노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

요약

노드 및 notochordal 플레이트는 일시적 이며, 여러 가지 기술을 사용 하 여 시각 될 수 있는 마우스 배아 개발 주최 신호 여기, 우리가 자세히 설명 두 그들의 구조 및 morphogenesis 연구 기법을 수행 하는 방법: 1) 스캐닝 전자 현미경 (SEM); 그리고 2) 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF).

초록

후 이식 마우스 배아 gastrulation 및 morphogenesis 개시 후 주요 모양 변화를 겪 습. Morphogenesis의 특징은 과도 주최, 노드 notochordal 접시, 원시 조 흔을 통해 통과 하는 셀의 형성. 적절 한 형성이 신호 센터의 몸 계획의 개발을 위해 필수적 이며 마우스 발달 생물학에 대 한 높은 관심은 그들을 시각화 하는 기법. 노드 및 notochordal 플레이트 gastrulating 마우스 배아 배아 하루 (E) 7.5 개발의의 복 부 표면에 거짓말. 노드는 그 셀 보유 한 단일 슬림 cilium 각 컵 모양의 구조. 적절 한 subcellular 지 방화 및 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭을 결정 합니다. Notochordal 플레이트 셀 또한 노드 셀 보다 짧은 이기는 하지만 단일 속눈썹을가지고. Notochordal 플레이트 notochord somitogenesis 및 신경 패턴에 대 한 중요 한 신호 주최자 역할을 형성 한다. 때문에 노드 및 notochordal 플레이트의 세포 표면에 뚜렷이 존재 하 고 속눈썹을가지고, 그들은 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 시각화 하는 데 사용 하는 다른 기술을 세포 수준에서 이러한 구조 전체 마운트 면역 형광 (WMIF)가 높은 노드 및 notochordal 격판덮개에 표시 된 단백질에 대 한 항 체를 사용 하 여입니다. 이 보고서에서 우리는 우리의 최적화 된 프로토콜의 조직 형태와 야생-타입에서 세포 조직 평가에 도움을 개발 마우스 배아 및 gastrulation 돌연변이 배아 SEM 및 WMIF 노드와 notochordal 플레이트의 수행을 설명 합니다.

서문

Gastrulation와 동반 전체적 움직임은 마우스 배아¹형성을 위해 결정적 이다. 세포 모양과 morphogenesis 조직에 변화 세포 운명을 통제 하 고 뒤이어 신호 경로 정확 하 게 새로 형성된 된 세균 레이어¹을 다변화 하기 그들의 기능을 수행 하도록 허용 하는 위치 정보를 지정 합니다. 일시적인 구조를 구성 하 고 노드 및 notochord 같은 센터를 신호 형성 발달 프로그램²의 실행을 위해 필수적 이다. 발달 생물학의 이러한 구조, 세포 기자와 라이브 ex vivo 세포 및 subcellular 동작^{2의 역학에 따라 이미지의 사용은의 가장 주목할 만한 morphogenesis 공부 기술의 다양 한 사용 ,,34}. 이 보고서에서 우리는 두 이러한 기술에 대 한 우리의 최적화 된 프로토콜의 세부 묘사에 초점: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF)를 노드의 morphogenesis 공부에서 여전히 쓸모 있다 그리고 notochordal 격판덮개는 notochord의 선구자.

마우스 배아 노드는 눈물 모양의 컵 셀의 gastrulation 및 morphogenesis (배아 일, E7.5-E8) 중 후반 머리 배 단계를 초기 주위 마우스 태아의 복 부 표면에 있는^{2,5, 6,7}. Notochordal 플레이트 형태학 상으로 anteriorly 노드³에서 emanates. 노드 및 notochordal 격판덮개에 각 셀 단일 cilium는 노드 셀에 긴 하지만 길이 따라 발달 단계²외부에 돌출 하는 특징 이다. 노드 구 덩이에 속눈썹의 회전 좌우 비대칭⁴를 결정 하는 신호에 대 한 중요 한 것을 보였다. Notochordal 플레이트 notochord, 인접 somites, overlying 신경 관³의 모방에 대 한 중요 한 신호 센터의 선구자 이다.

