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요약

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

초록

Phosphoproteomics phosphorylated 단백질의 대규모 연구를 포함 한다. 단백질 인 산화 많은 신호 전달 경로에서 중요 한 단계 이며, 단단히 kinases와 가수분해에 의해 규제 됩니다. 따라서, 특성화는 phosphoproteome 소설 목표 및 종양 치료를 위한 생체 식별에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 질량 분석 세계적으로 감지 하 고 독특한 인 산화 이벤트의 수천을 계량 하는 방법을 제공 합니다. 그러나, phosphopeptides는 비-phosphopeptides, 더 도전 하 생 화 확 적인 분석 보다 훨씬 풍부. 이 한계를 극복 하기 위해 방법 질량 분석 분석 전에 phosphopeptides를 풍부 하 게 하는 필요 합니다. 우리는 추출 및 펩 티 드, phosphotyrosine (평)와 phosphoserine/트레오닌 (pST) 펩 티 드 항 체 기반을 사용 하 여 또는 이산화 티타늄 (티 오2)에 대 한 농축 뒤를 조직에서 단백질을 소화 하는 절차를 설명-기반 농축 방법입니다. 샘플 준비 질량 분석 후, 우리는 연속적으로 식별 하 고 phosphopeptides 액체 크로마토그래피-질량 분석 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

서문

약된 165000 새로운 케이스 및 약 29000 사망자 2018 대표 하는 가장 일반적인 암과 미국1에 남성 암 관련 된 죽음의 두번째 주요한 원인이 전립선 암 때문에 발생 합니다. 전립선 암의 초기 단계는 기관 수감 질병, 10 년 재발 률 20%와 40% 전립선을 받아야 하는 환자와 30%와 50% 방사선을 받을 환자 사이 사이의 절제술 또는 방사선 치료로 치료할 수 있다 치료2. 때문에 안 드로 겐 성장을 위한 신호에 의존 하는 전립선 암, 수술, 화학적 거세 치료 또한 위험이 높은 환자에 대 한 고용 됩니다. 그러나, 재발 발생 암 안 드로 겐 박탈 요법을 생화학 적 재발에 의해 입증 이상 응답 어디에서 혈 청 전립선 특정 항 원 다시 상승 합니다. 이 시점에서 진행, 전이 종종 감지 됩니다. 이 고급 단계, 전이성 거세 내성 전립선 암 이라고 예 지가 2 년3보다는 더 적은의 평균 생존 시간이 질병의 치명적인 형식을 나타냅니다. 몇 가지 치료 옵션이 docetaxel 같은 화학 요법 taxane 기반 뿐만 아니라 enzalutamide와 abiraterone, 2 세대 antiandrogens를 포함 하 여 단계의 질병에 사용할 수 있습니다. 사용 가능한 트리 트 먼 트에 불구 하 고 질병 종종 진행. 따라서, 발견과 새로운 치료 modalities의 개발 고급 질환 전립선 암 환자 치료를 개선 하는 데 필요한 있습니다.

질량 분석 (MS)-펩 티 드 analytes4의 수천 수백의 검색을 통해 proteome의 글로벌 분석을 제공 하는 기반된 접근. 특히, 식별 및 펩 티 드4,5의 수천의 정량 발견 proteomics로 알려진 또한 데이터 종속 수집 (DDA), 얻을 수 있습니다. MS 기반의 검색 proteomics 더 내려 proteomics, 그대로 단백질 특징 및 상향식 (로 알려진 또한 샷건) 단백질, 펩 티 드 단백질5의 특성을 분석 하 구분 된 될 수 있습니다. 따라서, 샷건 proteomics에 베이스 단계에서에서 일어난다 단백질 펩 티 드로 다니엘을 선행 하는 MS 분석 샘플 준비. 결국에는 펩 티 드 단백질 확인을 위해 다시 매핑할 수 데이터베이스 검색 수행 됩니다. 레이블 없는 뿐만 아니라 몇몇 동위 원소-라벨 [예를 들어, 안정 동위 원소 세포 배양 (SILAC)에 있는 아미노산에 의해 라벨] 방법은 사용할 수 있습니다 샘플6,7사이 펩 티 드를 양적 비교 하. 동위 원소 라벨 기술 금 동안, 레이블 자유로운 방법 유사한 정량화 정확도8,9 증명 그리고 감도 및 특이성10비교 장단점. 레이블 없는 정량 큰 범위를 제공 하 고 반면 레이블 기반 방법 비용 및 멀티플렉싱 용량6,,78에 의해 제한 됩니다 많은 더 많은 샘플, 사이 비교를 허용.

또한, 샷건 MS가 포스트 번역 상 수정 (PTMs) 인 산화11등도 사용할 수 있습니다. 총 펩 티 드에 비해 phosphopeptides의 더 낮은 화학 량 론 특성, 여러 가지 방법은 항 체 기반 immunoprecipitation phosphotyrosine (pY) 펩 티 드의 이산화 티타늄 (티 오2 포함 하 여 phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게 채용 ), 및 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)5,12움직일. 단백질 인 산화 신호 경로, 샷건 phosphoproteomics 유 방13, 전립선14, 신장15를 포함 하 여 다른 암에 변화를 신호 하는 세포를 조사 하는 연구원 수 많은 세포에서 중요 한 단계 이므로 그리고 난소,16,17 암 생물학을 이해 하 고 치료에 대 한 잠재적인 새로운 목표를 식별 하는.

이 레이블 없는 샷건 phosphoproteomic 방법은 Graeber 그룹18,,1920에 의해 건축 하 고 세련 된에 따라 이전 작품 이었다. 이 프로토콜 추출 및 펩 티 드로 단백질 및 조직에서 phosphoproteins의 소화를 설명 함으로써 시작 됩니다. 우리는 다음 세부 평 펩 티 드 항 체 특정 phosphotyrosine 사용 하 여 티 오2의 농축. 우리는 또한 강력한 양이온 교환 (SCX) 뒤에 티 오2를 사용 하 여 phosphoserine/트레오닌 (pST) 펩 티 드의 농축을 설명 합니다. 이 프로토콜은 MS 시설 샘플의 제출 및 확인 하 고 phosphopeptides 및 그들의 해당 phosphoproteins 계량 MS 분석 소프트웨어를 사용 하 여 마칩니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램은 다른 암과 종양 이외의 필드에 전립선 암 넘어 확장할 수 있습니다.

프로토콜

이 종이 식 종양을 사용 하 여 실험 승인 되었다 Rutgers 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 설정으로 앞뒤로 국립 보건원의 지침에 따라.

