튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

요약

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

초록

인간 유전 변이의 정량 분석은 심각한 의료 조건, 종양 등의 분자 특성을 이해 하는 데 중요 합니다. 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) DNA 복사 번호 이체의 정확한 정량화를 사용 하기 때문에 그들은 약물 내성 돌연변이 등 희귀 유전자 변이 검출을 위한 필수적인 도구가 되고있다. 그것은 것으로 예상 된다 디지털 PCR (dPCR)를 사용 하 여 분자 진단 임상 연습에서 사용할 수 있는 가까운 미래에; 따라서, 인간의 유전 물질과 dPCR를 효율적으로 수행 하는 방법 뜨거운 주제가입니다. 여기, 용 대 대장균 (APC) 신체적인 mosaicism 8 dPCR 반응을 동시에 실시 될 수 있는 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 검색 하는 방법을 소개 합니다. 채우고는 및 밀봉 칩에 반응 혼합물 때 주의 해야 합니다. 이 문서에서는 오버 및 긍정적인 파티션의 과소를 방지 하는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리는 특정 증폭을 확인 하는 데 사용 될 수 있는 칩에는 파티션에서 dPCR 제품을 수집 하기 위한 간단한 절차를 제시. 우리는이 방법을 보고서는 dPCR 유전자 연구에서 칩--튜브 방법으로 홍보 도움이 될 것입니다 바랍니다.

서문

정량 PCR (정량) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs)를 포함 한 인간의 유전 변이 그리고 DNA 복사 번호 유사 (CNVs) 척도를 자주 사용 됩니다. 정량, 중 합 효소 반응 기존의 끝점 PCR에서 같은 방식으로 각 튜브에서 수행 됩니다 그리고 모든 열 주기 후 튜브에서 증폭 신호 획득. 대조적으로,이 보고서에 끝점 dPCR를 의미 하는 dPCR에 PCR 혼합에 로드 많은 현미경 챔버, 파티션 되 나, DNA 템플릿은 제시 또는 제한 희석 및 모든 파티션에 포함 된 PCR 혼합으로 평가에 결 석 음수 또는 완전 한 PCR 후 긍정적인. 부정적인 파티션에 있는 DNA는 서식 파일이 없습니다는 추정 하기 쉬운 반면, 그것 아니다 분명 DNA 서식 파일의 복사본은 긍정적인 파티션에 존재. 따라서, 긍정적인 파티션 서식 파일 DNA의 수는 부정적인 파티션¹에서 수 포아송 분포에 따라 견적입니다. dPCR는 더 비싼 및 정량에 비해 작은 동적 범위는 하지만이 메서드는 절대 정량화를 가능 하 게 제공 하는 높은 감도 및 더 큰 정밀².

DPCR의 주요 응용 프로그램 중 하나입니다 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 식별 된 이체의 유효성 검사. 희소 한 이체, 의미 낮은 변형 분수의 경우 특히 유효성 검사는 NGS³에서 발생할 수 있는 시퀀싱 오류로 인해 중요 합니다. 동안 생어 시퀀싱 및 정량 SNVs 및 CNVs의 유효성 검사에 대 한 유용한 도구, 그들의 감도 dPCR에 비해 낮은. 따라서, dPCR 기술은 드문 이체 처리 하는 유전자 연구에 대 한 수요 이다. 최근, 약물 저항 같은 암 특성에 관련 된 드문 이체의 액체 생 검에 의해 감지 분자 진단 및 치료⁴에 화제가 되고있다. DPCR 기술 액체 생 검 연구에 적합 나타나고 개선 동적 범위와 관련 된 고 비용 구현 될 필요는 가까운 장래에, 중요 한 임상 응용을가지고 것으로 예상 된다.

상업적으로 사용할 수 있는 dPCR 기술은 드롭릿 및 칩 기반 플랫폼;으로 대략 분류 될 수 있다 차이점은 어떻게 DNA 템플렛은 분할 된^5,,67. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 PCR 혼합 칩에 분할으로 모 세관 작용에 의해 배포 됩니다. 칩 내장 8 튜브 스트립,는 많은 실험실 직원은 이미 잘 알고 있을 것입니다, 그리고, 따라서, 8 개의 샘플 한 시간⁸에 대우 될 수 있다. 읽기 단계에서 < 96 샘플 칩 및 아니라 각 분할의 전체 이미지를 감지 하 여 치료를 1 시간 걸립니다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR는 다른 dPCR 시스템에 비해 높은 처리량, 이후 성과 생산성은 사용자를 위한 주요 장점이 있습니다.