위치 (표면), 모양 (컵)와 고유한 외부 세포 구조 (속눈썹) 소지의 특성 때문에 sem의 전통적으로 사용 되었습니다 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하 고 그들의 형성과 구조^2, 연구 ⁷. SEM는 또한 노드 자체 또는 gastrulation, morphogenesis, 뿐만 아니라 속눈썹 형성^8,,910에 영향을 주는 돌연변이 셀에 속눈썹의 구조에 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. Sem의 전자가 생물 표본¹¹등 재료의 외부 표면의 토폴로지 열 대권 외의 집중된 광선을 이용 하는 기술입니다. 샘플은 고정, 건조 하 고 스퍼터 코팅 금속 스캐닝 전자 현미경 관찰에 대 한 1 단계에서에서 설명 하는 대로.

WMIF는 유전자 제품, 단백질, 3 차원 (3D) 등을 시각화 하는 착 색 기술입니다. 조직, 기관 또는 전체 유기 체는 WMIF 신호 및 3d에서 결과 구조의 모양의 분포에 대 한 공간 정보를 제공합니다. 기술은 다음 형광 어원이 같은 말과 얼룩 샘플 고정 기반으로 합니다. 마우스 배아 ~ E7.5는 고 투명 작고 따라서 노드 및 notochordal 접시를 시각화 하기 위해 WMIF 프로토콜에 대 한 이상적인. 예를 들어 Barchyury (T) 핵 노드 및 notochordal 플레이트, 그리고 원시 조 흔, E7.5-E8 배아 개발 및 WMIF에 의해 T에 대 한 좋은 작업 항 체의 주위에 덜 정도로 표현 된다 전사 요소는 상업적으로 사용 가능한 착 절차를 가능 하 게 하 고. 노드 및 notochordal 플레이트의 셀 외부를 직면 하 고 따라서 형광 활용 Phalloidin 마크 F 걸 꼭대기 constrictions로 얼룩이 질 수 있다 압축된 꼭대기 표면 또한 특징입니다. 예제로이 시 약을 사용 하 여, T와 F-말라 WMIF에 의해 착 색의 조합 제공 합니다 노드 및 gastrulating 마우스 배아에 3d에서 notochordal 플레이트의 표현을 우리가 2 단계 ⁸에서 보여줍니다. 그러나, 노드 및 notochordal 플레이트, FOXA2, 등의 다른 마커 뿐만 아니라 ARL13B 또는 acetylated tubulin, 속눈썹의 마커 개발 마우스 배아^3,4, WMIF를 수행 하기 위해 또한 사용할 수 있습니다.

우리는 striatin 상호 작용 단백질 1 (STRIP1) 정상 gastrulation 및 마우스 배아⁸morphogenesis 필수적입니다 나타났습니다. STRIP1 striatin-상호 작용 가수분해 및 kinases 복합물 (STRIPAK), 우리와 다른 걸 골격 조직^8,12에 연루가의 핵심 구성 요소입니다. Strip1 돌연변이 체 배아에 주요 결함 축 mesoderm (노드 및 notochordal 플레이트)의 형성과 antero 후부 몸 축의 확장에 있다. 우리는 우리가 대표 결과 에 해당 수치 표시 노드 및 야생-타입 (WT)와 Strip1 돌연변이 배아 notochordal 접시를 분석 하 SEM 및 WMIF를 이용 했다.

프로토콜

모든 실험 동물 실험 관련 북 라인 베스트팔렌 (NRW LANUV)에 책임 있는 권위에 의해 승인 되었다.