1. 단백질 추출

  1. 세포의 용 해 버퍼 (표 1)를 준비 합니다. (볼륨 샘플 수확의 수에 따라 달라 집니다.) 체 외에서 세포 샘플에 대 한 1.2 단계를 진행 합니다. 종양 조직에 대 한 1.3 단계를 진행 합니다.
  2. 세포를 수확
    1. 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 수집 하 고 700 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 그들을 회전합니다 삭제는 상쾌한 고 얼음에 펠 릿을 유지. 한 펠 릿으로 세포를 수집 하는 모든 요리에 대해이 단계를 반복 합니다. (일반적으로 5 mg의 단백질, 세포의 약 5 거의 confluent 15 cm 요리 필요 하지만이 셀 라인에 종속 될 수 있습니다 각 탐정에 의해 실험적으로 결정 되어야.)
    2. PBS를 발음 하기 전에 700 x g 4 ° C에서 5 분에 냉장된 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 스핀 30 mL와 펠 릿을 세척. 셀 펠 릿을 사용 하는 단백질의 5 밀리 그램 당 세포의 용 해 버퍼의 1.5 mL를 추가 합니다. 몇 번 위아래로 피펫으로입니다. 1.4 단계로 건너뜁니다.
  3. 수확 하는 조직
    1. 종양 무게 고 문화 테스트 튜브에 조직의 모든 100 밀리 그램에 대 한 차가운 세포의 용 해 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다. (일반적으로, 조직 젖은 무게의 50 ~ 150 mg 필요 합니다.)
  4. 균질 lysate 사용 하는 휴대용 또는 벤치탑 균질 화기 (15 2 x 펄스 s.) 첫 번째 샘플을 하기 전에 및 연속에서 10% 표 백제, 70% 에탄올, 그리고 이온된 수를 사용 하 여 샘플 간의 균질 화기를 청소.
  5. 줄이고 알, 5 분 동안 95 ° C에서 무 균된 샘플을 열. 다음 15 분 동안 얼음에 그들을 냉각 하십시오. 얼음, lysate 3 x sonicate (즉, 30에 대 한 펄스 펄스 사이 60 s 일시 중지 s). 샘플 수 없습니다 점성 또는 clumpy이 시점에서. 5 분2195 ° C에서 lysate 열.
  6. 15 분에 대 한 15 ° C에서 3500 x g에서 진동 물통 회전자를 사용 하 여 동일한 쥡니다에 lysate 튜브 원심 분리기는 상쾌한을 수집 하 고 펠 릿을 삭제.
  7. Bradford 분석 결과22를 수행 하 여 단백질 농도 결정 합니다. 필요한 경우, 세포의 용 해 버퍼 5 mg/ml lysate 희석. -20 ° c.에 그것을 저장합니다
    참고: 실험 수 수 일시 중지 여기. -80 ° C에서 샘플을 동결 하 고 나중에 계속 합니다.

2. lysate 소화

  1. 12-fold 샘플을 희석 100mm 트리 스를 사용 하 여 (pH = 8.5) guanidinium의 양을 줄이기 위해. 부동 한 소화의 효과 최소화 하기 위해 동일한 볼륨에 모든 샘플을 희석. 12.5 µ g는 소화의 Coomassie 스테인드 젤23에 확인 lysate를 저장 합니다.
  2. 5 mg의 단백질, Lysyl Endopeptidase (리스-C)의 10 µ g을 추가 하 고 5-6 h. 조정 산도 여 8.0에 대 한 실 온에서 품 어 트리 (pH ~ 11) untitrated 1 M를 추가.
  3. L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl 케 톤 (TPCK)의 1 mg/mL를 준비-1 m m HCl (20 m m CaCl2)에 트립 신을 취급. 트립 신: 단백질 비율을 1: 100에는 트립 신을 추가 하 고 37 ° C 3 h에서 품 어.
  4. 2.3 단계에서 신선한 trypsin의 동일한 금액을 추가 합니다. 품 어 그것은 37 ° C에서 하룻밤.
  5. 12.5 µ g는 소화의 Coomassie 스테인드 젤23에 완전 한 소화를 확인 lysate를 저장 합니다.

3. 반전 단계 추출

  1. Lysate 볼륨을 기록 합니다. 15 mL 10 kDa 컷오프 필터를 사용 하 여 샘플을 필터링 합니다. Retentate 볼륨 미만 250 µ L (이 약 45-60 분 소요) 될 때까지 스윙 양동이 터를 사용 하 여 g (또는 고정된 각도 터에 3500 x g) 3500에서 샘플 15 ° C에서 원심. 흐름을 통해 수집 하 고는 retentate를 삭제.
    참고: 실험 수 수 일시 중지 여기. -80 ° C에서 샘플을 동결 하 고 나중에 계속 합니다.
  2. 샘플을 시 어 지 다, lysate의 mL 당 5 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 약 20 µ L를 추가 합니다. 그들을 잘 혼합 하 고 산도 스트립을 사용 하 여 샘플 pH를 측정 한다. 2.5 5%를 사용 하 여 pH를 조정 TFA.
  3. 진공 매니폴드를 C-18 열의 더 짧은 끝을 연결 합니다. 17 34 kPa (또는 제조업체의 지침에 따라) 진공을 설정 합니다. 유리 펫을 사용 하 여 100% 이기 (ACN)의 3 mL와 함께 열 젖은. 건조 열을 게 하지 마십시오.
  4. 유리 를 사용 하 여 펫, equilibrate 6 mL의 0.1% TFA 2 x 3 mL로 열. 열에 acidified 샘플을 로드 합니다. 한 번에 이상의 3 mL를 추가 하지 마십시오. 초당 약 1 ~ 2 방울을 대상으로 진공을 조정 합니다.
  5. 유리 를 사용 하 여 펫, 0.1% TFA 3 x 3 mL로 적용의 9 mL와 함께 열을 씻어. 40%의 2 mL와 함께 열을 elute ACN, 0.1 %TFA. 유리 문화 관에 두 2 mL 분수를 수집 합니다. 열을 삭제 합니다.
  6. Parafilm eluate 튜브 커버 및 20 G 바늘을 사용 하 여 덮개에 3-5 구멍을 펀치. 그것은 완전히 고체 때까지 적어도 30 분을 위한 드라이 아이스에 eluate를 고정 합니다.
  7. Lyophilize 분수 하룻밤. 다음 날, 샘플은는 lyophilizer를 중지 하기 전에 완전히 건조 되었는지 확인 합니다. 튜브-80 ° c.에 섬세 한 물티슈 50 mL 원뿔 튜브에 저장
    참고: 실험 수 수 일시 중지 여기.

