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요약

이 문서는 억제기를 사용하여 만성 적으로 고정 된 마우스에서 우울과 같은 행동의 유도에 대한 단순화 되고 표준화 된 프로토콜을 제공합니다. 또한, 우울증의 유도를 확인하는 행동과 생리 적 기술이 설명된다.

초록

우울증은 아직 완전히 이해되지 는 않지만 다양한 원인 요인이 보고되었습니다. 최근에는 우울증의 유병률이 증가하고 있습니다. 그러나, 우울증에 대 한 치료 치료 또는 우울증에 대 한 연구는 부족. 따라서, 본 논문에서, 우리는 운동 제한에 의해 유도된 우울증의 마우스 모델을 제안한다. 만성 가벼운 스트레스 (CMS) 우울증 같은 행동을 유도 하는 잘 알려진 기술. 그러나, 그것은 다양 한 가벼운 스트레스의 조합으로 구성 된 복잡 한 절차를 필요. 대조적으로, 만성 고정 응력(CIS)은 일정 기간 동안 구속기를 사용하여 움직임을 제한함으로써 우울한 행동을 유도하는 구속 모델에서 수정된 쉽게 접근할 수 있는 만성 스트레스 모델이다. 우울증유사 거동을 평가하기 위해, 자당 선호도 시험(SPT), 꼬리 현탁액 시험(TST), 및 ELISA 분석기는 마커 코르티코스테론 수준을 측정하는 본 실험에서 결합된다. 기재된 프로토콜은 CIS의 유도 및 우울증의 유효성 검사를 위한 행동 및 생리적 요인의 변화에 대한 평가를 설명한다.

서문

주요 우울 장애 (MDD)는 전 세계적으로 정신 장애의 주요 원인이며, 예상보다 빠르게 증가하고 있는 발병률을 가지고 있습니다. 2001년에, 세계 보건 기구는 MDD가 2020년까지 세계에서 두 번째로 일반적인 질병이 될 것이라고 예측했습니다. 그러나, 그것은 이미 2013 1에서두 번째로 가장 일반적인 이었다 . 또한, 현재 항우울제는 지연효과성, 약물내성, 재발, 및 각종 부작용2,3등 많은 한계를 가지고 있다. 따라서 연구원은 더 효과적인 항우울제를 개발 해야 합니다. 그러나, MDD의 모호한 병리생리학은 새로운 항우울제의 발달에 장애물을 제시합니다.

장기적인 스트레스는 MDD의 주요 위험 요소입니다. 그것은 또한 MDD 병인학4,5와관련이 있는 시상 하부 뇌하수체 부신 (HPA) 축에 있는 역기능을 유도할 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, HPA 축은 코르티코스테론 수준을 6, 7,8,증가시킴으로써 우울증 및 불안 장애를 포함한 스트레스 유발 정신병리생리학에 중요한 역할을 한다. 9. 많은 동물 모델은 MDD4환자에서 관찰되는 HPA 축의 지속적인 활성화를 기반으로합니다. 더욱이, 만성 스트레스에 의해 유도된 높은 글루코코르티코이드 및 피하 주사된 글루코코르티코이드는 신경 세포 사멸, 신경 과정의 위축 및 설치류의 뇌에서 성인 신경 발생 감소와 함께 우울한 행동을 일으킵니다10 , 11. 우울증과 관련된 또 다른 중요한 뇌 영역은 내측 전두엽 피질 (mPFC)입니다. mPFC는 시상 하부 및 편도체와 같은 뇌 소전체를 제어하는 데 중요한 역할을하며,정서적 행동과 스트레스 반응을 제어하는 8,9. 예를 들어, 등쪽 mPFC내의 병변은 구속스트레스12,13으로인한 HPA 축 기능 장애 및 향상된 코르티코스테론 분비를 유도한다. 최근 연구는 또한 반복 억제 스트레스 증가 코르티코스테론 수준을 보여 주었다, 이는 mPFC에서 뉴런과 성상 세포 사이의 글루타민글루타민 주기를 통해 글루타민 보충에 의해 감소 될 수있다 9.

