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요약

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

초록

물고기 모델과 행동 점점 생명 과학;에 사용 그러나, 오랫동안 물고기 생태, 생리 및 독성에 관한 연구의 대상이 되고있다. 디지털 추적 플랫폼을 자동화를 사용 하 여, neuropharmacology에 최근 노력 소설 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 표적 식별 애벌레 물고기 운동 동작을 활용 하. 이러한 노력에 비슷한 환경 과학 및 비교 약리학 연구 및 독성 오염 물질의 계층된 평가에 대 한 표면 바닷물의 실시간 모니터링 진단 도구로 물고기 모델의 다양 한 동작을 검사는 오염 물질의 위협 Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노 ecotoxicology에서 일반적인 애벌레 물고기 모델입니다. 불행히도, fathead 미노 애벌레 행동 연구에 상당히 적은 관심을 받았습니다. 여기, 우리 개발 모델 neurostimulant로 카페인을 사용 하 여 행동 프로 파일 프로토콜을 설명 하 고. Fathead 황 어의 photomotor 응답 했다 카페인에 의해 때때로 영향을, 비록 zebrafish photomotor 및 환경 관련 수준 응답 운동 끝점에 대 한 현저 하 게 더 과민 했다. 미래의 연구가 필요 나이 및 시간와 물고기 간의 비교 행동 감도 차이 이해 하 고 비슷한 행동 효과 자연에서 발생 하는 것 개인에 불리 한 결과의 표시 될 있는지 확인 또는 생물 학적 조직의 인구 수준입니다.

서문

비록 물고기 모델을 생물 의학 연구를 위해 점점 사용 된다, 물고기는 정기적으로 고용 생태 및 생리 연구, 표면 바다의 오염을 확인 하 고 화학 물질의 독성에 관한 임계값 이해를. 화학 오염 수 중 생태계에 악영향을 줄 수 있기 때문에 소스 물 공급1,2의 품질을 위태롭게 그러한 노력이 중요 하다. 그러나 상거래, 부족에에서 화학 물질의 대부분도 기본적인 독물학 정보3.

전통적으로 규제 독성 시험에 사용 하는 동물 모델 분석 실험 자원 집중 및 높은 처리량을 제공할 수 없습니다 독성 21 세기4에 테스트에 필요한 초기 계층 심사. 그 후, 채택 하 고 활용할 수 있는 보다 신속 하 고 효율적으로 화면 생물 학적 활동3,5용 생체 외에서 모델 성장 원동력이입니다. 셀 기반 모델 제시 많은 기회, 하지만 그들은 종종 생물학적 복잡성, 부족 하 고 따라서 대사6을 포함 하 여 많은 중요 한 전체 유기 체 프로세스에 대 한 계정을 하지 않습니다.

Zebrafish는 수생 독성 및 ecotoxicology7,8대체 모델로 인기를 얻고 있다 일반적인 생물 동물 모델입니다. 그들의 작은 크기, 빠른 개발 및 높은 통치 감안할 때, 물고기 모델 신속 하 고 효율적으로 화면 bioactivity 및 전체 유기 체 규모9에 독성 화학 물질을 사용할 수 있습니다. 자동된 추적 소프트웨어의 도움으로 애벌레 zebrafish 행동 독성10,11에 대 한 오염 물질 차단에 향상 된 진단 유틸리티를 제공 합니다. 운동 끝점 행동의 화학적 메커니즘의 정보 표현 형 동작을 사용할 수 있습니다 및 다음 미정 비 발한 분자12, subcellular 목표를 식별할 수는 약 학에 학문은 설명 했다 13. Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노는 ecotoxicology 연구 및 예비 하는 동안 사용 되는 일반적인, 생태학적으로 중요 한 물고기 모델 (예를 들어, 새로운 화학 평가) 및 (예를 들어, 주위 표면 물 또는 폐수 유출 방전 모니터링) 회고전의 환경 평가 불행히도, 애벌레 fathead 황 어의 행동 답변 zebrafish 보다 현저 하 게 더 적은 주목을 받았다. 우리의 지속적인 연구 모델과 2 개의 일반적인 애벌레 물고기, zebrafish 및 fathead 미노 애벌레 물고기 패턴 표시 예상된 모드 또는 다양 한 화학 물질에 대 한 행동의 메커니즘에 나왔다. 따라서, 행동 끝점 신속 하 고 민감하게 독성에 대 한 화학 물질을 확인 하 고 초기 계층 평가 중 특히 산업 화학 및 기타 오염 물질에 대 한 subcellular 목표를 식별 하는 잠재력을 제공 합니다.