4. Immunoprecipitation과 펩 티 드24 평의 농축

  1. 각 부분에 얼음 처럼 차가운 immunoprecipitation (IP) 바인딩 버퍼의 0.5 mL로 동결 건조 된 분말을 resuspend. 두 번째 부분에서 첫 번째 분수 0.5 mL 물의 resuspension 볼륨을 전송 하 여 분수를 풀 고 피 펫 팁을 저장 합니다. (아래로 pipetting) 대신 적극적으로 소용돌이 샘플 3.6 mL 나사 모자 cryotube에 그것을 전송 하기 전에 완전히 용 해 되도록.
  2. 4.1 단계에서., 린스 IP 바인딩 버퍼 (표 1)의 또 다른 0.5 mL 동결은 튜브 각 튜브에. 3.6 mL 스크류 캡 튜브 샘플 손실 최소화 하기 위해 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여 전송 솔루션. 린스 1, x 2 mL (단백질의 5 mg)에 대 한 최종 물의 resuspension 볼륨 만들기를 반복 합니다. 측정 샘플 pH 약 7.4 있는지 확인 합니다. 그것은 너무 산 성, 반복적으로 1 M 트리 스 (untitrated, pH 11 ~)의 10 µ L를 추가 합니다. 그것은 너무 기본, 반복적으로 희석 HCl (1시 25분 또는 1: 100)의 10 µ L를 추가 합니다.
  3. 미리 세척 (lysate 시작 5 mg)에 대 한 평 구슬
    1. 4G 10 항 체의 25 µ g와 27B10.4 항 체의 12.5 µ g 샘플 당 필요 합니다. p200 사용 후 별도 microcentrifuge 튜브로 항 체를 전송, 얼음 처럼 차가운 IP 바인딩 버퍼의 450 µ L와 항 체를 씻어 잘라 팁 플라스틱 2 배. 4 ° C와는 상쾌한 밖으로 aspirate에서 1 분 동안 100 x g에서 원심 그들.
    2. IP 바인딩 버퍼를 사용 하 여 0.5 mg/mL의 농도 재고를 구슬 resuspend (하지 소용돌이 구슬 할.) 단일 튜브에 aliquoting 필요한 슬러리 (4G 10 항 체 슬러리 및 샘플 당 25 µ L 27B10.4 항 체 슬러리의 50 µ L), 후에 4 ° c.에 1 분 동안 200 x g 재고 원심 분리기 튜브 아래로 회전 상쾌한와 측 벽 반환 구슬 냉장고에 저장 하기 전에 씻으십시오.
  4. 미리 씻어 pY 구슬 나사 모자 cryotubes에서 resuspended 샘플 솔루션에 추가 합니다. 품 어 그들 이상 끝 회전에 4 ° C에서 하룻밤.
  5. 섬세 한 지우기 늘어서 50 mL 원심 분리기 튜브에 나사 모자 cryotubes를 배치 합니다. PST 펩 티 드에 대 한 풍부 하 게 하는 데 사용 됩니다 상쾌한 저장 1 분에 100 x g에서 구슬 아래로 회전 합니다. (태평양 표준시에 대 한 농축 단계 7에서 시작 하 고 평 펩 티 드 처리를 병렬로 수행할 수 있습니다).
  6. IP 바인딩 버퍼의 300 µ L와 구슬 resuspend 2 mL microcentrifuge 튜브에 그들을 전송 하 고 4 ° c.에 1 분 x 100g에 스핀 다운
  7. 린스는 인큐베이션 IP 바인딩 버퍼의 200 µ L x 3 튜브. 내용을 전송 같은 Microcentrifuge 튜브 각 시간. 다음 아래 그들을 회전 합니다.
  8. microcentrifuge에 구슬 IP 바인딩 버퍼의 500 µ L x 3 튜브와 1 분 x 100g에 스핀 다운 세척. 다음 씻어 구슬 4 x 25 mM NH4HCO3, pH 7.5, 및 그들에서 1 분 사용 신선한 25mm NH4HCO3 솔루션에 대 한 100 x g에서 분말 때마다 스핀의 450 µ L.
  9. 원심 1500 x g 1 분 사용에 구슬 구슬의 표면 보다 약간 젤 로드 팁의 끝을 담거 서는 상쾌한을 완전히 제거 하는 젤 로드 팁.
  10. 0.1%의 비드 볼륨 x 4 추가 TFA는 구슬에 (즉, 0.1%의 300 µ L을 추가 pY 비드 슬러리의 75 µ g에 대 한 TFA). 그들을 잘 혼합 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 1000 rpm에서 thermomixer에 혼합물을 품 어
  11. 0.2 µ m 회전 필터는 물의 resuspension 전송. 신속 하 게 차입 튜브 아래로 회전 하 고 P10 피펫으로 사용 하 여 동일한 회전 필터에 잔류 볼륨을 전송. 1 분에 대 한 850 x g에서 회전 필터 다운 스핀 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 관에는 차입을 전송 합니다. 진공 집중 건조 하 eluate 하룻밤 40 ° C에서 열 시간 300 분의.
    참고: 실험 수 수 일시 중지 여기. -80 ° C에서 샘플을 동결 하 고 나중에 계속 합니다.

5. 이산화 티타늄 농축25 평 펩 티 드의

  1. 50%의 200 µ L에서 phosphopeptides 아래로 말린 resuspend ACN, 0.1 %TFA. 소용돌이 원심 그들 10000 x g에서 30 s. 반복에 대 한 그들을 잘 resuspend에 1 x이.
  2. 용량이 200 µ L 샘플에 대 한 팁에 포함 된 티 오2 비즈를 준비.
    1. 끝으로 자료를 이동 팁의 작은 팁 사이드에 부드럽게 누릅니다. 100%의 200 µ L을 추가 하 여 팁을 린스 ACN, 팁을 반전 하 고 뚜껑 쪽으로 액체를 이동 하려면 작은 끝을 터치 하 여 다음.
    2. 끝의 작은 끝을 잘라 면도날을 사용 하 고 낮은 단백질 바인딩 튜브위에 그것을 배치. (폴리스 티 렌 튜브는 TiO2 튜브의 측면에 붙어 것입니다 사용 하지 마십시오.) 뚜껑을 제거 하 고 나머지 ACN 밖으로 급락 micropipette 삽입. 100%의 200 µ L 가진 세척을 반복 = 뉴스. TiO2 구슬 지금 다음 단계에 대 한 낮은 단백질 바인딩 튜브에 있습니다.
    3. 전제 티 오2 100% ACN 2의 500 µ L x. 피펫으로 구슬 용 매 혼합 그것. 1 분에 100 x g에서 원심 그들.
    4. 티 오2 0.2 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH ~ 7)의 500 µ L 조건 2 배. 평형의 300 µ L와 구슬 버퍼 3 배 세척. 티 오2 매우 밀도 때문에, 구슬 신속 하 게 정착 됩니다.
  3. 50%의 400 µ L 추가 ACN, 0.1 %TFA 낮은 단백질 바인딩 튜브에 이어서 추가 84 µ L 젖 산의. 낮은 단백질 바인딩 튜브에 resuspended phosphopeptides를 전송 하 고는 이상 끝 회전자를 사용 하 여 실 온에서 1 h에 대 한 그들을 품 어.
  4. 그들을 작은 1 분 x 100g에 구슬 원심 재래식 버퍼 (표 1) 2의 300 µ L로 그들을 씻어 x 100 x g 1 분 동안에 그들을 아래로 회전 하는 고.
  5. 300 구슬 린스 rinsing의 µ L 버퍼 2 배. 0.2 µ m 회전 필터에 그들을 전송. 1500 x g 1 분 동안에 그들을 회전 합니다.
  6. 낮은 단백질 바인딩 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 필터 단위를 전송. 내용 2 elute 0.9% NH3 H2오 측정 산도 스트립, 10와 11 사이 있어야 한다 pH에서에서의 200 µ L x. 진공 건조 하룻밤 암모니아를 증발 하 게 eluate 집중.

