CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

요약

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

초록

CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)로 표현되는 유전자 편집 뉴클레아제는 생물 의학 연구에서 주류 도구가되고 있습니다. 형질전환에 의한 CRISPR/Cas9 원소를 표적 세포로 성공적으로 전달하는 것은 효율적인 유전자 편집을 위한 전제 조건이다. 이 프로토콜은 튜브 전기 천공 (TE) 기계 매개 된 CRISPR /Cas9 리보뉴클레오 프로테인 (RNP)과 단일 가닥 올리고덱시뉴클레오티드 (ssODN) 기증자 템플릿이 다양한 유형의 포유류 세포에 전달됨을 입증하고 강력한 것으로 이어집니다. 정확한 유전자 편집 이벤트. 먼저, TE는 토끼 섬유아세포에서 CRISPR/Cas9 RNP 및 ssODN을 전달하여 인터류키핀 2 수용체 소단위 감마(IL2RG) 유전자 및 세피압테린 환원효소(SPR) 유전자에서 질병을 유발하는 돌연변이를 유도하기 위해 적용하였다. 3.57%-20%의 정확한 돌연변이율은 세균 TA 클로닝 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이 달성되었다. 동일한 전략은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 미오신 결합 단백질 C, 심장 (Mybpc3), 및 헤모글로빈 소단위 베타 (HBB)를 포함한 여러 임상적으로 관련된 유전자에 인간 iPSCs에서 사용되었다. 일관되게, 고정밀 돌연변이율(11.65%-37.92%)을 달성했습니다. 깊은 시퀀싱 (DeepSeq)에 의해 결정됩니다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 RNP의 튜브 전기화가 포유류 세포에서 유전자 편집을 위한 효율적인 형질감염 프로토콜을 나타낸다는 것을 입증한다.

서문

CRISPR/Cas9는 유전자 편집을 위해 가장 일반적으로 사용되는 프로그래밍 가능한 뉴클레아제입니다. 그것은 게놈에 있는 단 하나 가이드 RNA (sgRNA)-측량 둘 다 표적 서열 및 인접한 protospacer 인접 한 모티프 (PAM) 서열을 통해 작동합니다. Cas9 뉴클레아제는 PAM 서열^1의상류에 위치한 이중 가닥 DNA 브레이크(DSB)를 생성한다. DSB는 오류가 발생하기 쉬운 비상동성 엔드 접합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR) 경로를 통해 수리됩니다. HDR 통로를 통해 정밀한 유전자 편집을 달성하기 위해, 기증자 템플릿은 종종 플라스미드 DNA (pDNA) 또는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN)의 형식으로 제공됩니다.

CRISPR/Cas9 및 sgRNA는 세 가지 형식으로 세포에 전달될 수 있다: Cas9 단백질및 gRNA^2,3; Cas9 mRNA 및sgRNA 4,^5; 또는 플라스미드 DNA(pDNA)는 필요한 프로모터, 구동sgRNA 및Cas9 코딩 영역 6,^7,8을함유한다. 많은 단은 CRISPR/Cas9가 RNP로 전달될 때, 유전자 편집 효율성이 수시로 핵산^9에비교된 RNP의 훨씬 더 작은 크기에 기인하는 pDNA 또는 mRNA 형식에서 달성된 것을 능가한다는 것을 설명했습니다. 더욱이, 신규한 튜브 전기천공(TE) 기계가 여러 세포 유형 9에서 유전자편집 응용 분야에서 특히 효과적이라는 것을 이전에 보여주었다.

본 서에 제시된 여러 임상적으로 관련 있는 동위에서 상이한 종의 포유류 세포에 CRISPR/Cas9 RNP의 전달을 위한 TE를 활용하는 단계별 프로토콜이다. 이 새로운 TE 형질 감염 기술 및 높은 HDR 속도 현상은 생물 의학 연구에서 광범위한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 유지 보수, 관리 및 사용 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 세포의 준비