1. 마우스 배아 노드 스캐닝 전자 현미경 검사 법

1. 희생에서 임신 여성 마우스 ~ 자 궁 경부 전위에 의해 E7.5 (somite 단계 2-4). 대 한 자세한 설명은 다이어그램 단계 1.1-1.7 마우스 배아 실험실 설명서¹³에서 제공 됩니다.
2. 피부와 mesenteries를 통해 복 부를 열고 위와 미세 집게를 사용 하 여 자 궁을 제거 합니다.
3. 증류수에 간단히 자 궁을 헹 구 고 그것 작은 깨끗 한 페 트리 접시 (6 cm) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1.
4. 해 부 현미경 및 미세 집게를 사용 하 여, 개별 deciduae 또는 이식 사이트 무료 자 궁 근육을 제거 합니다.
5. 한 쌍의 집게와 각 decidua 누른 다른 쌍을 사용 하 여 빨간 부분 (미래 태) 사이의 흰 부분 (태아가 위치한) 경도 전체 두께 절 개를 하 게. 표면 구멍에 decidua의 흰색 부분을 따라 수직으로 절 개 된 연속 확인 합니다. 두 개의 반쪽으로는 decidua 떨어져 가로 당겨 하 고 신중 하 게 푸는 decidua의 흰 부분에 배아 다.
6. 새로운 페 트리 접시 (35mm) 신선한 살 균 필터링 PBS 가진 배아를 전송 합니다. 모든 deciduae/배아에 대 한 반복 합니다.
7. Reichert의 막 제거, 태아를 덮어 상대적으로 불투명 막, 괴 롭 히 고 여 각 배아에서 그것 멀리 양말 ectoplacental 콘 (붉은 이식 사이트)에서 시작. 유전형을 받아 작은 조각 (~ 0.1 m m²) 노 른 자 색이이 단계에서의.
8. 화학 후드 및 적절 한 보호 장치 (장갑), EM 학년 정착 액 2.5%도 실 온에서 microcentrifuge (1.5 mL) 튜브에 PBS 살 균 필터링에서 구성 된 배아 전송. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정
9. 조심 스럽게 배아를 건드리지 않고 튜브에서도 정착 액을 제거 하 고 적절 한 폐기물 컨테이너에서 삭제. 각 실 온에서 15 분에 대 한 살 균 필터링 PBS에 배아 세 번을 씻어.
10. 5 분에 대 한 에탄올 시리즈에 배아를 탈수: 50%, 70%, 85%, 및 100% 또는 절대 에탄올에 세 번. 에탄올에서 −20 ° C에 배아를 저장 하거나 다음 단계로 바로 진행.
11. 임계점 (일일) 임계점 건조 기 기계에 건조 대 바구니에 에탄올에 배아를 전송 합니다. 바구니를 완전히 커버 하는 에탄올으로 챔버를 채우십시오.
12. 신중 하 게 액체 CO₂ 와 10 ° c.에 10 번 홍 조 하 여 에탄올을 교환 챔버 절반 가득 때까지 마지막 단계 후 액체 CO₂ 에서 드레인. 압력 80 바 (임계점) 되 고 액체 CO₂ 가스 변경 때까지 40 ° C까지가 열. 10 분 기다립니다 다음 약 45 분 동안 천천히 가스를 버릴.
13. 건조에 대 한 일일 비용을 쉽게 대신, 30 분에 대 한 에탄올에 배아를 1: 1의 비율로 hexamethyldisilazane (HMDS)을 추가 합니다. 그런 다음 30 분 제거에 대 한 순수한 HMDS는 피 펫을 사용 하 여 액체에서 배아 배아를 전송 하 고 30 분 동안 건조 그들을 두고.
    참고: 두 건조 방법 일 동등 하 게 우리 손에서 잘.
14. 좋은 브러시를 사용 하 여 이중 양면된 테이프와 sem의 스텁에 복 부 측 (노드)와 말린된 배아를 탑재.
15. 충전 긴 얇은 속눈썹을 선호 골드 입자 코팅 용 스퍼터 코팅 기계에 배아와 명세서를 삽입 합니다. 120-150의 레이어 적용 Å; 시간 각 샘플 달라 집니다 전류에 따라 달라 집니다.
16. 배아와 코팅된 명세서 SEM 현미경에, 진공 적용 놓고 배아 노드 및 15, 1000 X에서에서 까지의 배율에서 속눈썹 notochordal 플레이트 세포 관찰 000 X.