여기, 우리 보고 애벌레 물고기에 행동 반응 프로필을 조사 하기 위한 프로토콜. 카페인, 모델 neurostimulant과 다음 인간의 소비 식품의 폐수 처리 식물에서 방전을 통해 수 중 시스템을 도입 하는 일반적인 수 중 오염 물질을 사용 하 여 이러한 방법을 보여 줍니다 음료, 그리고 제약 카페인14와 공식화입니다. 두 애벌레 zebrafish 및 fathead 미노, 조명 조건, 수시로 불린다 photomotor 응답 (PMR)으로 배아와 애벌레 제약 연구 기간 동안에 급격 한 변화를 포함 하 여 카페인 행동 응답 검토 zebrafish13,15. 우리 각 물고기 모델에 대 한 화학 응답 프로 파일을 개발 하는 여러 운동 끝점을 통해 카페인의 효과 식별 합니다. 이 연구에 사용 하는 치료 수준 카페인 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. 우리는 또한 애벌레 물고기 LC50 값, 그리고 치료 위험 값 (THV), 물고기 인간 치료 플라즈마 복용량과 일치에 플라스마 수준에서 결과를 예상 하는 물에 약 제 농도를 벤치마킹 하는 치료를 포함 합니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 연구 일반적으로 표준화 된 실험 설계를 수행 하 고 미국 환경 보호 기구 (EPA no. 2000.0) fathead 황 어에 대 한 경제 협력을 위한 조직에서 권장 되는 통계 분석 지침 및 제 브라에 대 한 개발 (OECD no. 236)입니다. 이러한 실험 디자인 (예를 들어, 복제 증가) 미래 연구에 대 한 현재 프로토콜 내에서 수정할 수 있습니다. 생선 문화 조건에 따라 이전 문학17게시. 모든 실험 절차와 물고기 문화 프로토콜 따라 베일 러 대학에서 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜.

1. 노출 물고기 화학 치료를

  1. 카페인 재구성된 하드 물에 용 해 하 여 카페인 노출 솔루션을 준비 합니다. 높은 카페인 치료 낮은 카페인 치료 수준의 생산 하드 물으로 희석 하 여 적절 한 직렬 희석을 수행 합니다.
    주: 표 1 각이 실험에 사용 하는 치료 수준 요약 합니다.
제 브라Fathead 미노
치료공칭 카페인 농도 (mg/L)측정 된 카페인 농도 (mg/L)치료공칭 카페인 농도 (mg/L)측정 된 카페인 농도 (mg/L)
제어0< LOD제어0< LOD
75 Centile *0.0010.00175 Centile *0.0010.001
95 Centile *신제품 개발: 0.0390.01395 Centile *신제품 개발: 0.0390.009
99th Centile *0.4120.36199th Centile *0.4120.310
THV4.073.81THV4.074.12
10% LC5048.4646.6610% LC5014.114.7
40% LC50193.82186.6740% LC5056.3853.91

표 1: 제 브라와 fathead 미노 실험에 대 한 실험적인 카페인 치료. 각 치료에 대 한 카페인의 공칭 및 측정 값을 받는다. *이 연구에 사용 된 카페인 치료 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. THV: 치료 위험 값입니다. 탐지의 LOD: 제한