1. 미국 식 문화 컬렉션(ATCC)에서 인간 iPSCs(ACS-1030)를 획득합니다. 피더없는 세포 배양 배지를 가진 인공 세포 외 매트릭스상에 대한 배양 iPScs(재료 표 참조)를 공급자의 지시에 따라 세포 배양 인큐베이터(37°C에서 5% CO2).
   1. 2 시간 전에, 10 μM Rho 연관, 코일 코일 코일 단백질 키나아제 (ROCK) 억제제 Y27632 (사용으로 해리 된 인간 hiPSCs의 자멸을 감소시키고 hiPSCs의 생존 및 복제 효율을 증가시킵니다. 그들의 다능성에 영향을 미칩니다).
   2. 트랜스펙팅 시, 세포 분리 용액으로 iPSCs를 해리(재료 표참조)를 37°C에서 단일 세포로 5분 동안 계수한다.
2. 앞서^{설명한 바와}같이 토끼 귀 피부 조직 생검의 1차 배양을 이용하여 토끼 섬유아세포 배양을 확립한다.
   1. 0.5 cm x 0.5 cm 귀 피부 생검은 토끼 귀 끝에서 얻어진다. 귀 조직에서 머리카락을 면도하십시오.
   2. 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)로 2x를 헹구고 페니실린-스트렙토마이신을 5%로 헹구고 있습니다. 귀 조직을 새로운 6cm 조직 배양 접시로 옮은 다음 조직을 작은 조각으로 자릅니다 (~1.0 mm x 1.0 mm). 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 태아 소 세럼 몇 방울을 추가하십시오.
   3. 파쇄된 조직을 10cm 조직 배양 접시에 퍼뜨리고 배양 배지 10 mL를 추가합니다. 토끼 섬유아세포세포는 10% 태아 소 혈청을 가진 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 배양됩니다. 조직 배양 접시를 세포 배양 인큐베이터(37°C에서 5% CO2)에 넣는다.
   4. 도금 후 3 내지 5일 후, 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 세포를 2분 동안 소화시켰다.

2. gRNA 및 기증자 올리고스의 설계 및 합성

1. 각 유전자에 대해, 디자인 가이드 RNA는 온라인 도구를 사용하여 표적 궤양의 서열에 기초한다(예를 들어, http://crispor.tefor.net/>).
2. 관심의 DNA 서열에 붙여 넣습니다.
3. 게놈과 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 선택합니다. 입력 DNA 서열에서 가능한 가이드 서열은 출력 페이지에 표시됩니다. 예측 효율이 높고 오프 타겟 전위를 낮추는 gRNA를 선택하는 것이 좋습니다.
4. gRNA를 전사하기 위한 상용 공급업체에 의한 DNA 합성. 제조업체의 지침에 따라 gRNA 합성 키트를 사용하여 gRNA의 생체 외 전사를 수행합니다.
5. gRNA 합성 키트에 포함된 RNA 정제 마이크로 컬럼을 사용하여 gRNA를 정제한다. 농도를 측정한 다음 gRNA를 -80°C에서 저장합니다.
6. 각 돌연변이 부위에 대한 ssODN 공여자 템플릿을 디자인한다. ssODN은 IDT와 같은 상용 공급업체에서 합성할 수 있습니다. 일반적으로, 각 ssODN은 길이가 120-160 뉴클레오티드(nt)이며, 좌측 상동성 암에서 60-80 nt및 우측 상동성 암에서 60-80 nt로 구성된다. 편집된 DNA의 재절단을 방지하기 위하여는, PAM에 있는 침묵 돌연변이는 가능한 경우에 ssODN에서 소개되어야 합니다. CRISPR 절단 부위는 가능한 한 의도된 게놈 변화에 가깝게 위치해야 한다.