이 보고서에서 산발적 인 가족 용 대 환자의 APC 유전자의 신체적인 mosaicism 대표적인 경우로 사용 되 고 dPCR 그리고 NGS의 결과 비교. 이 보고서의 주요 목적은 명확 하 게 계량 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 단일 뉴클레오티드 변종 이다. 우리는이 보고서가 채택 하는 그들의 자신의 일에 대 한 dPCR 플랫폼에 관심 있는 연구원을 위한 도움이 바랍니다.

프로토콜

연구 설계는 하 마마 츠 대학의과 대학 (G-260-4)의 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 환자와 그의 부모에서 얻은 했다.

1입니다. 품질 관리 Genomic DNA의

참고: 게놈 DNA (gDNA) 확고 실리 카 멤브레인 기반 DNA 정화 방법을 사용 하 여 말 초 혈액에서 추출 되었다. 사전에 아래 절차, gDNA의 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 했다.

1. 10-100 ng / µ L의 농도에서 gDNA 샘플을 준비 합니다.
2. 8-튜브 스트립 10 µ L의 DNA 견본 버퍼를 추가 합니다.
3. 튜브를 DNA 사다리 또는 gDNA 1 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 1 분 미 판 첨부 파일을 사용 하 여 혼합.
4. 튜브 로드에 전기 이동 법에 젤 장치와 피 펫 팁 (테이블의 재료)를 계측 하 고 '시작' 버튼을 눌러 실행을 시작 합니다.
   참고: 전기 영동 시스템 시작 버튼 클릭 한 번으로 자동으로 작동 합니다.
5. DNA 샘플 버퍼에 포함 된 낮은 마커는 electropherograms에 올바르게 할당 되어 있는지 확인 합니다. 하지 할당 올바르게 수동으로 'Electroherogram 모드'에서 소프트웨어의 마커를 할당 합니다.
   참고: DNA 무결성 번호 (DIN) 자동으로 계산 됩니다. DIN 값 DNA 무결성에서 온다. 높고 낮은 소음 값 매우 온전 하 고 강하게 저하 gDNA를 각각 나타냅니다.
6. 자동으로 gDNA (> 200 bp)의 농도 계산 하는 소프트웨어의 '지역 모드'에서 gDNA (> 200 bp)의 크기 영역을 지정 합니다.

2. 뇌관 및 프로브 설계

1. 다음과 같은 조건에서 개방형 액세스 도구를 사용 하 여 용융 온도 (T_m) 값 계산: 10-25 기초, 50mm 나⁺/K⁺, 0.80 mM dNTPs, 및 3 m m Mg^{2 +} (자료 테이블). 증폭 T_m 가치 약 60 ° C와 100-300 bp에 amplicon 길이 대상 대립 유전자를 포함 하는 게놈 지역에 앞으로 역 뇌관 디자인.
   참고: oligonucleotides의 농도 표 1 을 참조 하십시오.
2. 다음 조건에 따라 잠긴된 핵 산 (LNA) 참조 및 변형 대립 유전자에 대 한 조사 디자인: (i) 1-6 Lna는 각 프로브; (ii)는 형광 염료와는 끄는 5'에 있는지-그리고 3'-종점 각 프로브의 각각; (iii) 일치 하 고 일치 하지 않는 프로브 T_m 값 사이의 차이 > 10 ° C; (일치 하 고 일치 하지 않는 프로브 iv) T_m 값은 높고, 뇌관의 보다 낮은 각각 [예를 들어, 앞으로 뇌관: 60.8 ° C, 역방향 뇌관: 59.8 ° C, 참조 대립 유전자 프로브 (일치/불일치): 62.6/45.3 ° C, 변형 대립 유전자 프로브 (일치/불일치): 61.7/50.5 ° C]. T_m 값 또한 단계 2.1에 사용 되는 오픈 액세스 도구를 사용 하 여 계산 했다.
3. 설계 뇌관 및 프로브 > 0.1% [예를 들어, 단일 염기 다형성 데이터베이스 (dbSNP)] 데이터베이스에서 결정의 주파수를 가진 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 포함 하지 않는 확인 하십시오.