  1. 개별 노출 샴페인에 준비 솔루션을 붓는 다. Fathead 미노 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 200 mL와 함께 가득한 제 브라 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 20 mL 100 mL 유리 비 커와 500 mL 비 커를 사용 합니다.
  2. 전송 피 펫을 사용 하 여, 각 치료 마다 4 개의 복제 노출 챔버 10 zebrafish 태아 세 4-6 h 게시물 수정 (hpf)를 배치 합니다.
  3. 장소 10 fathead 미노 애벌레 치료 당 3 복제 노출 챔버의 각 화의 24 시간 이내 세. Fathead 미노 애벌레의 더 큰 크기에 맞게 잘라 전송 피 펫의 끝 이전에 전송.
  4. 16:8 h 빛: 다크 photoperiod 28 ±의 일정 한 온도에서 zebrafish 실험 유지 1 ° c. 사용 하 여 동일한 photoperiod 정권 fathead 미노 연구에 대 한 하지만 25 ±의 온도 1 ° c.
  5. 화학 노출의 96 h, 후 부하 개별 물고기 (zebrafish)를 위한 48의 24 (fathead 미노)에 대 한 별도 우물에 잘 접시.
    1. 각 잘 솔루션의 동일한 볼륨을 포함 하는 보장 하기 위해, zebrafish 애벌레 48 잘 플레이트 잘 당 1000 µ L 볼륨에 대 한 5000 µ L autopipette를 사용 하 여 전송. 철수와 전송 zebrafish 애벌레 및 노출 하는 autopipette를 사용 하 여 솔루션을 동시에.
    2. 그들의 큰 크기로 인해, fathead 미노 애벌레 차단 팁 전송 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다. 각 개별 웰 스 fathead 미노 애벌레를 전송 하기 전에 채우기는 autopipette를 사용 하 여 2000 µ L을 잘. 웰 스에 개별 fathead 애벌레를 전송할 때 전송 피 펫 팁 잘 솔루션에 놓고 잘으로 피 펫 팁에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.

2입니다. 교정 비디오 추적 매개 변수

  1. 행동 조치 전에 비디오 트랙 소프트웨어에 관찰 및 교정 매개 변수 설정 (재료의 표 참조).
    1. 1 애벌레 물고기 개별 잘에서 녹음 실에서 잘 접시를 놓습니다. 보정 매개 변수를 설정 표현으로 판과 관련 된 물고기를 사용 합니다.
    2. 비디오 트랙 소프트웨어에서 클릭 "파일 | 생성 프로토콜", 어떤"프로토콜 작성 마법사"대화 상자가 열립니다. "위치 수" 필드에 잘 접시의 개인 우물의 수를 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.
    3. 화면 상단에서 클릭 "보기 | 전체 화면 "을 잘 플레이트의 오버 헤드 카메라 뷰를 표시 하려면 시스템을 묻는 메시지가 표시 됩니다.
    4. 3 여러 모양으로 나타나는 "그리기 영역" 아이콘을 클릭. 보기 영역 잘 접시의 오른쪽에 "지역"를 표시 하는 필드에 원 아이콘을 선택 합니다.
    5. 커서를 사용 하 여 추적 영역 잘 플레이트의 왼쪽 상단에 원형 비디오의 윤곽을 그리 다. "오른쪽 위 마크" 선택한 다음 상단 오른쪽 잘의 보기 영역을 설명 합니다. 그런 다음, "하단 마크" 하단 오른쪽 잘 윤곽을 선택 합니다.
      참고: 원형 윤곽을 그리기, 후의 위치 가능성이 하셔야 조정 해야 합니다.  윤곽선의 위치를 조정 하려면 "선택"을 클릭 하 고 개요 영역을 이동 하려면 커서를 사용 합니다. 또한, 윤곽선 "복사본" 및 다음 "붙여넣기"를 클릭 하 여 복제 될 수 있습니다.
    6. 후 왼쪽 상단, 오른쪽, 상단, 하단 오른쪽 잘 추적 영역으로 정의 된 "빌드" 소프트웨어 자동으로 나머지 우물의 보기 영역을 나타내는 표시를 클릭 합니다.
    7. "교정" 표시 된 영역에서 "인출 규모"를 클릭 합니다. 커서를 사용 하 여 접시에 걸쳐 가로 선을 그립니다. 라인을 그려 "교정 측정" 이라고 표시 된 대화 상자가 표시 됩니다. 잘 플레이트 길이 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.
    8. "그리기 영역" 아이콘을 클릭 하 여 그리기 관리자를 종료 합니다.
    9. "타일" 아이콘을 클릭 합니다.  커서를 사용 하 여 각 상자는 녹색 보기 화면에 표시 되는 모든 상자를 강조 표시 합니다.
      참고: 6 개별 작은 사각형의 그룹으로 타일 아이콘 표시
    10. "보기 | 전체 화면 "입니다.  보기 영역 접시의 오른쪽에 "검출 임계값" 상자에서 "Bkg"을 클릭 합니다. 임계값 조절 막대를 사용 하 여 픽셀 검출 임계값을 설정 하려면. 적절 한 픽셀 검출 임계값을 선택 하는 한 번, "그룹에 적용"을 클릭 하십시오.
      참고:이 프로토콜 설정 합니다 감지 임계값 zebrafish 관찰에 대 한 블랙 모드에서 13, 110에 fathead 미노 관찰에 대 한 투명 모드에서.
    11. "이동 임계값" 표시 상자에서 원하는 운동 속도 추적 매개 변수를 입력 합니다. 속도 매개 변수가 설정 되 면 "그룹에 적용"을 클릭 합니다.
      참고:이 프로토콜 5 mm/s에서 20 m m/s 및 비활성/작은 움직임에서 작은/큰 움직임을 설정합니다. 이 선택 세 가지 다른 속도 수준에서 애벌레 물고기 움직임을 추적 하는 소프트웨어 프로그램: 비활성 (동결) = < 5 mm/s, 소형 (크루즈) = 5-20 m m/s, 그리고 큰 (파열) = > 20 m m/s.
    12. 클릭 "매개 변수 | 프로토콜을 매개 변수 "드롭 다운 메뉴에서 합니다. 대화 상자에서 Enter 관측 시간 및 통합 시간 "시간" 탭을 선택 합니다. 매개 변수를 입력 한 후 "확인"을 클릭 합니다.
    13. 설정 하려면 명암 photoperiod 시간과 광도 빛 드라이버 설정 대화 상자 "매개 변수"에서 "라이트 운전"을 선택 하 여 각 photoperiod 오픈에 대 한 드롭 다운 메뉴.
      주: 여러 빛-어둠 photoperiods를 설정 하기 위한 프로토콜 비디오를 참조 하십시오.
    14. 비디오 추적 매개 변수를 설정 관찰 프로토콜을 저장 합니다.
      참고:이 프로토콜 4 명암 단계 구성 된 두 개의 10 분 빛 및 2 개의 10 분 어두운 기간을 변경 하 여 다음 10 분 새 환경 순응 단계를 포함 하는 50 분 동안 물고기 동작을 관찰 합니다. 통합 시간 50 분 행동 재판의 각 분에 대 한 동작을 측정 하기 위해 설정 됩니다.