3. Cas9 RNP 및 ssODN의 튜브 전기 화기

1. 섹션 1에 설명된 대로 셀을 준비한다.
2. 전기 천공 완충액의 20 μL에서 2-3 x 10⁵ 세포를 다시 일시 중단하십시오. 피펫을 위아래로 조심스럽게 하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다.
3. Cas9 RNP 형질감염의 경우, 실온(RT)에서 0.67 μg의 gRNA를 10-15분 동안 으로 Cas9-NLS 단백질 2 μg를 프리믹스합니다. 다음으로, 형성된 RNP 복합체를 2 μg의 ssODN세포와 부드럽게 혼합한다.
4. 튜브 전기 천공 키트에서 제공하는 범용 핏 파이펫 팁을 사용하여 셀 혼합물을 20 μL 전기 화관으로 옮니다. 더 나은 전기 천공을 달성하기 위해, 전송하는 동안 기포의 형성을 피하려고합니다.
5. 전기 개공튜브를 전기 포더의 슬롯에 넣고 "Go"를 눌러 완료합니다. 각 셀 유형에 대한 제조업체의 권장 매개 변수를 따릅니다. 예를 들어, 인간 iPSCs 및 토끼 섬유아세포의 경우, 전압 세트는 420 V이고 펄스 시간은 30 ms. 성공적인 전기 천공 주기는 전기포더기의 디스플레이 화면에 펄스 보고에 의해 지시된다.
6. 전기천공 후, 인간 iPS 세포를 미리 온난된 Y-27632-함유 배양 배지의 1 mL로 옮기고 세포 배양 부위에 기재하였다. 토끼 섬유 아세포 세포의 경우, 10 % 태아 소 혈청으로 DMEM으로 옮기십시오.
7. 12개의 웰 세포 배양 플레이트중 1개의 웰에 재부유된 세포를 플레이트한다.
8. 매일 배양 매체를 변경합니다. Y-27632는 인간 iPSC 배양 배지 24시간 후 전기개공으로부터 제거된다.

4. 유전자 편집 사건 분석

1. 수확 세포 72 전기 후 시간. 인간 iPSCs를 위한 토끼 섬유아세포 또는 세포 분리 용액을 위한 트립신-EDTA를 사용하여 배양 플레이트로부터 세포를 다이제스트. 원심 분리 후, 350 mL의 포염 완충액(1M Tris HCl, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA; pH 8.0, 10% SDS)으로 세포를 재중단한 다음, 1 mL당 20 mg/mL 의 단백질아제 K 스톡을 20 μL을 추가한 다음 55°C에서 밤새 배양합니다.
2. 표준 절차를 사용하여 페놀 클로로포름으로 게놈 DNA를 추출합니다.
3. 고충실도 DNA 폴리머라제(polymerase)를 사용하여 표적 영역을 포함하는 100-200 bp DNA 단편을 증폭한 다음, 젤 추출 키트를 사용하여 젤 또는 PCR 미니 키트를 사용하여 직접 추출된 젤에서 DNA 단편을 정화합니다.
4. 세균 콜로니 시퀀싱에 의한 유전자 편집 효율을 결정하기 위해, 정제된 PCR 제품을 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 pCR4-TOPO 벡터로 리가제한다. 무작위로 세균 클론을 집어 들고 TOPO TA 복제 키트에서 제공하는 범용 시퀀싱 프라이머를 사용하여 인서트를 시퀀싱합니다.
5. 깊은 시퀀싱에 의한 유전자 편집 효율을 결정하려면 DNA 염기서열 분석 코어에서 CRISPR 앰플리온 시퀀싱을 위해 4.3단계에서 정제된 PCR 제품(~100-200bp)을 보냅니다.

결과

토끼 섬유 아세포에 Cas9 RNP 및 ssODN의 TE

포유류 세포에 대한 Cas9 RNP의 TE 매개 전달의 전체 과정은 도1에 예시되어 있다. 먼저, C231Y 및 Q235X 돌연변이는 IL2RG 유전자에서 생성되었고, R150G 돌연변이는 토끼 섬유아세포 세포에서 SPR 유전자에서 생산되었다. IL2RG 및 SPR 유전자에서 기능 상실 돌연변이는 각각 1차 면역결핍¹¹ 및 운동 및 인지 결핍(12)을 유발하는 것으로 알려져 있다.