2. 전체 산 면역 형광 마우스 노드 및 Notochordal 플레이트의

1. 0.05% 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 트윈 20 (PBSTw), 단계 1.1-1.7 위의 E7.75에서 배아를 제거 하 고 35mm 페 트리 접시에 얼음에에서 PBSTw에 배치를 합니다.
2. 화학 후드 및 적절 한 보호 (장갑)을 착용, microcentrifuge 튜브에 PBS에 4 %paraformaldehyde 통 솔루션에 배아를 전송 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정
3. 조심 스럽게 배아를 건드리지 않고 튜브에서 paraformaldehyde 정착 액을 제거 하 고 적절 한 폐기물 컨테이너에서 삭제. 0.2%를 포함 하는 PBS에 배아 세 번 씻어 실 온에서 각 5 분에 대 한 Triton X-100 (PBSTr). Nutating 통에 모든 세척 및 다음 인큐베이션 단계를 수행 합니다.
4. 마지막 세척 제거 하 고 차단 솔루션 PBSTr (이차 항 체의 호스트 종)에서 열 비활성화 세럼 10%로 포함 된 추가. 2 h에서 하룻밤 (또는 더 긴)으로 4 ° c.에 nutator에
5. 차단 제거 하 고 추가 ~ 차단 솔루션, 1: 500 희석에 예를 들어 안티-T 항 체 희석 주 항 체의 1 mL. 4 ° c.에 nutator에 하룻밤 (또는 이상)를 품 어
6. 1 차적인 항 체를 제거 하 고 0.02% (20% 주식의 항 체 솔루션의 1 mL에 1 µ L)의 최종 농도에 나트륨 아 지 드를 추가 하 여 나중에 사용을 위해 그것을 저장. 항 체를 다시 사용할 수 있습니다 ~ 10 번. PBSTr로 두 번 배아를 헹 구 고 4 ° c.에 nutator에 각 30 분에 대 한 세 번 그들을 씻어합니다
7. 형광 활용 된 이차 항 체, 1 차적인 항 체 호스트 종에서 희석에 대 한 세척 바꿉니다 ~ 1:1000 하룻밤 (또는 이상) 4 ° c.에 nutator에
8. 이차 항 체를 제거 하 고 두 번 PBSTr, 다음 PBSTr와 함께 30 분 동안 세 번 세척 린스.
9. F-말라와 1:1000 DAPI, 실 온에서 1 h 핵 얼룩 얼룩을 1: 500 형광 활용 된 phalloidin를 포함 하는 PBSTr에 마지막 세척을 바꿉니다.
10. PBSTr에 두 번 헹 구 고 실 온에서 30 분 동안 PBSTr로 한 번 씻어.
11. PBS를 가진 PBSTr를 대체 하 고 얼음에 배아를 둡니다. 깨끗 한 긍정적으로 위탁 슬라이드 (60 x 24 mm) 및 coverslips (24 x 24 mm)과 수성 글리세롤 기반 설치 미디어, 예를 들어 1xPBS에 90% 글리세롤과 배아를 탑재 하는 antifade 시 약 준비.
12. 거리에 명확한 테이프의 두 조각을 넣어 ~ 15mm 슬라이드의 명확한 부분에 서로 다른. 이것은 충분 한 3D 공간 (Z 차원) 배아 병합 하지만 완전히 그들을 함부로 대 하지 있도록 만듭니다.
13. 해 현미경으로 신중 하 게 배아 (전송 하 여 손상 되지 배아에 대 한 충분 한 공간이 있도록) 컷된 P200 피 펫을 사용 하 여 슬라이드를 이동 합니다.
14. 미세 집게를 사용 하 여 태아를 펼쳐 노 른 골목의 옆 측에 2 개의 전체 컷을 확인 합니다. 최대 복 부 측 (노드 및 notochordal 플레이트)와 태아 (슬라이드에 아래로 신경 튜브의 등 쪽) 놓습니다.
15. 태아에 미디어를 마운트의 50 µ L를 추가 합니다. 슬라이드 당 4-5 배아를 놓습니다. 먼저 터치 슬라이드 (위쪽 또는 아래쪽 측면), 다음 테이프의 두 가지를 벌리고 배치 되며 기포 생성을 피하는 동안 좋은 집게 또는 구부러진된 정밀한 바늘을 사용 하 여 태아에 천천히 낮은 coverslip의 미디어를 마운트의 소량을 추가 합니다.
16. 흡수 성 지우기를 사용 하 여 초과 설치 미디어를 청소. 수는 coverslip 과정에서 이동 하지 않도록 주의 하십시오.
17. 매니큐어의 관대 한 금액을 사용 하 여, 그것을 이동 하지 않고는 coverslip의 측면을 봉인.
18. 스캐닝 confocal 현미경으로 관찰 합니다.