6. 담 MS 분석 평 펩 티 드

  1. 0.1%의 15 µ L 함께 phosphopeptides reconstitute vortexing와 30에 대 한 10000 x g에서 centrifuging TFA 그들을 resuspend에 s. 1이 x 잘 그들을 resuspend를 반복 합니다. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 하지 않습니다.
  2. 5 µ g의 바인딩 용량 C-18 팁을 사용 하 여 샘플을 청소 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라.
  3. 완전히 진공 농도 의해 차입 볼륨을 건조. 이것은 1-2 헤 질량 분석 솔루션의 12.5 µ L에 말린된 phosphopeptides Resuspend ( 표 1참조) (또는 연구원의 MS에 의해 권장으로 proteomics 시설 코어). 소용돌이 짧게 잘 그들을 resuspend에 30 s. 반복이 2 x에 대 한 10000 x g 다운 솔루션을 회전. 샘플 (11 단계) 질량 분석 시설에 제출에 대 한 준비가 되었습니다.
    참고: 다음 단계는 pST 펩 티 드 농축만 관련이 있습니다.

7. 리버스 pST 펩 티 드의 위상 추출

  1. 펩 티 드 분석 결과 수행 하 여 단계 4.6에서에서 획득 하는 상쾌한의 펩 티 드 농도 측정 합니다. PST 질량 분석에 대 한 충분 한 금액은 2.5 mg 이다.
  2. 5%와 3.5 pH 조정 TFA.
  3. 진공 매니폴드를 C-18 열의 더 짧은 끝을 연결 합니다. 17 34 kPa (또는 제조업체의 지침에 따라) 진공을 설정 합니다. 100%의 3 mL와 함께 열 젖은 = 뉴스. 건조 열을 게 하지 마십시오.
  4. 6 mL의 0.1% TFA 2 x 3 mL로 열 equilibrate 열에 acidified 샘플을 로드 합니다. 한 번에 이상의 3 mL를 추가 하지 마십시오. 초당 약 1-2 방울을 대상으로 진공을 조정 합니다.
  5. 9 mL의 0.1% TFA 3 x 3 mL로 열 워시. 40%의 2 mL와 함께 열을 elute ACN, 0.1 %TFA. 유리 문화 관에 두 2 mL 분수를 수집 합니다. 열을 삭제 합니다.
  6. Parafilm eluate 튜브 커버 및 20 G 바늘을 사용 하 여 덮개에 3-5 구멍을 펀치. 그것은 완전히 고체 때까지 적어도 30 분을 위한 드라이 아이스에 eluate를 고정 합니다.
  7. 밤새 선택한 분수를 lyophilize. 다음 날, 샘플은는 lyophilizer를 중지 하기 전에 완전히 건조 되었는지 확인 합니다. 튜브-80 ° c.에 섬세 한 물티슈 50 mL 원뿔 튜브에 저장
    참고: 실험 수 수 일시 중지 여기.

8. 강한 양이온 교환 (SCX) pST 펩 티 드

  1. (표 1) 버퍼 A의 2 mL에 동결 건조 된 펩 티 드를 resuspend. 각 샘플에 대 한 분수를 풀. (솔루션 흐린 됩니다.)
  2. 진공 매니폴드를 준비 합니다. SCX 열을 제거 하는 플런저와 함께 3 mL 주사기에 연결할. 17 34 kPa (또는 제조업체의 지침에 따라) 진공을 설정 합니다.
  3. ACN, 뒤에 버퍼 A.의 4 mL의 4 mL와 함께 SCX 열 조건
  4. 8.1 단계에서 샘플의 2 개 mL를 로드 하 고 즉시는 eluate를 수집 합니다. A:B (80.9:19.1) 버퍼의 3 mL 로드와 eluate 수집 합니다. 풀의 각 샘플 aliquot 있다 그들 2 mL 낮은 단백질 바인딩 튜브로.
  5. 진공 집중 모든 샘플 볼륨의 약 30% 남아 때까지. (이 단계는 약 2-4 h 걸립니다.) 각 샘플에 대 한 1 낮은 단백질 바인딩 관으로는 aliquots 풀.
  6. 진공 매니폴드를 C-18 열의 더 짧은 끝을 연결 합니다. 17 34 kPa (또는 제조업체의 지침에 따라) 진공을 설정 합니다. 100%의 3 mL와 함께 열 젖은 ACN 2 x. 할 게 열 건조 하지 .
  7. 0.1%의 3 mL와 함께 열 equilibrate TFA 2 x. 열에 샘플을 로드 합니다. 한 번에 이상의 3 mL를 추가 하지 마십시오. 초당 약 1-2 방울을 대상으로 진공을 조정 합니다.
  8. 3 mL 0.1%의 열을 씻어 TFA 2 x. 50%의 4 mL와 함께 열을 elute ACN, 0.1 %TFA.