특정 sgRNA 설계는 그림 2A에나와 있습니다. 대상 영역을 증폭하는 데 사용되는 프라이머는 표3에 나열되어 있습니다. ssODN의 시퀀스는 표1에 나와 있습니다. 유전자 편집 속도는 세균 TA 복제에의해 결정되었다(도 2B). IL2RG C231 궤적에서, 시퀀싱된 28개의 클론 중 하나(3.57%)가 정확한 C231Y 돌연변이를 운반, 네 (14.28%) 삽입 또는 삭제(indel) 돌연변이를 운반하고 나머지 23개(82%)를 와일드 타입이었다. IL2RG Q235 궤적에서 시퀀스된 27개의 클론 중 2개(7.41%)가 정확한 Q235X 돌연변이를 운반하고, 3개의 운반된 인델 돌연변이(11.11%)를 수행하였다. 나머지는 야생형이었다. SPG R150 궤적에서, 20 개의 클론 중 5 개 (25 %) 정확한 R150G 돌연변이, 10 (50%) deldel 돌연변이를 운반하고, 나머지는 야생 형이었다.

인간 iPSCs에 Cas9 RNP 및 ssODN의 TE

TE는 인간 iPSCs에 Cas9 RNP 및 ssODN을 전달하고 EGFR, Mybpc3 및 HBB 유전자에서 임상적으로 관련있는 궤위를 표적으로 하는 데 사용되었다. EGFR T790 근위 영역에서의 포인트 돌연변이는 EGFR^13의활성화 돌연변이를 항재하는 비소세포 폐암(NSCLC)의 환자에서 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성을 부여한다. Mybpc3에 있는 엑손 16에 있는 프레임 이동 돌연변이는 비대성 심근병증^14에서연루됩니다. HBB 유전자의 E6V 점 돌연변이는 겸상적혈구^15로이어집니다.

특정 sgRNA 설계는 그림 3A에나와 있습니다. 대상 영역을 증폭하는 데 사용되는 프라이머는 표3에 나열되어 있습니다. ssODN의 시퀀스는 표1에 나와 있습니다. 유전자 편집 속도는 DeepSeq(그림3B)에 의해 결정되었다. EGFR 궤적에서, 15.68%의 대문자는 정확한 점 돌연변이(6,315판독)를 운반하고, 22.75%는 인델 돌연변이(9,162 판독)를 수행했으며, 나머지 61.57%는 야생형(24,797개 판독)이었다. Mybpc3 궤적에서, 37.92%는 정확한 4-bp TGAA 삭제(11,654 reads)를 운반하고, 2.24%는 인델 돌연변이(410 판독)를 운반하고 나머지 59.84%는 야생형(18,692판독)이었다. HBB 궤적에서, 11.65%는 정확한 E6V 돌연변이(6,565reads)를 운반하고, 23.35%는 인델 돌연변이(13,163 판독)를 운반하고 나머지 65%는 야생형(36,644개 판독)이었다.

그림 1: Cas9 RNP의 튜브 전기 화의 흐름 차트.

그림 2 : 토끼 섬유아세포 유전자 편집. (A) 대상 시퀀스의 그림입니다. 상자는 대상 궤시를 나타냅니다. 밑줄이 그어진 문자는 gRNA 서열에 해당합니다. 빨간색 문자는 PAM 시퀀스를 나타냅니다. (B) 유전자 편집 이벤트의 TA 복제 결과. 상자는 정확하게 돌연변이된 로시를 나타냅니다. 도시된 인델 서열은 하나의 대문자 유형을 대표한다. 다른 인델 서열은 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 인간 iPSCs의 유전자 편집. (A) 대상 시퀀스의 그림입니다. 상자는 대상 궤시를 나타냅니다. 밑줄이 그어진 문자는 gRNA 서열에 해당합니다. 빨간색 문자는 PAM 시퀀스를 나타냅니다. (B) 유전자 편집 이벤트의 Deepseq 결과. 상자는 정확하게 돌연변이된 로시를 나타냅니다. 빨간색 문자는 기증자 템플릿에 도입 된 침묵 돌연변이를 나타냅니다. 도시된 인델 서열은 하나의 대문자 유형을 대표한다. 다른 인델 서열은 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

