는 IgM-도입 하 여 인간의 붉은 피가 iC3b opsonized 야생-타입 세포에 세포 /. IgM opsonized 혈액 세포는 ITAM 포함 된 FcγRs (FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV) IgG opsonized 입자²²의 식 균 작용에 필요한에 의해 인식 되지 않습니다.

Phagocytic 이미지를 이벤트, 대 식 세포의 원형질 막 마우스 대 식 세포의 특정 마커로 역할도 녹색 형광 fluorophore 활용된 안티-F4/80 항으로 표시 수 있습니다. 인간 적혈구 렌더링할 수 있습니다 레드 형광 외피에 의해 오렌지/레드 형광 플라즈마 막 표시와 함께 위에서 설명한 대로. 이 질 성 원형질 막 마커 항 체 기반 라벨의 잠재적인 혼란 효과 방지합니다. 빨간 형광 인간의 적혈구, opsonization, 없이 직접 채널 슬라이드의 100 µ L 채널에 pipetted 수 고 60 X 통해 3D 시간 경과 촬영 / 1.49 오일 침수 (또는 유사한) 렌즈는 488를 사용 하 여 수행 및 561 nm 레이저 라인 회전 디스크 (또는 유사한) confocal 현미경의 각각. 그것은 고해상도 이미징, 하지만 반복된 Z-스택 16 분 이상의 수집에 대 한 시스템을 최적화 하기 위해 유혹 또는 그래서 상당한 photobleaching 및 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. 우리는 좋은 신호 대 잡음 비율을 홍보 하 여 자극 강도 및/또는 노출 시간, 하지만 광학 해상도 감소를 허용 binning 2 x 2를 사용 하기로 결정 했습니다. 또한, phototoxicity를 줄이기 위해, 우리는 매체에 반응성 산소 종의 폐품을 추가 합니다. 미래 연구에서는 분석 실험 apoptotic 인간의 혈액 세포의 식 균 작용의 이미지를 수정 수 있습니다. 신호 및 초기 apoptosis^24,25의 phosphatidylserine 외부화²³을 한 "" 나를 먹는 유도 하 Ca^{2 +} ionophore, A23187, 등의 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 G plastic catheter	B Braun Mesungen AG, Germany	4254503-01	Used for peritoneal lavage
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14170120	Used for peritoneal lavage
14 mL polypropylene round bottom tubes	BD Falcon	352059	Used to collect peritoneal cells
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes	Sigma-Aldrich	R7388	Basis medium for assays
Heat-inactivated fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10082139	Used as supplement for RPMI 1640 media
100x penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Used as supplement for RPMI 1640 media
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers	Ibidi, Martinsried, Germany	80102	Channel slides used for assays
µ-Slide (anodized aluminum) rack	Ibidi, Martinsried, Germany	80003	Autoclavable stackable rack for channel slides
RPMI 1640 medium containing bicarbonate	Sigma-Aldrich	R8758	Medium for overnight culture
N-(2-mercaptopropionyl)glycine	Sigma-Aldrich	M6635	Scavenger of reactive oxygen species
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody	Thermo Fisher Scientific	MF48020	Mouse macrophage marker and plasma membrane label
CellMask Orange	Thermo Fisher Scientific	C10045	Red fluorescent plasma membrane stain
Succinimidyl ester of pHrodo	Thermo Fisher Scientific	P36600	Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a	Thermo Fisher Scientific	MA1-20893	Used to opsonize human red blood cells with IgG
Alexa Fluor 594-conjugated  goat anti-mouse (secondary) IgG antibody	Abcam	Ab150116	Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody	Hycult Biotech	HM1065	Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11006	Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization
Calcein/AM	Thermo Fisher Scientific	C3100MP	Used to load human red blood cells with Calcein
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		Spinning disk confocal microscope system
Nikon Eclipse Ti inverse microscope	Nikon, Japan		Inverted microscope
CSU-X1 spinning disk scanner	Yokogawa Electric Corporation, Japan		Nipkow spinning disk unit
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera	Hamamatsu Photonics Inc., Japan		EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system
488 nm solid state laser, 50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system
561 nm solid state laser, 50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germany		Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system