9. 이산화 티타늄 농축 pST 펩 티 드의

  1. 용량이 200 µ L 샘플에 대 한 팁에 포함 된 티 오2 구슬 준비
    1. 그 끝에 구슬을 이동 팁의 작은 팁 사이드에 부드럽게 누릅니다. 뚜껑을 제거 하 고 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 비즈를 부 어.
    2. 100%의 200 µ L을 추가 하 여 팁을 린스 ACN, 반전 팁 몇 번 하 고 뚜껑 쪽으로 액체를 이동 하려면 작은 끝을 터치. 끝의 작은 끝을 잘라 면도날을 사용 하 여, 그리고 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브 위에 그것을 배치. 뚜껑을 제거 하 고 나머지 ACN 밖으로 급락 micropipette 삽입. 100%의 200 µ L 가진 세척을 반복 = 뉴스. 티 오2 구슬 지금 다음 단계에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 있습니다.
    3. 전제 티 오2 100% ACN 2의 500 µ L x. 피펫으로 구슬 용 매 혼합 그것. 1 분에 100 x g에서 원심 그들.
    4. 티 오2 0.2 M 나트륨 인산 염 버퍼 (pH ~ 7)의 500 µ L을 두 번 조건. 평형의 300 µ L와 구슬 버퍼 3 배 세척.
  2. 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 eluted phosphopeptides를 전송 합니다. 젖 산의 560 µ L을 추가 하 고는 이상 끝 회전자를 사용 하 여 실 온에서 1 h 품 어.
  3. 작은 구슬 1 분 x 100g에 혼합 원심 재래식 버퍼 (표 1) 3의 300 µ L로 그들을 씻어 x. 1 분 x 100g에 그들을 아래로 회전 합니다.
  4. 300 구슬 린스 rinsing의 µ L 버퍼 2 배. 0.2 µ m 회전 필터에 그들을 전송. 1500 x g 1 분 동안에 그들을 아래로 회전 합니다.
  5. 낮은 단백질 바인딩 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 필터 단위를 전송. 내용 2 elute 0.9% NH3 H2o.의 200 µ L x 솔루션 들을 방출 하기 전에 2 분 동안 phosphopeptides에 앉아 보자. 10와 11 사이 있어야 한다 pH를 측정 합니다.
  6. 진공 건조 하룻밤 암모니아를 증발 하 게 eluate 집중.

10. MS 분석에 대 한 pST 펩 티 드를 담

  1. 끝으로 자료를 이동 팁의 작은 팁 사이드에 부드럽게 누릅니다. 100%의 200 µ L을 추가 하 여 팁을 린스 ACN, 팁을 반전 하 고 뚜껑 쪽으로 액체를 이동 하려면 작은 끝을 터치 하 여 다음.
  2. 끝의 작은 끝을 잘라 면도날을 사용 하 여, 및 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브. 위에 그것을 배치합니다 뚜껑을 제거 하 고 나머지 ACN 밖으로 급락 micropipette 삽입. 100%의 200 µ L 가진 세척을 반복 = 뉴스. TiO2 구슬 지금 다음 단계에 대 한 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 있습니다.
  3. 100 µ g. 바인딩 용량 C-18 팁을 사용 하 여 샘플을 청소 (제조 업체의 지침을 따릅니다.)
  4. 완전히 진공 농도 의해 차입 볼륨을 건조. 이 1-2 시간 걸립니다.
  5. 질량 분석 솔루션의 12.5 µ L에 말린된 phosphopeptides resuspend (또는 연구원의 MS에 의해 권장으로 proteomics 시설 코어). 소용돌이 30에 대 한 10000 x g에서 원심 s. 2 x 잘 그들을 resuspend를 반복. (할 하지 플라스틱 아래로.)

11. 질량 분석 분석

  1. 그들의 권장된 설정을 사용 하 여 액체 크로마토그래피 탠덤 MS (LC-MS/MS)을 수행 하기 위해 MS proteomics 핵심 시설에 샘플을 제출 합니다. 설정 예는 다음과 같습니다 (요약 표 2 참조).
    1. 트랩 열에 샘플의 5 µ L 로드 (2 cm 긴 x 75 µ m 직경) 0.1%로 그들을 씻어 TFA 5 µ L/분의 유량으로 5 분.
    2. 300 nL/min의 유량과 나노 분석 열 (20 cm x 75 µ m)에 따라 트랩을 가져와.
    3. 세그먼트 선형 그라디언트 (0.16% 개미 산, 80%의 비율 0.2% 개미 산에 ACN) 평 및 pST 샘플 사이:
      1. PY 샘플에 대 일 분에 4-15%, 15-50%에서 40 분, 5 분에 50-90%의 그라디언트를 사용 하 여 그들을 elute.
      2. PST 샘플에 대 일 분에 4-15%, 15-25%에서 40 분, 44 분에서 25-50% 및 11 분에 50-90%의 그라디언트를 사용 하 여 그들을 elute.
    4. 120000 20 가장 강렬한 이온 및 동적 제외 기간 20 MS/MS (HCD, 27%의 상대 충돌 에너지)에 의해 다음의 해상도 가진 전체 검사의 주기적인 시리즈 데이터 종속 획득 모드에서 MS 데이터 s.
  2. 완료를 실행 하는 MS 후 MS 분석 소프트웨어 프로그램을 식별 하 고 계량 phosphopeptides로 MS raw 파일을 가져옵니다. (MaxQuant 소프트웨어8,,2627 이 실험에 사용 되었다. 표 3을 지정 하지 않으면 기본 설정이 사용 되었다.)

결과

이 프로토콜은 자세하게에서 단백질 추출 및 phosphopeptide 농축 및 후속 MS 분석 (그림 1) 소화 하는 방법을 설명 합니다. 모든 버퍼가이 프로토콜에 사용 되는 솔루션의 구성 표 1에 나열 됩니다. 리스-C trypsin의 순차적 활용 효율적인 소화를 제공합니다. Coomassie 스테인드 젤의 사전 소화 lysate lysate 후 소화의 얼룩 완전 한 소화 (그림 2A)을 확인 하는 동안 단백질의 존재를 확인 합니다. 완전 한 소화를 위한 아무 밴드 나타납니다 30 kDa와 리스 C 및 트립 신, 23.3 kDa 밴드를 제외 하 고 15 kDa 위에 각각. 리스-C의 추가 또한 놓친된 분열 (그림 2B)의 수를 줄입니다. PY 펩 티 드 phosphoproteome28의 2%만 나타내므로 pY 특정 항 체를 사용 하 여 평 펩 티 드의 immunoprecipitation pY 펩 티 드 농축의 첫 번째 단계입니다. 결과 상쾌한 pST 펩 티 드 농축에 대 한 입력 됩니다. PY immunoprecipitation 효과적으로 pST 펩 티 드 어디 평균 평 준비에서 식별 하는 phosphopeptides의 85%는 평 (그림 3A)와 pST 준비에서 식별 하는 phosphopeptides의 99%는 이상에서 평 펩 티 드를 분리 pST (그림 3B)입니다. 이산화 티타늄 phosphopeptides 두 준비에 대 한 풍부 하 게 하는 데 사용 됩니다. Phosphorylated 되는 MS 준비 준비에 펩 티 드의 예상된 비율 30 ~ 50% (그림 4A) 사이입니다. Phosphopeptide 농축 비율에서 가변성 거기 pST 펩 티 드 보다 많은 적은 평 펩 티 드의 결과로 평 준비에 더 있을 수 있습니다. Phosphopeptide 종에서 발견 하는 phosphopeptides의 대다수는 단일 또는 이중 phosphoryl 그룹 (그림 4B) 있다.