3. 디지털 PCR

1. 뇌관, 프로브, 그리고 테 버퍼와 함께 표 1 에 설명 된 농도에서 gDNA 재고 솔루션을 준비 하 고-20에서 그들을 저장-4 ° c.
2. 표 1에 설명 된 대로 최종 농도에 15 µ L의 전체 볼륨에 실 온에서 시 약을 혼합.
   1. No-템플릿 컨트롤 (NTC)에 gDNA 대신 증류수 3 µ L를 추가 합니다.
   2. 3.5 x pipetting 오류에 대 한 계정에 3 중에서 PCR 혼합물의 금액을 준비 합니다.
3. PCR 혼합물을 아래로 그것을 혼합 플라스틱
4. 8-튜브 스트립에 내장 된 칩에 로딩 플랫폼을 설정 하 고 오토로더에서 그들을 설정 합니다. 칩 및 로딩 플랫폼 사이의 연락처를 확인 합니다.
5. 로드 슬라이더는 플랫폼에 맞는 로더의 스 토퍼와 슬라이더를 누르고 있습니다.
6. (그림 1A) 슬라이더의 끝 근처 플랫폼에 PCR 혼합물의 15 µ L 플라스틱
7. (약 1 분)에 대 한 로더 버튼을 누르면 로더를 실행 합니다.
   참고: 아니다 문제가 경우 적은 양의 PCR 혼합 플랫폼에 남아. 그것은 순차적으로 로더를 다시 실행할 수 있습니다.
8. 칩-에-한-튜브 씰링 증강의 측면 슬롯에 PCR 혼합으로 가득 설정 합니다. 하지 휴식 칩 (그림 1B)를 슬라이드 뚜껑과 최고 뚜껑의 가장자리를 밀어.
9. 씰링 증강 (대략 2 분)을 실행 합니다. 불완전 한 씰링 긍정적인 신호 (그림 1C 및 1d)의 교차 오염 때문에 액체의 웅덩이 여전히 표시 되어 순차적으로 1 분 동안 봉인 증강을 다시 실행 합니다.
10. 석유 기반 시 약, 관에 유체 씰링의 230 µ L를 추가 합니다.
    참고: 칩 지금 액체에 몰두 한다.
11. 열 cycler에 튜브를 설정 합니다. (약 2 시간)에 대 한 표 2 에 설명 된 대로 열 cycler를 실행 합니다. 긍정적인 파티션 (그림 1E)의 고르지 못한 배급 경우 온도 또는 PCR의 기간을 조정 합니다.
    참고: 그것은 설정 것이 좋습니다 램프 속도 약 1 ° C/s.
12. 초기 소음을 줄이기 위해 적어도 15 분 동안 열 cycler에 튜브를 둡니다.
    참고: 튜브 남겨질 수 있습니다 하룻밤 뿐만. 형광 신호도 다음 날 발견 했다.
13. 탐지 지에 튜브를 설정 하 고는 지 그에 6 mL 증류수를 부 어. 공기 방울 튜브 내외에 표시 되는 경우 (그림 1 층 및 1 G) 선택을 취소 합니다.
14. 검출기에는 지 그를 로드 하 고 Fluorescene, 실험 및 샘플/NTC 탭 (자료 테이블)의 선택 후 소프트웨어의 '실행' 버튼 클릭으로 실행 합니다.
    참고: 기본 강도 8 샘플의 이중 컬러 감지 약 4-5 분 걸립니다.
15. 위치 그림, 히스토그램 및 2D 점도 확인 합니다.
    참고: iIf 부정적인의 형광 강도 높은, 30-70의 범위 내에서 떨어지는 소프트웨어의 설정 버튼 클릭으로 강도 조정.
16. 다음 수식을 사용 하 여 variant 대립 유전자 분수 (VAF) 계산.
    
    여기, 이력서 및 Cr에는 variant 및 참조 대립 유전자의 복사본 수를은 하는 것이 각각입니다.
    참고: 그들은 푸아송 통계 소프트웨어 프로그램에서 자동으로 계산 됩니다.