3. 애벌레 물고기 운전의 관찰 및 Photomotor 동작

  1. 행동 녹음 실에서 실험 물고기를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다.
  2. 추적 소프트웨어 비디오에서 3 단계에서 개발 추적 프로토콜을 엽니다.
  3. 비디오 추적 뷰어에서 모든 애벌레는 컴퓨터 화면에서 볼 수 있는지 확인 하려면, 그 하나의 개별 유 충은 각 음에 존재 하 고 개별 우물 2.1.5 및 2.1.6 단계에서 정의 된 관측 영역 내에서 정렬 됩니다 확인 합니다.
  4. 클릭 "실험 | "실행 합니다.
    참고: 시스템 이름 및 관측 데이터를 저장할 위치를 입력 하 라는 메시지가 나타납니다.
  5. 일단 이름 및 저장 위치 관측의 데이터 지정, 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 하기 위해 "여러 라이브 이미지" 아이콘을 클릭
    참고:이 아이콘 컴퓨터 화면의 상단에 위치 하 고 4 개의 작은 사각형으로 분할 상자 나타납니다. 이 아이콘을 클릭 하면 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 표시 됩니다.
  6. 녹음 실의 패널을 닫고 클릭 "배경 | 시작 "컴퓨터 모니터에.

4. 행동 데이터 분석

  1. 애벌레 물고기 활동 데이터를 검색 하려면 추적 소프트웨어에 의해 자동으로 컴파일 및 행동 실험 (3.4 단계)을 시작 하기 전에 사용자가 지정한 폴더에 스프레드시트를 엽니다.
  2. 각각 그림 1A 및 1B 순진한 unexposed zebrafish fathead 미노 애벌레, 운동 활동의 대표적인 측정을 참조 하십시오. 효과적으로 빛이 어둡거나 빛 어두운 전환 움직임 차이의 크기를 검사 하는 PMR 계산 그림 1C 및 1d 를 참조 하십시오.

figure-protocol-6568
그림 1: 노출 되지 않은 제 브라 (A 및 B) 및 fathead 미노 (C , D)의 초기 활동의 예입니다. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 두 어둡고 photomotor 응답의 2 개의 빛 기간 측정 됩니다. 마지막 (a, c, e, 및 g) 및 (b, d, f, 그리고 h) 첫 번째 분 photoperiod 각의 zebrafish (B)의 PMRs Photomotor 응답을 계산 하는 데 사용 됩니다 및 fathead 미노 (D)는 마지막 순간 사이 여행을 하는 의미 (±SEM) 거리에 변화 측정 초기 photoperiod와 다음 기간의 첫 번째 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

