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요약

우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.

초록

말 초 혈관 질환은 전세계적으로 수백만 명의 환자에 게 영향을 미치는 광범위 한 임상적 문제입니다. 말 초 혈관 질환의 주요 결과는 허 혈의 발병입니다. 심한 경우에, 환자는 그들은 지속적인 통증과 사지 절단의 증가 위험을 경험 하는 중요 한 사지 허 혈을 개발할 수 있습니다. 말 초 허 혈에 대 한 현재 치료법은 혈액 흐름을 회복 시키기 위해 스 텐트 또는 죽 상 절제술을 사용한 혈관 성형 술과 같은 경 피 개입 또는 우회 수술을 포함 한다. 그러나, 이러한 치료법은 종종 혈관 질환 또는 재 협 착의 지속적인 진행에 실패 하거나 환자의 전반적인 건강 불량으로 인해 금기 된다. 말 초 허 혈을 치료 하는 유망한 잠재적인 접근법은 환자가 담보 혈관 구조를 개발할 수 있도록 치료 적 혈관 신생의 유도를 수반 한다. 이 새로 형성 된 네트워크는 영향을 받는 부 위에 관류를 복원 하 여 말 초 허 혈을 완화 한다. 말 초 허 혈에 대 한 가장 빈번 하 게 사용 되는 전 임상 모델은 대 퇴 동맥 결 찰을 통해 건강 한 토끼에서의 뒷 사지 허 혈의 생성을 활용 한다. 과거에, 그러나, 전 임상 연구의 성공과 말 초 허 혈에 대 한 치료에 관한 임상 시험의 실패 사이의 강력한 단절 되었습니다. 건강 한 동물은 전형적으로 외과 적으로 유발 된 허 혈에 반응 하 여 강력한 혈관 재생을 가지 며, 만성 말 초 허 혈을 갖는 환자의 감소 된 바소 및 재생과는 대조적 이다. 여기서, 우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 포함 하는 토끼의 말 초 허 혈을 위한 최적화 된 동물 모델을 기술 한다. 이 모델은 더 높은 콜레스테롤 다이어트 모델과 비교 하 여 부수적인 형성과 혈압 회복을 감소 시켰습니다. 따라서, 모델은 말 초 혈관 질환을 동반 하는 일반적인 공동 morbidities 로부터 손상 된 혈관 신생을 가진 인간 환자와 더 나은 상관관계를 제공할 수 있다.

서문

말 초 동맥 질환 (PAD)은 죽 상 경 화성 플 라크 형성의 진행이 신체의 사지에서 혈관의 협 착으로 이어지는 일반적인 순환 장애입니다. 최근 당뇨병, 비만 및 비활동을 포함 한 동맥 경화 증에 대 한 위험 요소의 증가는 혈관 질환1의 보급을 증가 시키는 것으로 이어졌습니다. 현재, 그것은 추정 된다 12%-20% 60 세 이상의 일반 인구의 말 초 동맥 질환2. 말 초 동맥 질환의 주요 결과는 말 초 허 혈의 발달 이며, 가장 일반적으로 하 부 사지에서 발견 됩니다. 심한 경우에, 환자는 중요 한 사지 허 혈을 개발할 수 있습니다, 혈액의 흐름의 부족으로 인해 일정 한 통증이 있는 상태. 중요 한 사지 허 혈을 가진 환자는 진단의 1 년 안에 1 개의 사지가 있는 경우에 50%의 가능성을가지고 있습니다. 게다가, 당뇨병을 가진 환자는 혈관 형성3,4를 위한 내정간섭 뒤에 말 초 동맥 질병 그리고 나쁜 결과의 더 높은 부각이 있습니다. 말 초 허 혈에 대 한 현재 치료법은 죽 절제술 및 스 텐트 팅 또는 외과 우회와 같은 경 피 적 개입을 포함 한다. 그러나, 많은 환자에 대 한 이러한 치료는 단기 혜택을 제공 하 고 많은 주요 수술 절차에 대 한 충분 한 건강 하지 않습니다. 이 작업에서, 우리는 당뇨병 질환 상태의 맥락에서 수술 적 결 찰을 통해 토끼에서 말 초 허 혈의 발생을 통합 하는 말 초 혈관 질환을 표적화 하는 새로운 치료법을 시험 하기 위한 전 임상 동물 모델을 기술 한다.