4입니다. PCR 제품의 수집

1. 튜브에서 유체 씰링을 제거 합니다.
2. 튜브를 100 µ L의 TE 버퍼를 추가 합니다. 30 s 그리고 짧게 원심 분리기 튜브에 대 한 적극적으로 소용돌이.
3. 테 솔루션 다른 튜브에 전송 하 고 30 µ L 3 M 나트륨 아세테이트, 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.
4. 하룻밤-20 ° C에서 솔루션을 냉각 한다.
5. 16000 x g 에서 30 분에 대 한 솔루션을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
6. 튜브와 소용돌이를 80% 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.
7. 16000 x g 에서 15 분에 대 한 솔루션을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 5 분 동안 건조 하 침전을 수 있습니다.
8. 1-5 µ L의 TE 버퍼에 침전 공기 후 해산.
9. 필요한 경우, 1 단계에 관하여 전기 악기를 사용 하 여 제품 크기를 평가 합니다. 높은 감도 (자료 테이블)에 대 한 젤 장치 솔루션의 1 µ L을 로드 합니다.

결과

우리는 위에서 설명한 절차에 따라 산발적 인 가족 용 대 환자의 APC 유전자의 신체적인 mosaicism 검토. 이전 연구, APC c.834 + 2T > 생어를 사용 하 여 그들의 부모에는 환자만 C 돌연변이 발견 시퀀싱 및 NGS⁹. 뇌관의 대표적인 결과에 사용 하는 프로브 디자인은 표 3에 표시 됩니다. 게놈 DNA는 proband, 부모, 그리고 6 명의 건강 한 기증자의 혈액에서 추출 되었다. 6.7-7.9 (그림 2 및 표 4)에 9 gDNA 샘플의 DIN 값입니다. 식구 들과 16 진수 사용 되었다 형광 염료로 C와 T 대립 유전자에 대 한 각각. 위치 플롯에 녹색과 노란색 점이 각각 팸 양수와 16 진수-긍정적인 파티션을 나타냅니다 (그림 3A). 블루 관광 명소 팸와 16 진수에 대 한 부정적인 파티션을 나타냅니다. 검은 배경 반응 혼합물 추가 되지 않은 파티션에 해당 합니다. 동안 몇 가지 긍정적인 파티션을 C 대립 유전자의 proband의 아버지 나 NTC에 검색 된, T의 후자, 긍정적인 파티션에 대립 유전자 검색 되지 했다 많은 긍정적인 파티션은 C와 T 대립 유전자의 proband에서 발견 했다. C와 T 대립 유전자 사이 신호 분리 2 차원 (2 차원) scatterplot에 명확 했다 그리고 16 진수와 식구 들의 가장 긍정적인 신호 (그림 3B) 서로 독점 했다. proband의 VAF는 13.2%, 비슷한 NGS (12.7%)를 사용 하 여 결정 (표 4)입니다. Proband의 부모와 건강 한 기증자의 VAFs < 0.1%는 이었다. APC c.834 + 2T에 대 한 검출 한계 > C 돌연변이 총 gDNA¹⁰의 10-11 ng와 반복된 측정에 대 한 표준 편차 x 3를 사용 하 여 0.3% 이기 위하여 견적 되었다.

APC c.834 + 2T에 대 한 dPCR 분석 결과 amplicon 크기 > C 123 이기 위하여 예언 되었다 bp. 확인 하 고 dPCR 제품 단일 밴드로 증폭 되었다, dPCR 제품 assayed 칩에서 수집 되었다. 전기 이동 법을 사용 하 여, 단일 밴드 감지 명확 하 게, 그리고 제품 크기 예측 (그림 4)와 일치 했다.