MDD의 병인학을 연구하는 데 사용되는 최초의 만성 스트레스 패러다임은 Katz14에의해 제안되었습니다. Willner 등은 카츠의 연구 결과에 기초하여 만성 경미한 스트레스(CMS) 모델을 제안했습니다. 그(것)들은 항우울제가 CMS 유도된 anhedonic 같이 행동15,16를복구한다는 것을 관찰해서 모형이 예측 타당성이 있었다는 것을 확인했습니다. 일반적으로 CMS 모델은 온화한 소음, 케이지 틸팅, 젖은 침구, 변경된 밝은 어두운 주기, 케이지 흔들림, 강제 수영 및 사회적 패배와 같은 다양한 경미한 응력의 조합으로 구성됩니다. CMS 모델은 연구원에 의해 널리 이용됩니다; 그러나 이 모델은 복제성이 좋지 않으며 시간 및 에너지 가 비효율적입니다. 따라서 우울증을 평가하기 위한 우울과 같은 행동과 생리학적 분석의 유도를 위한 표준화되고 단순화된 프로토콜에 대한 수요가 증가하고 있다. CMS 모델에 비해 만성 고정 응력(CIS; 만성 구속 응력이라고도 함) 모델은 더 간단하고 효율적입니다. 따라서 CIS 모델은 만성 스트레스 연구17, 18,19,20,21,22,23에서널리 사용될 수 있습니다. 24. 또한, CIS는 우울한 행동을 개발하기 위해 남성과 여성 마우스 모두에서 사용할 수 있습니다25,26. CIS 동안, 동물은 2 주 또는 4 주동안하루에 1-8 시간 동안 몸에 맞는 크기의 실린더에 배치됩니다 9,27,28. 이들 중, 2주 동안 하루 2시간 동안 구속 스트레스 상태는 마우스9,28에서최소한의 통증으로 우울한 행동을 일으키기에 충분하다. 구속 조건하에서 혈액 코르티코스테론 수준은9,28,29로급속히 증가했습니다. 여러 연구는 CIS 모델이 예측 타당성을 가지고 있음을 보여 주었다, CIS 유도 우울증과 같은 증상이 항우울제에 의해 복원되는 것을 확인19,20,30,31. 본 명세서에서, 우리는 마우스에서 CIS 후 일부 행동 및 생리학적 결과뿐만 아니라 CIS의 상세한 절차를 보고한다.

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프로토콜

모든 실험 프로토콜과 동물 관리는 경상대학교 동물연구위원회(GLA-100917-M0093)의 지침에 따라 수행되었다.

1. 재료

  1. 마우스
    1. 출생 후 주 7에서 22-24g의 무게C57BL/6 스트레인 배경의 남성을 사용하십시오. 실험 전 1주일 동안 번식실에서 습관화하십시오.
      참고: 모든 마우스는 실험실 동물 회사에서 구입했습니다.
    2. 집 마우스는 온도 제어 사육장 (22-24 °C) 12 시간 빛 / 어두운 주기 (6 : 00 A.M.에 조명)에서 일반 실험실 차우와 물 사용 가능한 광고 리비툼.
  2. 구속자
    1. 원통형, 투명, 아크릴 탱크 (높이 = 8.5 cm, 직경 = 2.5 cm)를 정사각형 받침대에 고정하여 억제하고 우울한 행동을 생성합니다 (그림1A). 이 실린더의 직경은 마우스가 앞뒤로 또는 뒤로 움직일 수 없도록 바디에 맞게 만들어졌습니다. 제자는 상업적으로 구입하거나 실험실에서 만들 수 있습니다.
  3. 테일 서스펜션 장치
    1. 반투명 아크릴로 만든 적당한 크기의 꼬리 서스펜션 상자를 사용합니다 (높이 = 30cm, 너비 = 20cm, 길이 = 20, 그림 1B). 동물 간의 상호 작용을 방지하기 위해 바닥과 네 개의 벽의 세 아크릴 플레이트에 의해 차단되도록 상자 내에서 직사각형 파티션을 사용합니다. 비디오 녹화를 허용하고 가로 막대를 고정하기 위해 상자의 나머지 두 면을 열어 둡니다. 상자는 상업적으로 구입하거나 실험실에서 만들 수 있습니다.
  4. 비디오 녹화 장치 및 비디오 추적 소프트웨어
    1. 컴퓨터와 삼각대(또는 기타 지원 제품)에 연결된 흑백 디스플레이 폐쇄 회로 텔레비전 카메라(재료 표참조)를 사용하여 행동 실험을 기록할 수 있습니다. 비디오 녹화는 적어도 2개의 마우스가 동시에 시험되기 때문에 본 실험에서 행동 점수를 허용하는 데 필수적이다.
    2. 연결된 컴퓨터에 설치된 비디오 추적 소프트웨어(자료 표참조)를 사용하여 비디오 데이터를 분석할 수 있을 만큼 카메라 해상도가 충분히 높은지 확인합니다.