토끼에서의 뒷 다리 허 혈 모델은 반 세기 이상5,6에 대 한 인간 연구에 폐색 성 혈관 질환 및 임상 전 구체를 위한 생리 적 모델로 사용 되 고 있다. 토끼는 종종 발목과 종 아리 근육의 개발 근육에의 한 말 초 허 혈에 대 한 연구를 위한 바람직한 종으로, 대조적으로 일반적인 큰 동물 모델은 ungulates (hooves를 가진 동물). 몇몇 최근 리뷰는 인간7,8에서 말 초 혈관 질환을 모델링 하 고이 모델 및 다른 사람의 사용을 해결 하였다. 토끼에서의 뒷 다리의 허 혈을 이용한 유사 모델은 성장 인자9,10,11,12,13의 전 임상 연구에서 사용 되었으며, 22,16,18, 20유전자 요법21,23 24일,29일,31일,32 33,34,35,3637, 38, 42,43, 44및 줄기 세포45, 46, 47, 48 ,51은 사지의 치료 적 혈관 신생을 위한 것 이다. 불행 하 게도, 이러한 성공적인 동물 연구를 따라 임상 시험 환자에 대 한 상당한 혜택을 보여주지 않았다52.

이러한 번역 실패에 대 한 이유의 한 가지 설명은 인간 환자에서 말 초 허 혈의 상태는 혈관 신생 신호에 대 한 저항성을 포함 하는 것이 하나53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. 몇몇 연구는 당뇨병과 고 혈당 증에서 혈관 신생 신호 전달 경로의 결점을 보여주었습니다. 당뇨병 및 고 지 혈 증은 헤 파란 황산 염 proteoglycans을 절단 하는 효소의 증가와 헤 파란 황산 염의 손실로 이어질 수 있으며, 성장 인자60 의 치료 적 혈관 형성/동정에 대 한 저항성을 위한 잠재적인 기전을 제시 한다 , 61. 따라서, 말 초 허 혈에 대 한 모델의 주요 특징은 치료가 인간 환자에 존재 하는 질환 상태의 맥락에서 평가 될 수 있도록 치료 적 저항의 양태를 포함 한다.

이 작업에서는 대 퇴 동맥의 외과 적 결 찰을 통해 말 초 허 혈의 토끼 모형을 기술 합니다. 당뇨병과 고 지 혈 증의 유도와 함께 리드 인 기간이 모델에 통합 된다. 우리는 당뇨병 없이 높은 지방 다이어트를 통합 하는 다른 모델에이 모델을 비교 하 고 당뇨병과 고 지 혈 증의 낮은 수준의 모델은 혈관 성장을 감소에 더 효과적 이었다 발견. 우리의 모델은 별도의 그룹에 의해 사용 된 발전을 결합, 말 초 혈관 질환 연구에서 일관 된 결과를 달성 하기 위해 실용적이 고 표준화 된 방법을 제공 하는 것을 목표로.

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프로토콜

동물을 포함 하는 연구는 오스틴에 있는 텍사스 대학의 대학과 휴스턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC), 동물 관리 및 사용 검토 사무소 (ACURO)의 UTHealth 과학 센터의 승인을 수행 했다 미국 육군 연구 보호의 의료 연구 및 물질 명령 사무실, 그리고 동물 관리를 위한 NIH 지침에 따라.