결과

카페인 치료 수준을 분명 zebrafish 및 fathead 황 어와 96 h 실험 동안 다 하지 않았다. 예를 들어 표 1 각 치료 수준의 농도를 분석 검증된을 선물 한다. 이 프로토콜 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 이전에 보고 된 방법28를 일반적으로 다음에 의해 카페인 치료 수준에 대 한 물 샘플을 확인 합니다. Paraxanthine, 카페인의 1 차 대사 산물의 형성 또한 정량 했다. 이러한 분석 절차의 설명에 보충 분석 정보 제공 됩니다. 치료의 공칭 및 분석 검증 사이 상사 성 때문에 공칭 치료 수준이이 논문의 나머지 부분에 걸쳐 표시 됩니다. 카페인은 크게 zebrafish 및 fathead 미노 동작 변경. 그러나, zebrafish 운동 응답은 더 fathead 황 어 보다 카페인에 민감한 일관 되 게 되었다. 제 브라와 fathead 미노 애벌레에 대 한 가장 중요 한 행동 끝점 카페인 0.039 밀리 그램의 농도에 의해 영향을 받은/최저 관찰된 영향 농도 (LOECs) 및 아무 관찰 된 효과 농도 (NOECs) 나 표 2 요약 대 한 두 가지 물고기 모델에서 각 행동 끝점입니다.

제 브라Fathead 미노
끝점LOEC (mg/L)NOEC (mg/L)끝점LOEC (mg/L)NOEC (mg/L)
총 거리 어둠0.412신제품 개발: 0.039총 거리 어둠−56.38
총 거리 빛48.464.07총 거리 빛−56.38
총 수 다크0.412신제품 개발: 0.039총 수 다크−56.38
총 수 빛48.464.07총 수 빛−56.38
거리 어둠 붕괴−193.82거리 어둠 붕괴−56.38
거리 빛 파열193.8248.46거리 빛 파열−56.38
어두운 건의 파열193.8248.46어두운 건의 파열−56.38
붕괴 수 빛193.8248.46붕괴 수 빛−56.38
기간 어둠 붕괴193.8248.46기간 어둠 붕괴−56.38
금지 기간 빛−193.82금지 기간 빛−56.38
순항 거리 어둠0.412신제품 개발: 0.039순항 거리 어둠−56.38
순항 거리 빛48.464.07순항 거리 빛−56.38
어두운 계산 순항0.412신제품 개발: 0.039어두운 계산 순항−56.38
순항 건의 빛48.464.07순항 건의 빛−56.38
크루 징 기간 어둠0.412신제품 개발: 0.039크루 징 기간 어둠−56.38
크루 징 기간 빛48.464.07크루 징 기간 빛−56.38
어두운 거리를 고정0.412신제품 개발: 0.039어두운 거리를 고정신제품 개발: 0.0390.001
고정 거리 빛신제품 개발: 0.0390.001고정 거리 빛−56.38
어 어두운 계산0.412신제품 개발: 0.039어 어두운 계산−56.38
냉동 수 빛48.464.07냉동 수 빛−56.38
어두운 기간을 동결−193.82어두운 기간을 동결56.3814.10
기간 가벼운 동결48.464.07기간 가벼운 동결−56.38
어두운 1 PMR48.464.07어두운 1 PMR신제품 개발: 0.0390.001
1 PMR 빛48.464.071 PMR 빛−56.38
다크 2 PMR48.464.07다크 2 PMR−56.38
2 PMR 빛48.464.072 PMR 빛−56.38
어두운 1 PMR 파열−193.82어두운 1 PMR 파열−56.38
빛 1 파열 PMR−193.82빛 1 파열 PMR−56.38
어두운 2 PMR 파열193.8248.46어두운 2 PMR 파열−56.38
빛 2를 파열 PMR−193.82빛 2를 파열 PMR−56.38
어두운 1 PMR 순항48.464.07어두운 1 PMR 순항−56.38
크루즈 1 PMR 빛48.464.07크루즈 1 PMR 빛−56.38
어두운 2 PMR 순항48.464.07어두운 2 PMR 순항−56.38
순항 빛 2 PMR193.8248.46순항 빛 2 PMR56.3814.10
어 어두운 1 PMR48.464.07어 어두운 1 PMR−56.38
빛 1 냉동 PMR193.8248.46빛 1 냉동 PMR−56.38
어두운 2 PMR 동결48.464.07어두운 2 PMR 동결−56.38
빛 2 동결 PMR193.8248.46빛 2 동결 PMR−56.38