현장	올리고 시퀀스
(표적 돌연변이)
토끼 IL2RG (C231Y)	AGCGTGTGGCAAACTTACACGTTCCGGGGGTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCATTGGAGT 가트가그카카크카그그그그그그그그그그그카아액트카아그타아에이아에이트GCCTCT
토끼 IL2RG (Q235X)	AGCGTGGGGCAAACTTACACGTTCCGGGGGTTTTTTTTTTGTGTTTTTGGAGTTGGAGT 가트가그카카크카그그그그그그그그그그그카아액트카아그타아에이아에이트GCCTCT
토끼 SPR	gacctctctctctctggcttttttgcttttgctttgcttgcttgcttgcttgctttgcttgcttgcttgctttgcttttgctttgctgctgctttgcttgctttgctttgcttgcttgcttgcttgctgctgctttgcttttgcttgcttgctgctgctgctttgcttgctgctgctgcgcgggggcgctgcgcgcggggctgctgctgctgctgctgctgcgcgggcgctgcgcgcgggctgctgctgctgctgctgctgcgcgcggggctgctgctgc cgctgtac
(R150G)
휴먼 EGFR	ACGTGGTCCAGCGTGGGCACCCCCGTGCGCGCCTCTCTCTCTACACTACAACACCC AGCTGCCCTTGCGCCTCTTTTTTTACTTCTCCCAGTAC
(T790과 근접한 점 돌연변이)
휴먼 마이브pc3	GCCCTGTGCTCATGCGCCCCTTAGAGAGTGGGGGGGGGGGGGGGGGTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTGAGAGGGGGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTGAGAGGGGGGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTGAGAGGGGGGGGGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGGGGGGGGGGG GGGGGCGCAGTCAAATGGGGGGGGGCAT
(4-bp 삭제)
휴먼 HBB	TCTGACACAACTGTTTCACTCAACCCAAAACACCATTGCCTTGCCTTGTGGAGCTGCGCAGACTGCC CTGTGGGCAAGGTGAACGTGTGTGTG가그트그그그그그그GCTGCGCGCAG
(E6V)

표 1: ssODN 시퀀스.

단계	문제	가능한 이유	솔루션
2.1	낮은 인델 속도	가난한 가이드 RNA 디자인, 가이드 RNA 주식 >6 개월, 낮은 가이드 RNA 농도	재설계 가이드 RNA, 새로운 가이드 RNA를 생산/주문합니다.
2.3	낮은 PGE 효율	가난한 기증자 DNA 디자인, 낮은 효율적인 가이드 RNA, 기증자 DNA의 잘못된 양 또는 가난한 품질의 DNA	상동성 팔 길이를 증가, PAM 돌연변이를 소개, 기증자 DNA에 침묵 돌연변이를 소개, 보다 효율적인 가이드 RNA를 사용, 가이드 RNA를 통해 Cas9 단백질의 비율을 최적화.
3.4	실패한 변환	전지 버퍼 혼합물을 전기 관으로 이송하는 동안 형성된 기포, 잘못된 전압/지속 시간 설정	기포의 형성을 방지전압 / 지속 시간 설정을 조정하려고합니다.
3.6	전기 공광 후 낮은 세포 생존력	단일 인간 ipsc의 낮은 생존	전기 천공 후 ROCK 억제제추가, 세포의 수를 증가.
4.1	실패한 PCR	높은 GC 내용또는 반복시퀀스	PCR 상태를 최적화하고 PCR 시스템에 DMSO를 추가합니다.

표 2: 빈번한 문제에 대한 문제 해결 가이드입니다.

프라이머 이름	시퀀스	참고
RB-IL2RG-F	카가카그가그가그그트	토끼 IL2RG DNA 단편 증폭용
RB-IL2RG-R	TGCCAGAGACACAAGCGAAC
Rb-SPR-F	GTACTTTGGAGGGACAGAgg	토끼 SPR DNA 단편 증폭용
RB-SPR-R	CTCAGCACCCTGACACTG그
H-EGFR-F	T가트그카그GTGG가카악	인간 EGFR DNA 단편 증폭용
H-EGFR-R	ACCAGTTGAGAgACTGGG
H-Mybpc3-F	ATGCCGTGCTGAAC	인간 Mybpc3 DNA 단편 증폭용
H-Mybpc3-R	TCAGGGGAGCCAACCCAT
H-HBB-F	타크트가타카카아크GC	인간 HBB DNA 단편 증폭용
H-HBB-R	캣츠카트가카카액트

표 3: 4.3단계에서 사용되는 프라이머.