1. 당뇨병과 고 지 혈 증의 유도

  1. 뉴질랜드 토끼 (4 ~ 6 개월)를 표준 알 팔 파 차 한 컵에서 4 일 동안 콜레스테롤 차 우 0.1%까지 전환 합니다. 1 ~ 5 일에는 표준 차 우를 사용 하 여 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 및 0:1의 콜레스테롤 차 우 비율을 각각 사용할 수 있습니다. 0.1%의 콜레스테롤 차 우에 2 주 후, 토끼를 유도 하 여 다음 단계에 설명 된 바와 같이 alloxan 주사를 사용 하 여 당뇨병을
  2. 케 타 민를 사용한 토끼는 22g 카 테 터를 사용 하 여 왼쪽 귀 정 맥에 카 테 터를 도입 하 여 IV 주사를 위한 피하 주사 및 준비를 통해, 35mg/75mg/ml의 acepromazine을 사용 한다.
  3. 초기 혈당 수준 (BGL) 측정을 위한 귀 정 맥 카 테 터의 허브를 통해 토끼에서 혈액 방울을 모으십시오. 모든 표준 미터 사용할 수 있습니다. 토끼에 대 한 정상 포도 당 수준은 일반적으로 80 150 Mg/dl의 범위에 있다.
  4. 시린 지 펌프를 사용 하 여 8 분 동안 천천히이 어 카 테 터를 통해 8 mL의 부피로 생리 식 염 수로 재구성 된 100 밀리 그램/kg에서 alloxan을 주입 하십시오.
  5. 다음 12 시간 동안 BGL이 저 혈당을 모니터링 하기 위해 표준 미터를 사용 하 여 매시간 확인 하십시오.
    1. 토끼를 제한 수단은에 놓습니다.
    2. 2.5% lidocaine/2.5% prilocaine 크림으로 귀 마 취.
    3. 27G 바늘을 사용 하 여 측면 귀 정 맥에서 혈액을 채취 하 고 표준 측정기를 사용 하 여 BGL을 측정 합니다.
  6. 처음 7 일 동안 BGL을 하루에 두 번 측정 하십시오. BGL이 350 mg/dl에 도달 하거나 초과 하는 경우 토끼에 게 인슐린 주사를 준다.
  7. 수술 전날 혈관 그램 동안 크기 마커로이 식을 위한 3mm 스테인레스 스틸 공을 준비 하십시오.
    1. 생 검 펀치를 사용 하 여 큰 시트에서 10 mm 원형 조각을 절단 합니다.
    2. 투명 실리콘 실 란 트를 사용 하 여 시트의 중앙에 공을 마운트합니다.
    3. 완전히 밀폐 제와 공을 커버. 최소 24 시간 동안 실 란 트를 치료할 수 있습니다.
    4. 볼을 열린 2 인치 x 3 인치 저밀도 폴 리 에틸렌 봉지에 넣고 멸 균 백에 넣고 에틸렌 옥 사이드 가스로 소독 하십시오.

2. 수술 용 토끼의 준비

  1. 토끼를 피하 주사를 통해 20 ~ 40 밀리 그램/kg 케 타 민 및 midazolam 2mg/kg을 사용 하 여 마 취 시켰다. 토끼를 아이 소 루 레인 (일반적으로 2%)에 1.5%로 놓습니다. 마스크를 사용 하 여 초기 진정 작용을 통해. 3 밀리 그램/kg의 근육 내 주사를 통해 마 취를 유지 하기 위해 alfaxalone의 주사를 제공 하십시오.
  2. 일단 마 취, 마스크를 제거 하 고 수 갑 기관 관을 삽입, 기도에 넣고 호흡기에 연결. 아이 소 루 레인의 1.5%를 계속 해 서 관리 한다.
  3. 기저 화학 패널에 대 한 양쪽 귀에서 중앙 동맥에서 혈액을 수집.
  4. 귀 정 맥 카 테 터 22 G을 옆 귀 정 맥에 놓고 수술 과정을 통해 간결한 링거 용액을 떨어 뜨 리 세요. 대안적으로, 통상의 식 염 수 (0.9% 염화 나트륨)가 사용 된다.
  5. 반대쪽 귀에 있는 횡 정 맥을 사용 하 여 정 맥에 카 테 터를 놓고 alfaxalone 6 밀리 그램/kg/h로 전달 하십시오. 점차적으로 8 mg/kg/h로 alfaxalone 증가 하는 동안 아이 소 루 란을 준비 기간 동안 0.6%로 감소 시킵니다.
  6. 통증과 감염의 위험을 제한 하기 위해, 부 프레 노르 핀 (0.01 밀리 그램/kg) 및 엔로 플 록 사신 (5mg/kg)을 사용 하 여 25 G의 바늘로 피하 주사를 투여 한다.
  7. 목, 오른쪽 및 왼쪽 안쪽 허벅지에 머리를 손질 하 고 다시 클리퍼 (#40 블레이드)를 사용 하 여. 접지 패드와의 접촉을 유지 하기 위해 뒤쪽에서 머리카락이 제거 됩니다.
  8. 각 뒷 다리에 혈압 커 프를 놓고 초기 혈압을 측정 합니다. 단지 측면 표면에 호크 위의 프로브와 무릎 아래에 팔목을 배치 합니다.
  9. 그 뒤에 수술 테이블에 토끼를 배치 하 고 스크럽 및 수술 부위를 드 레이프. 이것은 대 퇴 동맥 접근을 위한 경 동맥 접근을 위한 목 및 안쪽 오른쪽 허벅지를 포함 합니다. 2%의 클 로르 헥 사 딘과 70% 에틸 알콜을 교대로 반복 하 여 살 균 스크럽을 수행 합니다. 이를 세 번 반복한 다음 2%의 클 로르 헥 딘 용액으로 최종 스프레이를 바릅니다.
  10. 3mm의 스테인리스 스틸 볼을 저 농도의 폴 리 에테르 티 엔 백 내부에 살 균 하 여 허벅지 윗부분 근처의 오른쪽 (scrubbed) 다리 위에 놓고 혈관 그램 측정 시 크기 기준으로 사용할 수 있습니다. 수술 시간까지 다리 위에 무 균 드 레이프를 놓습니다. 첫 번째 혈관 그램 동안 멸 균 비닐 봉지 안에 공을 남겨 주세요.