그림 1 : 포인트 칩에서 튜브 형식으로 dPCR 분석 결과 대 한 참고를. (A)이이 패널 오토로더에서 8 튜브 스트립을 설정 하는 방법을 보여 줍니다. (B)이이 패널 깨진된 칩을 보여줍니다. (C)이이 패널 칩 표면 (i) 후 로딩 및 (ii) 씰링 방법을 보여 줍니다. (3) 액체의 웅덩이 불완전 한 봉인 경우 표시 됩니다. (D)이이 패널 교차 오염을 경우 위치 플롯을 표시합니다. (E)이이 패널 고르지 않은 분포의 경우 위치 플롯을 표시합니다. (F)이이 패널 쇼 어떻게 물 튜브 표면에 거품 공기. (G)이이 패널 튜브 내 기포를 보여줍니다. 전체 그림을 통해 흑인과 백인 화살촉 깨진된 칩 조각 나타내고 기포, 각각 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 혈액 gDNA의 대표 electropherograms. 6.7와 7.9로 DIN 혈액 gDNA의 Electropherograms는 각각 상단 및 하단 패널에 표시 됩니다. 별표는 낮은 마커를 나타냅니다. DIN: DNA 무결성 번호입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 칩에 튜브 형식으로 dPCR를 사용 하 여 APC 신체적인 mosaicism의 대표적인 결과. (A) 위치 플롯 및 없음-템플릿 컨트롤 (NTC), proband, 그리고 아버지의 (B) scatterplots 여기에 표시 됩니다. 16 진수 및 팸 참조 및 변형 대립 유전자에 각각 해당합니다. 수직 및 수평 라인 각각 16 진수 및 팸 농도의 임계값을 나타냅니다. 이 그림 Kahyo 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. ¹⁰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : Assayed 칩에서 dPCR 제품의 컬렉션. 수집 및 집중 dPCR 제품 전기 이동 법을 복종 되었다. 예측된 대상 크기는 123 혈압. 이 그림 Kahyo 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. ¹⁰. NTC: 없음 템플릿 컨트롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 약	농도 재고 솔루션의	볼륨 (μ)	최종 농도	권장 최종 농도
증류수 DNase/RNase-무료	-	1.75	-	-
PCR 마스터 믹스 x 2	-	7.5	-	-
LNA 주요 대립 유전자에 대 한 조사	2 Μ M	0.5	66.7 nM	3.33-100 nM
LNA 사소한 대립 유전자에 대 한 조사	2 Μ M	0.5	66.7 nM	3.33-100 nM
앞으로 뇌관	1 Μ M	0.5	33.3 nM	3.33-50.0 nM
반전 뇌관	1 Μ M	0.5	33.3 nM	3.33-50.0 nM
dPCR 솔루션 x 20	-	0.75	-	-
gDNA	3.33 ng/μ	3	666 pg/μ	20 세/μ-2000 pg/μ1

표 1: dPCR 분석 결과 대 한 사용 하는 시 약. ¹ 예상된 정밀도 및 감도에 따라.

단계	온도	시간	사이클
초기 변성	95 ° C	5 m	1
변성 어 닐 링 및 확장	95 ° C 58 ° C	50 s 90 s	42
마지막 확장	70 ° C	5 m	1

표 2: 열 cycler 조건입니다.

이름	시퀀스1	Tm 값2
앞으로 뇌관	5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3	60.8 ° C
반전 뇌관	5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3	59.8 ° C
LNA T 대립 유전자에 대 한 조사	5'-16 진수-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3'	일치: 62.6 ° C 일치 하지 않는: 45.3 ° C
LNA C 대립 유전자에 대 한 조사	5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3'	일치: 61.7 ° C 일치 하지 않는: 50.5 ° C

표 3: 뇌관 및 프로브 디자인. ¹ 밑줄 및 괄호 문자가 각각 LNA 및 대상된 변형입니다. ² 프로토콜의 2 단계에 따라 계산합니다.

				NGS3	dPCR4
샘플1	조직	입력 DNA (ng)	DIN2	VAF (%)	변형 (복사본)	참조 (복사본)	VAF (%)
							평균	RSD
NTC	-	-	-	-	1.23	0	N/A	N/A
Proband	혈액	11.3	7.6	12.7	379	2.48 x 103	13.2	0.0353
아버지	혈액	10.3	7.7	0.0167	1.08	3.42 x 103	0.0341	0.439
어머니	혈액	10.8	7.6	0.0136	0.956	3.04 x 103	0.0313	0.637
기증자-1	혈액	11.7	7.3	-	1.64	3.01 x 103	0.0543	0.414
기증자-2	혈액	10.5	7.6	-	1.06	2.90 x 103	0.0406	0.539
기증자-3	혈액	17.6	7.9	-	4.24	5.65 x 103	0.0713	0.783
기증자-4	혈액	12.3	7.6	-	2.38	4.16 x 103	0.0666	0.557
기증자-5	혈액	19.2	7	-	1.48	6.79 x 103	0.0213	0.571
기증자-6	혈액	14.4	6.7	-	3.44	4.67 x 103	0.0728	0.729