표 2: 제 브라와 fathead 미노 행동 NOECs와 카페인에 대 한 LOECs. 아니 관찰 영향 농도 (NOEC), 빛/어둠의 각각에 대 한 최저 관찰 영향 농도 (LOEC) (mg/L) 값 수영 활동 끝점 및 photomotor 제 브라와 fathead 황 어 카페인에 노출에 대 한 응답. 대시 표시 효과 없이 모든 치료 단계에 걸쳐 특정 끝점에서 관찰 되었다.

그림 2 는 총 운동 활동 zebrafish 및 fathead 미노 96 h 카페인에 노출 다음의 PMRs를 선물 한다. Fathead 미노 애벌레 PMRs zebrafish, 보다 낮은 치료 수준 (0.038 mg/L)에서 카페인 photomotor 끝점의 현저 하 게 많은 수에 의해 변경 된 zebrafish에 영향을 받았다. 카페인 (193.82 mg/L)의 높은 치료 수준이이 반응을 정확 하 게 반대 했다 zebrafish에 PMR 변경 컨트롤에서. 그러나이 높은 치료 수준,, PMRs 어둠 속에서 감소 하 고 조명 조건에서 증가.

figure-results-6598
그림 2: 수영 활동과 제 브라 (A 및 B) 및 96 h 카페인에 노출 후 fathead 미노 (C , D)의 photomotor 응답. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 제 브라 (B)와 (D) fathead 미노의 Photomotor 응답 평균 (± SE) 총 거리는 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행에 변화로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

애벌레 PMRs를 측정 하는 것 외에도 빛과 어둠 운동 활동 3 이동 거리에 대 한 속도 임계값, 움직임의 수 및 움직임의 기간에 걸쳐 분석 했다. 이 데이터는 행동 응답 카페인 ( Supplemental 그림 1,그림 3)에 대 한 프로 파일을 개발 하는 데 사용 됩니다. 카페인 저해 활동에는 물고기 모델에, 운동 끝점을 크게 영향을 받습니다. 비록 크게 하지 두 생선, 카페인에 노출 다음 붕괴 속도 임계값에 시연된 활동 증가 모델. PMR 관측의 결과 마찬가지로 카페인 영향 zebrafish 운동 끝점의 더 많은 수 있습니다. 사실, 카페인은 크게는 THV 환경 현실적인 수준에서 어두운 조건 하에서 여러 가지 운동 응답을 변경. 그러나, fathead 미노 운동 활동은 크게 영향을 받지 어떤 치료 수준으로 조명 조건 하에서.

figure-results-8023
그림 3: 96 h 카페인에 노출 후 애벌레 zebrafish 및 fathead 황 어의 응답 프로필. Zebrafish 어두운 (A) 빛 (B) 수영 96 h 카페인에 노출 된 후 어두운 fathead 미노 (C)와 빛 (D) 활동을 의미 하는 비교 하는 활동을 의미 합니다. 2 10 분 어두운 photoperiods와 각 물고기 모델에 대 한 2 개의 10 분 빛 photoperiods 데이터 나타내는 활동을 꾸몄다. 각 그림에서 0 축에 표시 되는 제어 데이터 정규화 됩니다. 행동 매개 변수 포함 거리, 움직임 (개수)의 수 및 각 이동의 기간에 붕괴 3 속도 레벨에 걸쳐 헤 엄 (> 20 m m/s), 순항 (5-20 m m/s), 냉동 고 (< 5 mm/s). 각 속도 임계값의 운동 패턴, 뿐만 아니라 총 거리 수영 하 고 움직임의 총 수 표시 됩니다. ↑ 제어에 비해 활동에 상당한 증가 나타내고 ↓ 제어에 비해 활동에 상당한 감소를 나타냅니다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 미노 행동 관측에 사용 하는 각 그룹에 대 한. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 제 브라 (A 및 B) 및 3 속도 임계값에 걸쳐 fathead 미노 (C , D)의 Photomotor 응답 합니다. 제 브라 (A, B 및 C) 및 fathead 미노 애벌레 (D, E 및 F) photomotor 응답 3 속도 임계값에 걸쳐 (동결: 20 mm/s) 카페인에 96 시간 노출 후. 제 브라와 fathead 미노의 Photomotor 응답 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행을 하는 의미 (±SE) 총 거리 변경으로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (4 애벌레의 3 복제) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. * p < 0.01 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