3. 혈관 조 영 법

  1. 오른쪽 일반적인 경 동맥을 노출
    1. #15 잎을 가진 메스를 사용 하 여 기관에 그냥 횡 절 개를 4 ~ 5cm 길게 하십시오.
    2. 경 동맥을 노출 하 고 작은 Weitlaner 견인 기를 사용 하 여 절 개를 개방 하는 데 무딘 해 부를 사용 합니다. 경 동맥 정 맥 및 미주 신경에서 동맥을 조심 스럽게 분리 합니다. 전형적으로 곡선 메 젠 바 움가 위 및 곡선형 모기 객 혈은 무딘 해 부에 사용 됩니다. 신경에서 경 동맥을 완전히 분리 하 고 동맥을 리 게이트 하 여 합자를 만드는 정 맥을 확인 하십시오.
  2. 노출 된 동맥의 근 위 및 말단 말단에 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 합자를 배치 하십시오. 외과 의사의 매듭 뒤에 4 개의 정사각형 매듭으로 경 동맥 말단을 묶어. 근 위 끝에서 ligaloop을 사용 하 여 필요에 따라 조여 주거나 느슨하게 할 수 있습니다. 노출 된 동맥의 근 위 단 부에 놓이는 ligaloop의 사용은 인트로 듀 서와 카 테 터를 확보 하는 것을 도울 수 있습니다.
  3. IV를 통해 헤 파 린의 500 IU를 관리 하십시오. 노출 된 경 동맥을 따라 약 0.5 mL의 1% lidocaine를 사용 하 여 혈관을 팽창 시킵니다. 1 개의 처리는 일반적으로 충분 합니다, 그러나 필요에 따라 반복 될 수 있습니다. 메스 또는 아이리스가 위를 사용 하 여 경 동맥을 통해 약 반 방법을 자른 다음 4 인치 와이어 삽입 도구를 동맥에 놓습니다.
  4. 0.014 인치 x 185 cm 가이드 와이어를 삽입 도구를 통과 하 여, 하강 하는 대동맥의 장 골 문장에서 대동맥으로 이송 합니다. 삽입 도구를 제거 하 고 3 층 피그 테일 혈관 그래픽 카 테 터를 와이어 위에 삽입 합니다.
  5. 하강 하는 대동맥의 장 골 문장에서 대동맥 부 위에 2 cm 근 위부로 떠 꺼 머리 카 테 터를 전진.
  6. 카 테 터의 끝을 일곱 번째 요 추와 첫 번째 천 골 척추 사이에 위치 시킵니다. 2 – 4 mL의 조 영제를 수동으로 주입 하 여 카 테 터의 위치를 테스트 합니다.
  7. 혈관 확장을 높이기 위해 카 테 터를 통해 100 μ g의 글 리세 린 내 동맥 내 주사를 관리 합니다.
  8. 카 테 터를 통해 토끼에 게 lidocaine 1%의 0.8 mL를 투여 하 여 혈관의 그램 동안 혈관 확장을 돕습니다. 인젝터 용 튜브를 카 테 터에 부착 하 고 라인의 기포를 제거 합니다. 카 테 터를 통해 자동 혈관 그래픽 인젝터를 사용 하 여 8-9 mL의 콘트라스트 미디어를 주입 합니다.
  9. 혈관 조 영 법을 사용 하 여 뒷 다리의 연속 이미지를 기록 합니다.
    1. 총 8-9 mL의 3 mL/초에서 대비를 주입 하도록 파워 인젝터를 설정 합니다. 초당 6 프레임에서 디지털 뺄셈 혈관 조 영 술을 수행 합니다.
    2. 생성 된 시리얼 이미지를 선택 하 고 약-40% 설정을 사용 하 여 각 혈관 그램의 사진을 변경 하 여 뼈의 모양을 최소화 하 고 대조를 통해 혈관 관류의 완전 한 그림을 캡처합니다. 대 퇴 동맥 결 찰/절제 후의 혈관 흐름의 예 혈관 그램은 도 1에 나타나 있다.