질량 분석을 수행한 후 MS raw 파일은 MS 분석 소프트웨어에 로드 됩니다. 실험에 사용 되는 매개 변수 설정을 표 3 에 나열 된 하지만 소프트웨어 소프트웨어 달라 집니다 그리고 버전에서 버전 다를 수 있습니다. 나열 되지 않은 매개 변수 남았다는 루즈벨트를 포함 하 여 기본적으로 1%의 컷오프 펩 티 드-스펙트럼 일치 (PSM) 수정 된 펩 티 드27의 식별을 위한 40의 최소 안드로메다 점수에 대 한. 각각 약 pY 펩 티 드의 5%와 15%와 34%의 pS 및 pT 펩 티 드, 0.75 필터 보다 큰의 지역화 가능성 컷오프 설정 (그림 5A). 이러한 필터를 적용 한 후 MS 분석의 끝에 phosphopeptide 신원의 예상된 수는 약 300 평 (시작 단백질의 5 mg)에 대 한 펩 티 드 약 7, 500 pS 펩 티 드와 640 pT 펩 티 드 (2.5 mg 시작 펩 티 드의에 대 한 금액)에서 각각 농축 준비 (그림 5B). 복제의 수와 phosphopeptide 신호 강도의 변화 통계 비교에 대 한 충분 한 전원을 결정 합니다. 4 개의 별도 실험 생물학 중복 또는 triplicates를 포함 하는 그룹으로,에서 검색 된 phosphopeptides에 대 한 변형 (%CV)의 % 계수 계산 했다. 배포판 (예를 들어, 그림 5C에 pST 그룹 1-5) 낮은 다양성의 샘플 수집, 준비, 및 질량 분석 실행 일관 했다 나타냅니다. 다른 한편으로, 배포판 (예를 들어, 태평양 표준시 그룹 6 그림 5C) 높은 가변성의 아수라장 데이터 다운스트림 차동 분석에 중요 한 차이 검출 하기 위하여 더 큰 배-변경 필요를 나타냅니다.

figure-results-2376
그림 1: 워크플로 다이어그램. 샘플에서 단백질 추출 되며 소화. 펩 티 드 고체 상 추출 (SPE)에 의해 추출 되 고 phosphotyrosine (pY) 펩 티 드 immunoprecipitated는. 동시에 phosphoserine/트레오닌 (pST) 펩 티 드 평 immunoprecipitation 단계에서 상쾌한에서 농축 됩니다. 강력한 양이온 교환 (SCX)을 줄이기 위해 이온 억제12고도로 청구 펩 티 드를 제거 하는 상쾌한에 수행 됩니다. 모두 준비 phosphopeptide 농축을 통해 이산화 티타늄 (티 오2) 받 다. 샘플 정리 후 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) phosphopeptide 풍부를 측정 하기 위해 수행 됩니다. 원시 데이터는 다음 phosphopeptides를 식별 하는 MS 분석 소프트웨어에 로드 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3141
그림 2: 소화의 평가. (A) 3 lysate 사전 소화, Lys c 조 소화의 12.5 µ g을 샘플링 하 고 후 트립 신 소화 표시 됩니다. Coomassie 젤 얼룩 테스트 리스-C와 trypsin의 순차 사용 후 깨끗 한 소화를 보여줍니다. 분자량 (MW) 크기 마커 kilodaltons (kDa)에 있습니다. (B) A 놓친된 분열에 감소 관찰 후 리스 C 프로토콜에 추가 되었습니다. 놓친된 분열 없이 phosphopeptides의 비율 증가 64 %48 %에서 60% ~ 84%에서에서 평균 평 pST 농축 준비에 대 한 각각. 리스-C 없이 수행 하는 두 개의 실험에서 얻은 데이터와 리스 c 수행 5 실험 그래프 요약 오차 막대는 38 평 그리고 (없이 리스-C) 2 별도 실험에서 38 pST 샘플 62 평 (리스-C)와 5 별도 실험에서 60 pST 샘플을 나타내는 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3: 평 및 pST phosphopeptides의 농축. 이러한 패널 pST 농축 준비 중 (A) 평 또는 (B) pSTY phosphopeptides의 비율을 표시합니다. PY immunoprecipitation와 이산화 티타늄 pY 농축 pST 농축에 phosphopeptides의 단지 0.1%는 평 85% phosphopeptides pY 펩 티 드에 대 한 되 고 결과. 이 값 (오염 물질, 역방향 시퀀스 및 지역화 및 확률 0.75 미만 phosphopeptides 필터링 후 한 대표적인 실험의 STY)Sites.txt 파일 인 검사에서 당겨 졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4: 티타늄 이산화 Phosphopeptide 농축. (A)에서 4 개의 별도 실험에서 샘플 (총 펩 티 드)를 기준으로 검색 된 phosphopeptides의 비율이 표시 됩니다. (B)이이 패널 4 별도 실험에서 모노, 이중 및 다중 phosphorylated 펩 티 드의 평균 구성을 보여줍니다. 패널 A 에서 오차 막대는 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-5097
그림 5: phosphoresidue 식별 예상. (A)이이 패널 pY 농축 (왼쪽) 및 pST 농축 (오른쪽)에서 Id의 인 산화 지역화 가능성을 보여 줍니다. > 0.75 확률 컷오프를 만족 하는 Id의 평균 비율 각각 93%, 75%와 평, pS, 및 태평양 표준시에 대 한 52% 이다. (B)는 의미와 함께 id 번호는 > 0.75 지역화 확률은 300 평에 대 한,를 위한 7500 pt 640. (C)이이 패널은 phosphopeptides의 변형 (%CV)의 % 계수의 바이올린 플롯을 표시합니다. CV %의 평가 신호 강도 값은 각 생물 복제 또는 triplicate 그룹에서 검색 된 경우에 수행 됩니다. 데이터는 4 개의 별도 실험에서 촬영 됐다. 패널 A 와 B 에서 오차 막대는 34 평에서 표준 편차와 34 pST 샘플 4 별도 실험에서 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