결과

시험의 WT와 Strip1 돌연변이 배아에서 노드의 형성 하기 위하여 ~ E7.5, 우리는 1 단계에서에서 설명 하 고 그림 1⁸과 같이 SEM 사용. SEM을 사용 하 여 외부 토폴로지의 ultrastructural 정보 아주 유익 되었고 그것은 즉시 분명 WT 배아에서 구 덩이 모양의 노드를 달리 돌연변이 배아는 평평 하 고 불규칙 한 노드 했다. 배아의 높은 확대에 그들을 명확 하 게 식별 하는 노드 셀 특성 속눈썹을 보여주었다. 돌연변이에 속눈썹의 명백한 낮은 밀도 노드 구 덩이 구조와 곡률 또는 노드 셀의 낮은 수의 손실에 기인 수 있습니다. 노드의 emanating 나타나는 notochordal 플레이트 또한 돌연변이 배아에 일반 했다. 그들은 그들의 짧은 속눈썹을 식별 했다. 따라서, SEM Strip1 돌연변이⁸노드 morphogenesis 결함을 공개 하는 것이 중요 했다. 우리는 또한 사용 sem의 이전 연구에서 부족 centrioles 속눈썹⁹에 대 한 서식 파일을 제공 하는 돌연변이의 배아 노드에 있는 속눈썹의 부재를 보여.

공부 하 고 세포 수준에서 Strip1 돌연변이 배아의 축 mesoderm 형성 결함, 우리는 2 단계에서에서 설명 하 고 그림 2에 표시 된 WMIF를 사용. 이 기술을 사용 하 여, 노드 및 notochordal 판 쉽게 확인 되었다 F-말라와 T 얼룩에 의해. WT 노드 및 notochordal 플레이트 셀 F 걸 농축 했다, 그리고 분명 했다 핵 T 얼룩 꼭대기 도메인 막혀서 있다. Notochordal 플레이트는 WT에 rostrally 확장 하지만 짧고 불규칙 돌연변이. 데이터 F 걸 조직 축 mesoderm⁸을 포함 하 여 돌연변이 배아의 다른 세균 층에서 비정상적인 보여주었다. 따라서, WMIF 노드에 결함 및 Strip1 돌연변이 체 배아에 notochordal 격판덮개 형성 연구 수단이 되었다.