4. 대 퇴 동맥의 분리

  1. 메스 (#15 블레이드)를 사용 하 여 오른쪽 대 퇴 동맥을 통해 피부에 세로 절 개를 만듭니다. 절 개 부는 사 타 구니 인 대에서 inferiorly 확장 하는 것을 확인 하는 것은 단지 슬 골 (약 6cm)에 근 위 지역에서 끝나는.
  2. 구부러진 메 첸 바 움가 위 또는 구부러진 모기 객 혈이 있는 무딘 해 부를 사용 하 여 대 퇴 동맥을 노출 시킵니다.
  3. 열 절 개를 유지 하기 위해 Weitlaner 견인 기를 사용 하십시오.
  4. Lidocaine 1%의 0.5 mL를 추가 하 여 신경 자극을 줄이고 혈관 확장을 촉진 합니다.
  5. 열 등 상 복 부, 깊은 대 퇴, 횡 방향 우회 및 표면 상 복 부가 동맥을 포함 하 여 대 퇴 동맥의 모든 지점과 함께 대 퇴 동맥의 전체 길이를 확보 하기 위해 조직의 둔 부를 계속 합니다 (그림 2a) .
  6. 외부 장 골 동맥 뿐만 아니라 슬와 및 사 골 동맥을 따라 더 해를 분해 한다 (도 2a). 조직 손상 으로부터 보호 하기 위해 정기적으로 염 수로 부위를 적셔 줍니다. 무딘 해 부는 대 퇴 홈을 따라 수행 되는 경우 (근육 사이) 근육을 절단 할 필요가 없다.
  7. 도 2b, C에 도시 된 바와 같이 정 맥과 신경 으로부터 동맥을 조심 스럽게 분리 한다. 동맥을 절단 하는 그들 사이 충분 한 공간을 가진 두 개의 관계를 배치 하 여 4.0 실크 봉합 사로 다이어그램에 의해 표시 된 동맥을 ligate. 이 관계는 외과 의사의 매듭 뒤에 4 개의 정사각형 매듭으로 수행 됩니다.
  8. 작은 멧 젠 바 움가 위를 사용 하 여 결 찰 된 동맥의 두 관계를 절단 합니다. 외부 장 골 동맥의 지점으로 그 근 위 원점 으로부터 대 퇴 동맥을 소비 하는 지점으로 bifurcates, 슬와 동맥을 형성 하 게 된다.

5. 반복 혈관 조 영 법

  1. 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 3 mm 스테인레스 스틸 볼을 사각형 근육의 윗부분에 부착 합니다. 제자리에 있는 후에 공을 통해 피부를 당깁니다.
  2. 혈관 확장을 높이기 위해 카 테 터를 통해 100 μ g의 글 리세 린 내 동맥 내 주사를 관리 합니다.
  3. 필요 하다 면, 카 테 터를 통해 토끼에 게 lidocaine 1%의 또 다른 0.8 mL를 투여 하 여 혈관 내에서 혈관 확장을 돕습니다.
  4. 자동 혈관 그래픽 인젝터를 사용 하 여 8-9 mL의 콘트라스트 미디어를 주입 합니다.
  5. 3.9 단계에서 설명한 바와 같이 혈관 조 영 술을 수행 한다.