토론

튜브 전기 천공 방법은 CRISPR /Cas9 RNP 및 ssODN을 토끼및 인간 세포에 전달하여 강력한 정밀 유전자 편집 (PGE)을 이끌어 내는 데 효과적이었다. TE와 다른 기존의 전기 화기 장치의 주요 차이점은 두 개의 전극이 튜브의 상단과 하단에 있고 샘플이 전기 화시에 완전히로딩된 후 전체로 밀봉되는 튜브의 사용입니다(그림 1). 대조적으로, 기존의 큐벳에서, 전극은 측면에 있고 샘플은 전기 천공 중에 완전히 밀봉되지 않습니다. 이 새로운 디자인은 기포 생성을 줄이고 기포 크기를 압축하여 결과적으로 전기 전압의 균일한 분포를 개선하며 결과적으로세포 사멸 및 높은 형질 전환 효율 9을 유도합니다. 본 작품에서, 높은 PGE 비율 (15%-37%) 인간 iPSCs에서 EGFR, Mybpc3 및 HBB 유전자를 표적으로 하는 것을 달성했습니다. 이러한 결과는 인간 줄기 세포에서 높은 PGE 비율이 달성된이전 보고서와 일치합니다 9.

질병을 일으키는 돌연변이는 토끼 세포에서 IL2RG 및 SPR 유전자를 표적으로 하였다. 최근, IL2RG-녹아웃 토끼는 인간 X-연결된 심한 결합 면역 결핍(SCID-X1)^16,17에대한 모델로서 생산되고 있다. 본 작품은 환자 IL2RG 돌연변이(예를 들어, C231Y 및 Q235X)가 토끼 세포에서 효율적으로 생성될 수 있음을 보여주며, 환자 돌연변이를 운반하는 SCID-X1 토끼 모델을 생성할 수 있는 가능성을 입증한다. 또한 SPR R150G 돌연변이가 토끼 세포에서 효율적으로 생성될 수 있음을 입증하였다. 이 돌연변이는 아이들에 있는 모터 그리고 인식 적자를 일으키는 원인이 됩니다^12. 이러한 IL2RG 및 SPR 돌연변이 토끼 모델은 일단 생성되면, 번역 연구를 위한 귀중한 전임상 모델로 작용할 수 있다. 그(것)들은 또한 이 단원 질병을 위한 유전자 편집 기지를 둔 치료제를 설치하기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 응용 프로그램에 대한 한 가지 관심사는 오프 타겟 편집 이벤트입니다. 인델 비율은 앞서 설명한^방법9를 사용하여 본 연구에서 사용되는 sgRNAs에 대한 예측 상부 오프 타겟 사이트에서 분석되었다(표S1). 표 S2에나열된 프라이머를 사용하여 총 7개의 잠재적 상부 오프 타겟 로시를 sg-rb-IL2RG-01, sg-rb-SPR5, sg-hEGFR에 대한 7개, sg-hMybpc3에 대해 5개, sg-hHBB에 대해 7개, 7개의 잠재적 상부 오프-타겟 로시를 분석했다. 이러한 sgRNAs를 사용하여 CRISPR/Cas9 매개유전자 편집에 대한 최소한의 오프 타겟 위험을 나타내는 T7E1 검문(그림 S1)에 의해 오프 타겟 인델이 밝혀지지 않았습니다. 또한 튜브 전기 화 방법 자체가 오프 타겟 편집을 유발하거나 증가시키지 않음을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 바람직하지 않은 오프 타겟 편집을 줄이거나 제거하기 위한 노력이 전념해야 합니다. 전체 게놈 시퀀싱은 임상 적용에서 사용되는 세포에 대한 이러한 이벤트를 배제하는 데 필요할 수 있다.