그림 1 . Strip1 돌연변이 마우스 배아에서 노드 morphogenesis에서 결함을 보여준다 스캐닝 전자 현미경 검사 법. (맨 위) SEM 분석의 WT와 Strip1 돌연변이 복 부 배아 노드 및 notochordal 플레이트 (노토)⁸. WT 태아의 낮은 확대 이미지의 예를 들어 왼쪽에 표시 됩니다. (아래) 노드의 노드 셀에서 예상 하는 긴 monocilia를 공개 하는 위에 표시 된 센터의 높은 배율. 앞쪽에서 모든 패널입니다. 스케일 바: 30 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . 전체 산 면역 형광 검사에서는 비정상적인 노드 및 세포 수준에서 notochordal 플레이트 Strip1 돌연변이 배아. (맨 위) 복 부 3D 렌더링 (Volocity 소프트웨어) WMIF WT와 Strip1 돌연변이 배아 형광 활용 된 phalloidin (F 걸, 빨간색)와 T (그린) 항 체 얼룩이 지기의 조합을 사용 하 여에. (아래) 얼룩 높은 줌 노드에 초점과 DAPI를 포함 하 여 위 그림의 더 많은 예제. 앞쪽에서 모든 패널입니다. 스케일 바: 30 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 작품은, SEM 및 WMIF는 마우스 배아 노드 및 notochordal 접시를 시각화를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. Gastrulating 마우스 배아의 작은 크기 ~ E7.5와 표면에 이러한 구조의 존재 그들을 이상적인 기술 설명된^2,,78을 사용 하 여 공부 하 게. 좋은 항 체, T와 속눈썹 표식 등의 구조, 조직 및 이러한 필수 배아 주최⁸의 형성에 WMIF를 사용 하 여 우수한 3D 정보를 제공 합니다.

마우스 배아 개발은 매우 빠른 속도로 진행 되며 노드 및 notochordal 격판덮개만 정도 태아의 표면에 존재, 때문에 타이밍은 이러한 실험^2,3의 성공을 위해 필수적입니다. 예를 들어 2-4 somite 배아는 긴 속눈썹과 성숙한 노드 구 덩이의 SEM 분석을 위해 좋다. 훨씬 이전 또는 이후 배아 (전이나 후에 예를 들어 12 h), 노드는 표면에 않을 수 있습니다. WMIF는이 점에서 좀 더 유연 하지만 스스로 구조는 또한 개발 하는 동안 과도 그리고 타이밍은이 경우에 연구자의 관심 분야에 따라 달라 집니다.

시 약의 순수성도 이러한 기술의 성공을 위해 필수적 이다 특히 열 대권 외의를 일반적으로 배아에 충실 SEM. 작은 불순물에 의해 조사 결과 거 대 한 유물에.

우리는 sem의 하나에 대 한 배아 정착의 두 가지 방법을 테스트 1 x PBS의 절반 Karnovsky의 정착 액 (2.5%도, 2 %paraformaldehyde 0.1 m M cacodylate 버퍼)와 간단 하 게 2.5%도 사용 하 여. 하지만 우리 글 및 PBS 정착 제 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하는 것을 선호, 우리와 다른 사용 해야, 또한 반 Karnovsky의 정착 액 성공적으로 SEM.에 대 한

우리는 또한 sem의 대 한 배아를 건조의 두 가지 방법에 비해 임계점 건조 기 또는 HMDS 1 단계에에서 설명 된 대로 사용 하 여 샘플의 품질에 차이가 발견 고¹⁴다른 곳에서 보고.

2 단계에 대 한 우리 1% 낮은 녹는 agarose의 최종 세척 단계 35 m m 유리 하단 접시에 장착 후 배아를 포함 하 고 다음 함께 그것을 토 핑 테스트 ~ 10 µ L 설치 매체의. 이 포함 하는 방법을 작동 하 고 태아의 원래 3 차원 구조 및 관련 된 구조; 그러나, multiphoton 현미경 표본 정기 confocal 현미경 그대로 배아로 깊은 도달할 수 없습니다 있기 때문에 이미지 하는 데 필요한 (~ 1 m m).

우리가 믿습니다 이러한 두 가지 기술을 사용 하 여 상호 보완적인 정보 노드와 notochordal 격판덮개의 구조에 정상적인 개발 하는 동안 이러한 구조의 형성에 결함을 표시 하는 돌연변이에.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)	Carl Roth	3840
Anti-T antibody	R&D Systems	AF2058
Critical Point Dryer	Blazers Union	CPD 020
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Glutardialdehyde solution 25%	Merck	1042390250
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	AppliChem	A4974,0500
SEM coating unit PS3	Agar Aids for Electron Microscopy	PS3
SEM microscope Quantum FEG 250	ThermoFisher Scientific (FEI)	Quantum FEG 250