6. 부상 폐쇄 및 회복

  1. 오른쪽 동맥에서 카 테 터를 제거 합니다. 이미 동맥 주위에 위치 하 고 있는 4-0 실크 봉합 사를 사용 하 여 동맥을 묶습니다.
  2. 두 상처가 닫힌 봉합. 연속 봉합 사 패턴의 4-0 폴 리 옥 시 원 또는 3-0 polyglactin 910을 사용 하 여 근육 및 subcuticular 레이어를 닫습니다 ( 재료 표참조). 4-0 폴 리 옥 시 에틸렌 또는 4-0 polyglactin 910를 사용 하 여 피부를 닫고 역방향 절단 바늘에 ( 재료 표참조) 묻혀 있는 연속 subcuticular 봉합 사 패턴.
    참고: 가능한 경우, 다이 옥 타 원 모두에 대해 바람직하다.
  3. 25 G 바늘로 주사기를 사용 하 여 절 개에 가까운 0.25% bupivacaine의 피 내 주사를 관리 하십시오. 바늘을 삽입 하 고 바늘을 다시 당기는 동안 0.5 mL를 주사 하십시오. 목에 절 개 (목에 두 개의 주사) 및 다리에 절 개에 대 한 상처의 측면 당 두 개의 주사에 대 한 상처의 측면 당 하나의 주사를 제공 (다리에 4 개의 주사; 총 여섯 주사). 주입 된 총 부피는 3ml(0.5 mL x 6 주사) 이다.
  4. 0.12 밀리 그램/kg에 멜 록 시 캄 및 서방 형 부 프레 노르 핀 0.5의 피하 주사를 투여 한다.
  5. 마 취에서 회복 토끼를 모니터링 합니다. 토끼는 마 취에서 깨어났을 때 자동으로 삼키기 시작 합니다. 삼 킴 반응이 일어나면 기관 내 튜브를 제거 하십시오. 토끼가 심혈 관 기능과 체온을 유지할 수 있을 때까지 가까운 모니터링과 열 지원을 제공 합니다. 그것은 통을 할 수 있게 되 면 그 인클로저에 토끼를 돌려줍니다.
  6. 토끼가 수술 후 차 우를 용납 하지 않는 경우에 피하 식 염 액과 함께 중요 한 배려 규정식의 신선한 야채 및/또는 주사기 먹이를 사용 합니다. 양배추, 브로콜리, 콜 리 플라워, 당근 등 제철 채소를 사용할 수 있습니다. 야채를 조각 하 고 함께 혼합 하 여 토끼가 먹기로 돌아가는 것을 돕습니다.

7. 모니터링

  1. 2.8 단계에서 설명한 바와 같이 양 다리에 혈압을 얻기 위해 2 주마다 토끼를 마 취 시켰다. 혈액 화학 분석에 사용 하기 위해 귀의 중앙 동맥에서 혈액을 수확 합니다. 양자 택일로, 정 맥 또는 두 부 정 맥에서 혈액을 취할. 각 시점에서 약 2 mL를 복용 하십시오. 분석을 위해 표준 혈액 화학 패널을 사용 합니다. 필요한 경우 저밀도 지 단백질 (LDL), 고밀도 지 단백질 (HDL) 또는 헤모글로빈 A1c (HbA1c)에 대 한 테스트를 추가 합니다.
  2. BGL 측정을 위해 매우 적은 양의 혈액을 섭취 하십시오.

8. 치료

  1. 치료, 담 체 및 가교 링커로 10 개의 주사기를 준비 합니다. 100 μ l의 칼슘 설 페이트 슬러리를 사용 하기 직전에 각각의 주사기를 채운 다음, 성장 인자 또는 알 긴 산 나트륨과 함께 2% 소 듐 알지 네이트의 100 μ l를 주사기의 팁에 가장 근접 하 게 한다.
  2. 다음을 준비 하기 전에 근육에 준비 한 주사를 관리. 이는 알 긴 산이 주사기에서 황산 칼슘과 상호작용 하는 시간을 감소 시킨다. 허벅지에 대 퇴 동맥의 양쪽을 따라 고르게 주사를 공간. 균일 한 주사를 달성 하기 위해, 다른 연구19에 기술 된 바와 같이, 주입을 안내 하는 구멍이 있는 실리콘 시트를 생성 한다. 이것은 시판 되는 실리콘 시트에 구멍을 만들기 위해 생 검 펀치를 사용 하 여 쉽게 준비할 수 있습니다.