기술적 수준에서, 다음은 CRISPR/Cas9 RNP 관 전기천공에 의하여 능률적인 정확한 게놈 편집을 달성하기 위한 중요한 요소로 간주됩니다. 먼저, 낮은 오프-타겟 전위를 가진 효율적인 sgRNA를 선택하는 것이 좋습니다. PEG 어플리케이션에 사용하기 전에 선택된 sgRNA의 인델 효율을 검증하는 것이 중요합니다. 유효성 검사 단계에서 양호한 sgRNA가 실패할 것으로 예측된 소프트웨어가 드문 일은 아닙니다.

둘째, 높은 PGE를 달성하기 위해, 가능하면 ssODN 공여물로 PAM 돌연변이를 유도하는 것이 좋습니다. 그 근거는 이렇게 함으로써, CRISPR/Cas9 기증자 템플릿 통합 후에 재절단이 방지된다는 것입니다. 특정 경우에, PGE 자체는 PAM 돌연변이를 소개합니다. 다른 경우에, PAM 서열에 침묵 돌연변이를 도입할 수 있다. PAM 돌연변이가 불가능한 경우에, sgRNA 서열에 대응하는 공여자에 몇몇 침묵하는 돌연변이를 포함하는 것을 시도하는 것이 좋습니다.

셋째, 특히 TE와 관련이 있는 것은, 세포 및 RNP 혼합물을 전기 천공 관으로 옮길 때 기포의 형성을 피하는 것이 중요하다. TE 튜브의 설계는 이미 기포 형성을 최소화하지만, 신중한 취급은 더욱 감소하고 심지어 기포 형성을 피할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질을 위한 튜브 전기포공의 적용에서 발생할 수 있는 빈번한 문제에 대한 트러블 슈팅 가이드는 표2에 제공된다.

결론적으로, 튜브 전기 천공은 높은 PGE 속도를 달성하기 위해 포유류 세포에 CRISPR / Cas9 RNP 및 ssODN의 전달을위한 효과적인 수단임을 입증한다. 이 새로운 TE 형질 감염 기술 및 그것의 강력한 정확한 유전자 편집 속도는 유전자 편집 응용 프로그램의 발달을 촉진할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	STEMCELL Technologies	792	Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.
Cas9 Nuclease 3NLS	IDT	1074182	Cas9 protein, first used in Step 3.3.
DMEM	Thermo Fisher	11965092	For cell culture, first used in Step 1.2.3.
DPBS	Thermo Fisher	1708075	For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.
EDTA	Lonza	51201	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
Electroporation buffer	Celetrix	13–0104	The electroporation buffer, first used in Step 3.2.
Electroporation tubes	Celetrix	20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104	The electroporation tube, first used in Step 3.4.
Electroporator	Celetrix	CTX-1500A LE	The tube electroporation machine, first used in Step 3.5
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	12003C	For cell culture, first used in Step 1.2.2.
Forma CO2 Incubators	Thermo Fisher	Model 370	For cell culture, first used in Step 1.1.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28115	For gel purification, first used in Step 4.3.
Human  induced pluripotent stem cells	American Type Culture Collection	ACS-1030	Human iPSCs, first used in Step 1.1.
Matrigel	Corning	354277	Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.
mTeSR 1 medium	STEMCELL Technologies	85850	Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.
PCR SV mini	GeneAll	103-102	For PCR product purification, first used in Step 4.3.
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163	For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.
Phenol-chloroform	Thermo Fisher	15593031	For DNA extraction, first used in Step 4.2.
Precision gRNA Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.
Proteinase K Solution	Thermo Fisher	AM2548	For DNA extraction, first used in Step 4.1.
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491	For PCR amplification, first used in Step 4.3.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
TA Cloning Kit	Thermo Fisher	K457502	For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.
Tissue Culture Dish (10 cm)	FALCON	353003	For cell culture, first used in Step 1.2.3.
Tissue Culture Dish (12 well)	FALCON	353043	For cell culture, first used in Step 3.7.
Tissue Culture Dish (6 cm)	FALCON	353004	For cell culture, first used in Step 1.2.2.
Tris HCl	Thermo Fisher	BP1757-500	For making lysis buffer, first used in Step 4.1.
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200056	For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.
Universal Fit Pipette Tips	Celetrix	14-0101	For electroporation, first used in Step 3.4.
Y27632	LC Labs	Y-5301	The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.