행동 독성 학 연구에 대 한 화학 치료 수준을 선택할 때 여러 가지 요인은 고려해 야 합니다. 현재 연구에서 카페인 치료 수준에서 폐수 유출16예측된 환경 노출 시나리오에 대 한 상위 centile 값에 따라 선정 됐다. 가능 하면 우리가 일상적으로 수생 독성 연구 환경 관측19,,2021의 개 연 론 노출 평가 사용 하 여 처리 레벨을 선택 합니다. 의약품에 대 한 계산 가능한 THV 또한 현재 연구에서 치료 수준으로 포함 되었다. THV 값 (식 1)22,23 예측된 물 농도 물고기23조 제약의 인간의 치료 복용량 (Cmax)로 이어지는로 정의 됩니다, 초기 플라즈마 노력24, 모델링에서 영감 있고 혈액: 물 화학 분할 계수 (식 2)25에 따라 계산 합니다.

THV C최대 = / PBW (식 1) 로그

로그 PBW 로그 = [(100.73. Kow 로그 · 0.16) + 0.84] (식 2)

여기, 우리는 또한 zebrafish 및 fathead 미노 LC50 값을 기준으로 sublethal 치료 수준을 선택합니다. 우리이 이렇게 행동 반응에 대 한 유용한 벤치마킹 절차 특히 때 고려해 여러 화학 물질에 걸쳐 물고기 모델 특정 동작의 임계값을 비교 합니다. 그것은 더 급성 진단 기계 연구와 평가 대 한 수생 독성에 유용 될 수 있는 만성 비율의 계산을 지원 합니다. LC50 값 단계 2.1에에서 주어진 표준된 지침에 따라 예비 독성 생물 검정에서 얻은 했다.

이 프로토콜에서 일반적인 실험적인 디자인을 채용 하 고 통계적 기법 물고기 모델 독물학 연구를 위한 표준화 된 방법 미국 EPA와 OECD에서 권장. 비록 우리가 보고 p 값 (예., < 0.01, < 0.05, < 0.10), 큰 차이가 (α = 0.10) 활동 수준의 경우 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 치료 중 식별 됩니다 정상 및 분산 정의의 등가 충족 됩니다. Dunnett의 또는 Tukey의 HSD 포스트 hoc 테스트 치료 수준 차이 식별 하기 위해 수행 됩니다. 우리 선택이 알파 (α = 0.10) 값을 유형 II 오류, 특히 초기 계층 분석 및 대신 understudied 행동 끝점 및 모델 생물26, 생물학으로 중요 한 효과 크기의 이해는 제한 하는 경우 여러 비교를 위해 생물 의학에서 일반적인 절차를 사용 (예., Bonferroni 보정 RNA-Seq 데이터에 대 한)27.  미래의 연구는 이러한 행동 반응의 다양성을 이해 하 고 그에 따라 실험 디자인 (예를 들어, 증가 복제) 수정 필요 합니다.

요인의 수 화학 노출 이외에 애벌레 물고기의 행동을 좌우할 수 있다. 예를 들어, 나이, 잘 크기, 온도, 조명 조건, 및 각 잘 나타내는 중요 한 고려 사항11,30노출 솔루션의 시간. 이러한 이유로 주의 실험 중 애벌레 물고기의 운동 동작에 영향을 미칠 수 있는 외부 요인의 영향을 최소화 하기 위해 취해야 한다. 행동 관찰 좁은 시간 창 (3 ~ 4 h)와 하루 효과의 시간 애벌레 운동 동작11에 최소한의 영향을 미칠 것으로 예상 하는 때 기간에 걸쳐 수행 되어야 한다. 또한, 애벌레 물고기 유지 되어야 한다 (28 ± 1 ° C zebrafish)와 24 ± 1 ° C FHM에 대 한 일관 된 온도에 그리고 노출 기간 동안 인큐베이터 온도 제어에 정의 된 명암 주기. 또한, 행동 기록 됩니다 실험실의 온도 조건에 동작 온도 영향을 피하기 위해 실험 조건에 가깝게 유지 되어야 한다. 또한, 행동 관찰 하는 동안 사용 하는 웰 스 각 개별 물고기에 대 한 일관성 있는 볼륨에서 유지 되어야 합니다.