9. 종점 혈관 조 영 술, 안락사, 관류 고정 및 조직 수확

  1. 종점 날짜에서 3 단계에서 설명한 바와 같이 혈관 조 영 법을 수행 하 되, 접근을 위해 왼쪽 경 동맥을 사용 한다.
  2. 혈관 조 영 술 후, 동물을 네 롭 시 테이블로 옮기고, 뒷 사지 조직을 보존 하기 위해 관류 고정을 수행 합니다.
    1. 아이 소 루 레인을 3%-4%로 증가 시키고 마 취를 충분히 깊이 확인 하기 위해 발가락 핀치를 수행 합니다.
    2. 정 맥의 헤 파 린 1000-2000 IU를 관리 하십시오.
    3. 흉 곽의 중간 선을 따라 절 개를 만들고 #20 블레이드가 있는 메스를 사용 하 여 다이어 프 램의 길이를 확장 합니다.
    4. 리브 케이지를 노출 시킨 후 리브 커터를 사용 하 여 중간 선 왼쪽의 리브를 자릅니다. 심 박수를 사용 하 여 심장을 노출 시킵니다.
    5. 내부 직경이 1/8 인치이 고 끝에 18G 바늘이 있는 출력 튜브가 있는 펌프를 설정 합니다. 식 염 액으로 라인을 미리 로드 하 고 관류를 위한 별도의 용기에서 제조 된 염 분 및 포 르 말린 적어도 600 mL을 갖는다.
    6. 심장의 꼭대기를 통해 좌 심 실로 펌프에 연결 된 18 G 바늘을 삽입 하십시오. 다른 18 G 바늘 (아무것도 첨부 되지 않음)을 우 아 트리 움에 삽입 하 고 혈액이 네 롭 테이블의 하향 구배에 흘러 들어갈 수 있게 하십시오.
    7. 관류 펌프를 사용 하 여 심장에 생리 식 염 수의 약 500 mL의 흐름을 제어 합니다. 유량 110 mL/min으로 펌프 설정을 사용 하십시오.
    8. 심장에서 나오는 유체가 맑은 되 면, 식 염 수 저장소에서 튜브를 10% 포 르 말린 용액으로 채워진 하나에 옮깁니다. 관류가 제대로 작동 하는 경우 경련은 네 사지 모두에서 발생 합니다. 포 르 말린 용액을 좌 심 실에 약 500 mL의 펌프.
    9. 펌프를 끄고 심장에서 바늘을 제거 하십시오.
  3. #20 잎을 가진 메스로 엉덩이 관절 주위를 절단 하 여 엉덩이에서 양쪽 뒷 다리를 제거 하십시오. 작은 늑 골 절단기를 사용 하 여 사지를 제거 합니다. 비 허 혈 성 사지를 대조 군으로 사용 한다.
  4. 사지를 4 ° c에서 24 시간 동안 포 르 말린에 저장 하 고 4°c에서 70% 에탄올에 저장 하였다.
  5. 조직학 분석을 위해 사지에서 여러 생 검을 복용 하십시오. 우리는 두 팔 다리에 허벅지와 송아지를 가로질러 지역에서 찍은 8 개의 6mm 생 검을 사용 했습니다.
    참고: 발목 혈압 측정 및 혈관 조 영 술은 혈 류의 회복을 측정 하는 데 가장 일반적으로 사용 되는 방법 이지만, 다른 방법은 도플러 초음파, 레이저 도플러 이미징, 적외선을 포함 한 동물의 회복을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다. 서 모그래피 62, 마이크로 스피어는관류 63,64, 전산화 단층 촬영 및 자기 공명 영상 (MRI)65을 결정 했습니다.

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결과

당뇨병의 유도 및 0.1% 콜레스테롤 다이어트의 개시에 따라, 당뇨병 및 콜레스테롤 식이와 함께 토끼에 대 한 총 콜레스테롤은 123.3 ± 35.1 Mg/dl (수 컷 토끼)의 평균 전체 시간 지점과 토끼 였다. 이들 토끼에 대 한 BGL 레벨은 248.3 ± 50.4 Mg/dl (수 컷 토끼) 이었다. 일반적인 토끼의 혈액 화학 및 다리 혈압 비에 대 한 시간 과정은 더 높은 콜레스테롤 다이어트 (1% 콜레스테롤) 아?...

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토론

우리는 토끼에서 당뇨병과 고 지 혈 증으로 뒷 다리 허 혈을 유도 하기 위한 전 임상 모델을 제시 했습니다. 많은 연구에서, 토끼에서 뒷 다리 허 혈을 만드는 데 사용 되는 기술에 모호함이 있습니다. 생쥐에서, 허 혈의 중증도 및 회복은 국 소 빈 혈을 유도 하는데 사용 되는 결 찰 및 기술 위치에 크게 의존 한다. 이 작업에서 제시 된 기술의 중요성은 당뇨병 동물에서 8 주 후에 완전히 회복 되지 ?...