표 4:에 대 한 시험의 결과 dPCR의 APC 신체적인 mosaicism. ¹ NTC: 없음 템플릿 컨트롤; 기증자: 건강 한 기증자입니다. ² DIN: DNA 무결성 번호입니다. ³ 이와 이즈미 외. ⁹, 흠 게놈 var. 2 15057 (2015). ⁴ 실험 triplicate와 독립적으로 반복 3 x; 실행 했다 데이터; 평균 값으로 표현 됩니다. RSD: 상대 표준 편차; N/A: 해당 없음. Kahyo 그 외 여러분 에서 테이블 수정 되었습니다. ¹⁰.

토론

DIN 값은 gDNA의 고급 저하 낮은 품질 데이터에 발생할 수 있습니다 때문에 정량화 또는 시퀀싱 하기 전에 손상 된 DNA (예를 들면, 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 조직 으로부터 gDNA)을 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. DIN 평가, 따라서 되고있다 인간 gDNA¹¹의 품질 관리에 중요 한 단계. 대표적인 실험에 사용 된 gDNA 혈액에서 자사의 추출 후 4-11 년 4 ° C에서 저장 했다, 이후 DIN 값 dPCR 분석 결과 전에 품질 관리에 대 한 결정 했다. 이 단계는 특히 좋습니다 자료 손상 된 것으로 의심 되는 경우. GDNA의 농도 또한 전기 이동 법에 의해 결정 되었다. DPCR의 동적 범위를 없기 때문에 정량의 제한 때문에 관해서는 넓은 gDNA 농도의 측정 성공적인 dPCR 분석 결과 대 한 중요 한 단계 이다. DNA dPCR 분석 결과에서 변형 및 참조 대립 유전자의 총 복사본 수 상관은 입력 금액으로 (R-제곱 = 0.935; 표 4), 전기 이동 법은 dPCR 분석 결과 전에 gDNA 농도 측정 하는 데 유용 합니다.

로드 및 프로세스를 씰링 성공적 결과 대 한 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 플랫폼에 PCR 혼합물의 적절 한 설치를 확인 하 여 칩과 플랫폼 (그림 1A) 사이의 접촉 되도록 중요 합니다. 슬라이더에서 PCR 혼합물의 돌출 칩. 에 잘못 된 메일을 발생할 수 있습니다. 위치에 긍정적이 고 부정적인 파티션의 분포를 확인 하는 것은 DNA 템플렛은 임의로 챔버¹분할 포아송 통계에서 가정 때문에 정확한 분석을 위해 필요한 또한. 대표 결과에 긍정적인 파티션은 칩 (그림 3)를 통해 배포 했다. 이 결과 포아송 통계에 대 한 요구 사항을 충족 하 고 로드 하 고 절차를 밀봉 했다 효과적인 반영 합니다. 씰링 증강에 튜브를 설정할 경우 칩 수 깨진 최고 뚜껑의 중앙 부분을 너무 강하게 누르면 (그림 1B). 이 방지 하려면 최고 뚜껑의 가장자리를 밀어 부드럽게. 긍정적인 파티션 (그림 1의D)의 인공 클러스터 경우 복사본 수 파티션 사이 교차 오염 때문과 대 수 있습니다. 액체의 물 웅덩이 표면 (그림 1C)에 표시 되 면 봉인 절차 개선 되어야 합니다 (예:순차적으로 1 분 동안 봉인 증강을 다시 실행 하 여). 긍정적인 파티션 (그림 1E)의 고르지 못한 배급이 있는 경우에, 복사 수 부족 증폭 또는 씰링 액체 및 물 오염 과소평가 될 수 있습니다. 이 경우 [예를들면, 온도 또는 PCR (단계 3.11 프로토콜)의 기간을 조정 또는 씰링 액체와 지 그에 부 어 물이 깨끗 하 여] PCR 상태를 조정 한다. 형광 신호는 증류수에 8 튜브 스트립에서 검색 됩니다. 기포 관 표면에 준수, 신호 검출 (그림 1 층) 방해할 수 가능성이 있다. 따라서, 거품이 미세 피 펫 팁 등의 도구를 사용 하 여 허가 한다. 또한, 지 그 (그림 1G)에 설정 하는 경우 튜브 안에 공기 방울 형태 수도 있습니다. 튜브 내부 거품 칩을 충당 하기 위해 충분히 큰 경우에, 그들은 삭제도 한다. 그들은 실 온에서 몇 분 동안 남아 거품 수 있습니다 선택을 취소 합니다.