버퍼볼륨구성
6 M guanidinium 염화 물 세포의 용 해 버퍼50 mL6 M guanidinium 염화, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine, 40 m m chloroacetamide, 2 mM 나트륨 orthovanadate, 2.5 m m 나트륨 파이 인산, 1 m m β-glycerophosphate, 볼륨에 500 mg n-octyl-glycoside, 초 순수한 물
100 mM 나트륨 파이 인산50 mL2.23 g 나트륨 파이 인산 decahydrate, 볼륨에 매우 순수한 물
1 M β-glycerophosphate50 mL15.31 g β-glycerophosphate, 볼륨에 매우 순수한 물
5 %trifluoroacetic 산20 mL19 초 순수한 물으로 100 %trifluoroacetic 산의 1 mL을 추가
0.1 %trifluoroacetic 산250 mL245 울트라 순수 물 5 mL 5 %trifluoroacetic 산 추가
pY 차입 버퍼250 mL0.1 %trifluoroacetic 산, 40% 이기, 볼륨에 매우 순수한 물
pST 차입 버퍼250 mL0.1 %trifluoroacetic 산, 50% 이기, 볼륨에 매우 순수한 물
IP 바인딩 버퍼200 mL50 mM tris pH 7.4, 50 m m 염화 나트륨, 볼륨에 매우 순수한 물
25 m m 염화 중 탄산염, pH 7.510 mL19.7 mg 10 mL 메 마른 초 순수한 물, pH 7.5 1 N 염 산으로 분해 (~ 10-15 µ L/10 ml 해결책), 신선한 확인
1 M 인산 염 버퍼, pH 71000 mL423 mL 1 M 하이드로 인산 나트륨, 577 mL 1 M 나트륨 수소 인산 염
재래식 버퍼14 mL6.3 mL 이기, 280 µ L 5 %trifluoroacetic 산, 1740 µ L 젖 산, 초 순수한 물 5.68
Rinsing 버퍼20 mL9 mL 이기, 400 µ L 5 %trifluoroacetic 산, 10.6 초 순수한 물
질량 분석 솔루션10 mL500 µ L 이기, 200 µ L 5 %trifluoroacetic 산, 9.3 초 순수한 물
버퍼 A250 mL5mm monopotassium 인산 염 (pH 2.65), 30% 이기, 염화 칼륨 5 m m, 볼륨 울트라 순수 물
버퍼 B250 mL5mm monopotassium 인산 염 (pH 2.65), 30% 이기, 염화 칼륨 350 m m, 볼륨에 매우 순수한 물
0.9% 수산화 암모늄10 mL300 μ 29.42% 수산화 암모늄, 9.7 초 순수한 물

표 1: 버퍼 및 솔루션. 이 표에서 버퍼가이 프로토콜에 사용 되는 솔루션의 작곡을 보여 줍니다.

LC-MS/MS 설정
매개 변수pY 설정태평양 표준시 설정
로드 (µ L) 샘플5
로드 유량 (µ L/분)5
그라데이션 유량 (nL/분)300
선형 그라데이션 (백분율 0.16% 개미 산, 80% 0.2% 개미 산 = 뉴스)4-5 분 동안 15%4-30 분 동안 15%
15-40 분 50%15-40 분 25%
50-5 분 동안 90%25-44 분 50%
50-11 분 90%
완전 한 스캔 해상도120000
선택 하는 가장 강렬한 이온의 수20
상대 충돌 에너지 (%) (HCD)27
동적 제외 (s)20

표 2: LC-MS 설정. 이 일반 샷건 phosphoproteomic 실험에서 LC MS 설정의 예입니다. 샘플은 트랩의 열에 로드 되었습니다. 트랩 분석 열이 있는 라인에 오게 됐다. 이러한 설정은 LC-MS 시스템에 테이블의 재료 및 시 약을사용 하 여 최적화 했다. 이러한 설정은 다른 LC-MS 시스템 조정 해야 합니다.

MaxQuant 매개 변수 설정
설정액션
그룹-특정 매개 변수
유형유형표준 선택
다중성1로 설정
소화 모드효소트립 신/P 선택
최대입니다. 놓친된 분열2로 설정
수정변수 수정인 (촌) 추가
레이블 없는 정량화레이블 없는 정량화LFQ 선택
LFQ 분 비율 수1로 설정
빠른 LFQ확인
기타다시 계량확인
글로벌 매개 변수
시퀀스FASTA 파일UniProt에서 다운로드 선택 fasta 파일
고정된 수정Carbamidomethyl (C) 추가
부. 식별실행 사이의 일치확인
경기 시간 창5 분으로 설정
맞춤 시간을 창20 분으로 설정
알 수 없는 일치확인
단백질 정량화분 비율 수1로 설정
폴더 위치적절 하 게 수정

표 3: MS 분석 소프트웨어 설정. MaxQuant에이 테이블에 그룹 및 글로벌 매개 변수 선정 또는 조정. 다른 모든 매개 변수는 기본에 남아 있었다. 이 실험은 버전 1.5.3.30을 사용 하 여 실시 했다. 매개 변수는 버전에서 버전 및 소프트웨어 소프트웨어에서 달라질 수 있습니다.

토론

Phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게이 프로토콜을 활용 하 여, 전에 실험 디자인의 신중이 중요 합니다. 생물 복제를 사용 하 여 기술 복제 보다 질량 분석 자원의 경제적인 사용이 이다. 필요한 복제 수 부분에 데이터의 변화에 따라 달라 집니다. 최근 연구, 식별 수 증가 간신히 3 넘어 복제의 수를 증가 하는 동안 더 많은 그룹 증가 사이 중요 한 식별 번호10복제 증명.

셀에 phosphoproteins의 더 낮은 풍부 때문 충분 한 시작 단백질 양을 검색 모드에서 전립선 암 샘플에서 글로벌 phosphoproteome를 얻을 필요가 있습니다. 이 실험에서 단백질의 5 mg이 사용 되었다. 셀의 약 5 거의 confluent 15 cm 요리는 비록이 셀 라인-종속 될 것입니다 충분 한 단백질이이 프로토콜에 대 한 입력으로 제공 합니다. 종양 조직에 관해서는 단백질의 예상된 수익률 조직 무게의 약 6-8%입니다. 체 외에서 환경에서 고려해 야 할 긍정적인 컨트롤 샘플 셀을 수확 하기 전에 30 분 동안 1 m m 바의 추가 이다. 바, 경쟁력 있는 단백질 phosphotyrosyl 인산 가수분해 효소 억제 물, pY 펩 티 드 식별29의 수를 증가 하는 따라서 티로신 인 산화를 유지 됩니다.

깨끗 한 소화 phosphopeptide 식별을 극대화 하기 위해 중요 한 단계 이다. Coomassie 얼룩 테스트 외에도 데이터에서 누락된 분열의 % 소화 효율 (그림 2)를 평가 하 사용할 수 있습니다. 품질 관리 소프트웨어는 사용할 수 있는 놓친된 분열 및 MS 데이터 품질30를 평가 하기 위해 다른 통계 분석. Trypsin은 가장 일반적인, 다른 프로 테아 제를 사용할 수 있습니다 하는 동안 주소 범위 격차는 프로테옴 최적의 tryptic 펩 티 드 수 없습니다5 31생성. MS 분석 소프트웨어의 설정 다음 프로 테아 제에 변화 조정에 따라 수정 해야 합니다.