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공개

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감사의 말

저자 들은 국방부의 의회 의원 지향 연구 프로그램 (DOD CDMRP)을 통해 기금을 기꺼이 인정 한다. W81XWH-16-1-0582)를 ABB 및 RS에 제공 합니다. 저자는 또한 미국 심장 협회 (17IRG33410888), DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) 및 국립 보건 연구소 (1R21EB024147-11A1; 1R01HL141761-01)를 통해 ABB에 게 자금을 인정 합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium ChlorideHenry Schein Medical1537468 / 1531434250 mL bag / 1000 mL irrigation btl
1 mL SyringeVWRBD309628
10 mL SyringeVWRBD309695
10% FormalinFisher-Scientific23-245684
18G NeedleVWR89219-294
20G NeedleVWR89219-340
25G NeedleVWR89219-290
27G NeedleVWR89219-288
5 mL SyringeVWRBD309646
5% DextrosePatterson Veterinary07-800-9689
AcepromazinePatterson VeterinaryVEDC207
AlfaxalonePatterson Veterinary07-891-6051
AlginateSigma-AldrichPHR1471-1G
Alloxan MonohydrateSigma-AldrichA7413
Angiography EquipmentToshibaInfinix-i
Angiography InjectorMedrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-11032Secondary Antibody for IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11008Secondary Antibody for IHC
a-SMA AntibodyAbcamab5694Primary Antibody for IHC
BaytrilBayer Animal Health724089904201Enrofloxacin
Blood Chemistry PanelIDEXX2616Rabbit Panel
Blood Pressure CuffWelchAllynFlexiport Disposable BP Cuff-infant size 7
Blood Pressure MonitorVmed TechnologyVmed Vet-Dop2
BupivacaineHenry Schein Medical6023287
BuprenorphinePatterson Veterinary42023017905
Buprenorphine SRZooPharm
Calcium SulfateCB MineralsFood and Pharmaceutical Grade USP and FCC
Chlorhexidine ScrubPatterson Veterinary07-888-4598
ChloroformFisher-ScientificC298-4
CholesterolSigma-AldrichC8503
DAPIThermo Fisher Scientific62248
Ear Vein CatheterPatterson VeterinarySR-OX165Surflo IV catheters
Endotracheal tubePatterson VeterinarySheridan Brand, Depends on Rabbit Size
GlucometerAmazonB001A67WH2Accu-Chek Aviva
Glucometer Test StripsMcKesson Medical-Surgical788222Accu-Chek Aviva Plus
GuidewireBoston Scientific39122-01
Hair ClippersAmazonB000CQZI3QOster #40 blade
Heating PadCincinnati Subzero273
Heating Pad PumpGaymarGaymar T/Pump
HemostatFine Science Tools13009-12Curved Mosquito Hemostat
HeparinPatterson Veterinary
Insertion ToolMerit Medical SystemsMAP550metal wire insertion tool
InsulinHPB PharmacyNovalin R & Novalin N
Insulin SyringesMcKesson Medical-Surgical942674
IntroducerCook MedicalG289543F Check Flo Performer Introducer
IsofluraneHenry Schein Medical1100734
KetaminePatterson Veterinary856440301
Lactated RingersMcKesson Medical-Surgical186662
LidocaineMcKesson Medical-Surgical239936
Lidocaine/Prilocaine creamMcKesson Medical-Surgical761240
LigaloopV. MuellerCH117 / CH116White Mini / Yellow Mini
Mazola Corn OilAmazonB0049IIVCI
Medrad SyringeMcKesson Medical-Surgical346920150 mL
MeloxicamPatterson Veterinary
Metal ball suturesEthicon-Johnson & JohnsonK891H4-0 silk C-1 30"
Metzenbaum ScissorsFine Science Tools14019-13
MidazolamHenry Schein Medical1215470
NitroglycerinMcKesson Medical-Surgical927528
PECAM AntibodyNovus BiologicalsNB600-562Primary Antibody for IHC
Perfusion PumpMasterflex
Pigtail CatheterMerit Medical Systems1310-21-00533F pigtail
Polydioxanone (PDS II) sutureMcKesson Medical-Surgical1292714-0 taper RB-1 (needle comes on suture)
Polydioxanone (PDS II) sutureMcKesson Medical-Surgical1290314-0 reverse cutting FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) sutureButler7233-413-0 taper RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) sutureMcKesson1043734-0 reverse cutting FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa)LabDiet5321
Rabbit RestrainerVWR10718-000
Rib CuttersV. Mueller
ScalpelFine Science Tools10003-12
Scalpel BladeFine Science Tools10015-00#15 blade
Silk SuturesEthicon-Johnson & JohnsonA183H4-0 silk ties 18"
Stainless Steel BallMcMaster-Carr1598K233-mm diameter
Surgical DrapesGepco8204S
Syringe PumpDRE VeterinaryVersaflow VF-300
Visipaque contrast mediaMcKesson Medical-Surgical509055
Weitlaner RetractorFine Science Tools17012-13

참고문헌

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