일부 긍정적인 파티션은 NTC에서 검출 될 수 있습니다. DNA 템플렛의 오염을 방지 하려면 벤치 깨끗 한 유지 하 고 만약에 가능 하다 면, 팬 필터 유닛와 깨끗 한 공간을 만들. DNA 템플렛의 오염이 의심 되 면 철저 하 게 공간 청소 및/또는 사용된 시 약을 삭제. 대조적으로, 참조 대립 유전자의 긍정적인 파티션을 gDNA 존재 검색 되지 않습니다 경우 gDNA, 뇌관, 및 프로브 농도 재확인. 특히, 뇌관은 기존 PCR (표 1)¹²에 비해 대표적인 실험에서 낮은 농도에서 사용 되었다. 그것은 또한 기존의 PCR에 변경 거의 경사로 속도 확인 하는 중요 한입니다.

DPCR 칩에서 튜브 형식으로 고유 하 게 보편적인 8 튜브 스트립^8,13안에 PCR 혼합물의 분할 이다. PCR 튜브로 분할 챔버의 이동이이 시스템에서 필요 하지 않습니다 따라서 오염 위험을 감소. 거기에 또한 이점을 칩에 튜브 형식; dPCR 시스템 그것은 적어도 5 h 드롭릿 기반 dPCR¹⁴에 분석 실험의 동일한 수를 완료 하는 동안 해당 dPCR 시스템에서 96 분석 완료 < 4 h 걸립니다. 또한, 범용 8 튜브 스트립 다른 칩 기반 dPCR¹⁵, 평면 블록 열 cycler는 달리 기존의 열 cycler의 사용을 수 있습니다. 또한, 축적 된 지식과 기존의 PCR 위한 시 약 dPCR 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 dPCR의 애플 리 케이 션을 확장에 대 한 도움이 될 것입니다.

그 dPCR는 몇 가지 제한이 주목 한다. 칩에 튜브 형식으로 dPCR에 칩의 파티션 번호 다른 dPCR 플랫폼에 비해 상대적으로 낮은입니다. 추가 개선 칩 소자에 파티션 수에 따라 동적 범위를 증가 해야 합니다. 보편적인 튜브의 내부 공간 제한 때문에, 칩 소자에 대 한 획기적인 디자인 파티션 수를 증가 해야 합니다. 나중에 전체 dPCR 절차의 자동화 크게 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결과에, 인간의 오류를 줄일 것 이다. 성격 때문에 그것의 높은 처리량 및 높은 감도, 칩에서 튜브 형식으로 dPCR 액체 biopsies을 환경 DNA에 대 한 샘플의 수를 치료에 적용 될 예정 이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit	Qiagen	51194	Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000	ThermoFisher SCIENTIFIC	ND-8000	Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube	Agilent Technologies	401428	Protocol 1
Genomic DNA sample buffer	Agilent Technologies	5067-5366	Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder	Agilent Technologies	5067-5366	Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker	IKA	3617000	Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5365	Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system	Agilent Technologies	G2965AA	Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software	Agilent Technologies	Bundled with G2965AA	Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers	IDT	Custom order	Protocol 2
LNA probes	IDT	Custom order	Protocol 2
Software tool	IDT	Web site: http://biophysics.idtdna.com/	Protocol 2
dbSNP database	NCBI	Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/	Protocol 2
TE buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	12090015	Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher SCIENTIFIC	10977015	Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix	JN Medsys	12013	Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011
Clarity Sealing Fluid	JN Medsys	12005	Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011
Clarity JN Solution	JN Medsys	12006	Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011
Clarity Tube-strip	JN Medsys	12007	Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit	JN Medsys	12008	Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011
Clarity Auto Loader	JN Medsys	11002	Protocol 3: Auto loader A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer	JN Medsys	11003	Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001
Clarity Reader	JN Medsys	11004	Protocol 3: Reader A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler	Bioer Technology	TC-96GHbC	Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software	JN Medsys	Bundled with #10001	Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584	Protocol 4: Gel device for high sensitivity