애벌레와 배아 zebrafish PMRs 이전에서 사용 된 생물 의학 과학 소설 화합물12,13대 한 잠재적인 치료 목표를 식별 하 이 프로토콜 zebrafish 이전 행동 연구 조사 환경 오염 물질의 화학 bioactivity 38 끝점을 사용 하 여 확장 합니다. 카페인은 행동 (MoA)의 이해 메커니즘으로 일반적인 수 중 오염 물질, 상거래에 많은 화합물 중요 한 기계적 데이터가 부족 합니다. 따라서,이 프로토콜은 MoAs의 독성 데이터를 상용 화학 물질39를 포함 하 여 부족 한 화합물에 대 한 통찰력을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 두 가장 일반적으로 사용 되 어 모델에 대 한 메서드를 제공합니다. 설명 했 듯이 이전에 제 브라는 일반적인 생물 생선 모델을 ecotoxicology에서 점점 인기 끌고있다, 미노는 일반적으로 환경 평가 응용 프로그램에 대 한 생태 모델으로 사용 되지만 받은 fathead 자동화 된 시스템은 제 브라에 비해 행동 연구에 비교적 덜 관심. 물고기 행동 독성 학 연구에 대 한 표준화 아무 규제 방법 남아,이 프로토콜 향후 지원에 대 한 접근을 제공 합니다.

카페인 수생 환경16에서 발견 된 수준에서 물고기 모델의 각에 행동 반응 elicited. 로드 리 게 스-길 외. 2018 글로벌 환경 노출 배포판 카페인16의 측정된 값에 따라 수생 시스템 개발. 특히, 예측된 폐수 방류 수 농도의 95%는 현재 연구 (표 2)에서 제 브라와 fathead 미노의 가장 중요 한 행동 끝점에 대 한는 LOECs 아래 나누어질 것 이다. 카페인의 여러 가지 행동 효과 환경 관련 수준 (특히 어두운 조건)에서 zebrafish에 관찰 되었다, 그러나 그것은 불분명 여부 이러한 행동 수정 또는 천연 물고기 인구에 발생할 수 있습니다 결과 생태학적으로 중요 한 불리 한 결과입니다. 하지만 민감한, 진단 검사 목적에 유용, 애벌레 물고기 행동 임계값 대표 다른 생활사 단계 또는 자연적인 인구에 있는 물고기의 수 있습니다. 더 연구는 보증 비슷한 여부 결정 하 행동 응답 임계값 것 자연에서 발생 되며 생물 학적 조직의 개인 이나 인구 수준에 불리 한 결과의 표시.

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립 과학 재단에 의해 제공 된 지원 (# 프로젝트: CHE 1339637) 미국 환경 보호국에서 추가 지원. 우리 일반 실험실 지원에 대 한 닥터 존스 코랄, 닥터 로렌 Kristofco, 개 빈 Saari, 사무엘 드는, Bekah Burket 및 Bridgett 힐 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ViewPoint ZebraboxViewPointZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
CaffeineSigma-AldrichC0750-100GStudy chemical
IncubatorVWR9110589Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
IncubatorThermo Fisher Scientific35824-636Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakersVWR89000-200Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers PyrexEW-34502-03Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipetteEppendorfResearch 5000Used to fill individual wells in well plates
Transfer PippettesVWR414-004-004Used to transfer study organisms 
48-well platesFisher Scientific08-772-52Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well platesVWR10062-896Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrateSigma-AldrichC3771For reconstituted hard water
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate Sigma-AldrichS5761For reconstituted hard water
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333For reconstituted hard water
z-mod recirculating systemMarine Biotech SystemsRecirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis softwareSigma Plot Version 13.0Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis softwareGraphpad PrismPrism 5Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping systemAgilent TechnologiesInfinity 1260 model Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization sourceAgilent TechnologiesAnalytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer Agilent TechnologiesModel 6420Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) Agilent Technologies685775-914TCaffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software Agilent TechnologiesDetermine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

참고문헌

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. . Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -. O., Halden, R. U. . Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. . Design and Analysis of Ecological Experiments. , (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

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