프로토콜 (pY 농축)에 대 한 immunoprecipitation를 사용 하 여 phosphopeptides에 대 한 풍부 하 게 이산화 티타늄 (티 오2) 뿐만 아니라. 펩 티 드에 대 한 풍부 하 게 대체 방법이 포함 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 금속 산화물 친화성 크로마토그래피 (MOAC) 수산화 알루미늄 등 금속 이온 폴리머 기반 선호도 캡처 (PolyMAC) 에 대 한 다른 금속 산화물 5,12. 이전 연구 결과 다른 농축 방법 phosphopeptides32의 다른 인구에 대 한 풍부 하 게 나타났습니다. 예를 들어, IMAC MOAC 선호 모노 phosphorylated 펩 티 드33풍요롭게 하는 동안 더 많은 멀티 phosphorylated 펩 티 드를 풍요롭게. 이 프로토콜의 대표 결과 반영이 관찰 (그림 4B). 최근 게시는 아이맥과 MOAC 하이브리드 소재를 사용 하 여 잠재적으로 제공할 수 phosphopeptide 종34의 더 큰 범위를 시연 했다. 따라서,이 프로토콜 훨씬 더 포괄적인 phosphoproteomic 분석에 대 한 허용 하는 동시에 다른 농축 방법을 활용 하 수정 될 수 있습니다.

MaxQuant26 소프트웨어 제품군은이 프로토콜에서 MS 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다 하지만 상용 응용35 phosphopeptide 식별 및 정량화에 대 한 사용할 수 있습니다. Phosphopeptide 식별에 대 한 지역화 가능성 차단 적용 됩니다. 이 필터는 phosphoresidue 식별10,28에서 높은 신뢰를 (즉, 0.75 보다 큰)와 phosphopeptides에 대 한 선택 하려면 수행 됩니다. 즉, 인 그룹에 포함 될 수 있는 다른 모든 잔류물의 총계 확률 0.25 보다 작습니다. 이 구분 phosphopeptide 선택의 엄중을 증가 하기 위하여 올려질 수 있습니다. 식별 번호에 관한 평 펩 티 드의 예상된 번호는 수백에 높은 수천에 pST 펩 티 드의 예상된 번호는입니다. 이 값에 약 2%, 12%와 86%는 phosphosites의 있는 평, pT, 및 pS, 각각28이전 관찰된 phosphoproteome 배포 반영.

병렬로 평 및 pST 농축 단계를 수행 하는 경우 6 일에서 프로토콜에 샘플 준비 단계를 완료할 수 있습니다. MS의 강력한 도구와 함께 함으로써,이 같은 phosphopeptide 농축 프로토콜 그들의 각 연구 분야에 phosphoproteome를 분석 하는 데이터를 수집 하는 과학자를 위한 글로벌 접근 방식을 제공 합니다.

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리가 원고에 조언과 입력을 제공 하기 위한 드레이 크 연구소의 회원을 감사 합니다. 우리는 또한 조언을 제공 하 고 우리의 샘플에 질량 분석을 수행할 생물 질량 분석 시설의 로버트 우드 존슨 의과대학과는 주립 대학 뉴저지의 럿 거 스의 회원을 감사 합니다. 래리 C. 쳉에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 보너스 번호 T32 GM008339에서 국립 보건원의 지원 됩니다. 토마스 G. Graeber NCI/NIH (포자 전립선 암 P50 CA092131;에 의해 지원 됩니다. P01 CA168585)와 미국 암 사회 연구 학술 상 (RSG-12-257-01-TBE). 저스틴 M. 드레이크는 부의 방어 전립선 암 연구 프로그램 W81XWH-15-1-0236, 전립선 암 재단 영 조사 상, 뉴저지 건강 재단, 그리고는 Rutgers에서 정밀 의학 이니셔티브 파일럿 수상에 의해 지원 됩니다. 뉴저지 암 연구소입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ultra-Low Temperature FreezerPanasonicMDF-U76V
Freezer -20 °CVWRscpmf-2020
Swing rotor bucketThermoFisher Scientific75004377
Vacuum manifoldRestek26080
LyophilizerLabconco7420020
CentriVap Benchtop Vacuum ConcentratorLabconco7810010
End-over-end rotatorThermoFisher Scientific415110Q
Razor bladeFisher Scientific620177
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsMillipore SigmaUFC901024
Glass culture tubesFisher Scientific14-961-26
ParafilmFisher Scientific13-374-12
20G needleBDB305175
KimwipesFisher Scientific06-666A
Screw cap cryotubeThermoFisher Scientific379189
Nunc 15 mL conical tubesThermoFisher Scientific12-565-268
Gel loading tipsFisher Scientific02-707-181
Millipore 0.2 µm spin filterMillipore SigmaUFC30GVNB
Low protein-binding Eppendorf tubesEppendorf22431081
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10Millipore Sigma16101
27B10.4 antibodyCytoskeletonAPY03-beads
Peptide assay kitThermo Scientific23275Step 7
TopTipPolyLC IncTT200TIO.96Steps 5 and 9
SCX columns (PolySULFOETHYL A)PolyLC IncSPESE1203
3 mL syringeBD309657
Trifluoracetic Acid (TFA)Fisher ScientificPI-28904
Acetonitrile (ACN)Fisher ScientificA21-1
Lactic acid Sigma-Aldrich69785-250ML
Ammonium HydroxideFisher ScientificA669S-500
Potassium Phosphate MonobasicFisher ScientificBP362-500
Potassium ChlorideFisher ScientificBP366-500
Calcium Chloride DihydrateFisher ScientificBP510-500
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypsin, TPCK TreatedWorthington BiochemicalsLS003740
Lysyl EndopeptidaseWako Pure Chemical Industries, Ltd.125-05061
MonoTipPolyLC IncTT200TIO.96Step 10
ZipTipMilliporeSigmaZTC18S096Step 6
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cmWaters186008794Step 11: analytical column
Acclaim PepMap 100 C18 LC ColumnsThermoFisher Scientific164535Step 11: trap column
Ultimate 3000 RLSCnano SystemDionexULTIM3000RSLCNANOStep 11
Q Exactive HFThermoFisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZStep 11
MilliQ waterdeionized water used to prepare all solutions and bufferes
Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120sonicator
Polytron System PTKinematica AGPT 10-35 GThomogenizer

참고문헌

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