2. CIS 구속에 의한 우울증의 유도

참고: 마우스를 부드럽게 다루지만 안심하고 단단히 다루십시오. 거칠고 잠정적인 처리는 실험의 또 다른 스트레스 요소이며 마우스가 어려움을 겪고, 물고, 긁히는 중요한 이유입니다.

  1. 디지털 럭스 미터를 사용하여 실내 조명을 조명 (200 Lux) 조건으로 설정하십시오.
  2. 테스트 하기 전에 적어도 일주일 별도 케이지에 마우스를 집에 하 고 실험 전에 적어도 30 분 동안 테스트 룸에 마우스를 배치.
    참고: 실험 전에 적어도 하루에 한 번 이상 마우스를 처리하여 실험자에게 친숙해지십시오. 실험 전에 적응 기간은 마우스가 시험실과 같은 상황에 적응할 수 있도록 하는 것이 필요하다.
  3. 마우스 꼬리를 가볍게 잡고 마우스를 긴장하지 않도록 한 다음 거친 표면(케이지 또는 케이지 뚜껑의 와이어 바 상단)에 조심스럽게 놓습니다.
  4. 작은 흰색 수건으로 구속기를 덮은 다음 마우스가 자발적으로 구속구에 들어가지 않도록 절제기의 개구부에서 마우스를 부드럽게 놓습니다.
    참고:이 경우 마우스는 구속조건으로 들어가는 것과 반대 방향으로 배치됩니다. 마우스를 자발적으로 구속기로 들어가도록 하기 위해, 구속기는 내부를 더 어둡게 만들기 위해 작은 수건으로 덮여 있습니다.
  5. 꼬리, 발, 고환 등 신체가 손상되지 않도록 주의하면서 마우스를 가능한 한 단단히 고정하도록 클로저를 놓습니다.
  6. 마우스를 15일 연속 으로 2시간(오전 9:00~11:00)에 제한합니다.
  7. 체중과 음식 섭취량을 측정48 제자에 노출하는 동안 시간 당 (즉, 운동 구속의 개시 전에 48 시간 동안 음식 섭취 량).
    참고: 체중과 음식 섭취량을 측정할 때 CIS 기간 동안 테스트 룸의 홈 케이지에 제어 마우스를 놓습니다. 다른 환경 적 요인이 CIS 마우스와 동일한지 확인합니다.
  8. 자당 선호도 테스트(SPT) 및 꼬리 현탁액 검사(TST)와 같은 행동 테스트를 수행하여 우울증의 유도를 확인합니다(단계 4 및 5 참조).
  9. ELISA 분석을 사용하여 스트레스 마커 코르티코스테론을 측정하여 우울증의 유도를 확인합니다(섹션 6 참조).

3. 자당 선호도 테스트

  1. 시험하기 전에, 2개의 마시는 병 (0.1 M 자당을 포함하는 다른 하나는 일반 물을 포함하는 1개)의 존재에 마우스를 습관화하십시오 48 시간 동안. 24 시간 후에 2개의 병의 위치를 전환하여 측면 편향에 의해 생성된 혼란을 감소시소.
  2. 3 일째에, 24 시간 동안 물 마우스를 박탈하십시오.
  3. SPT 실험 당일, 마우스를 6시간 동안 2개의 음주 병에 노출시다. 3 시간 후, 물병의 위치를 전환합니다.
  4. 소비된 자당 용액과 물의 부피(mL)를 기록한 다음 동물의 자당에 대한 친화성을 계산합니다.
  5. 일반적으로, 시험 도중 총 유체 소비에 대한 자당 소비량의 백분율로 자당 선호도를 계산합니다.

4. 꼬리 서스펜션 테스트

  1. CIS 유도 마우스를 TST를 시작하기 최소 30분 전에 시험실로 가져온다.
  2. 실내 조명을 어둡게(50 Lux) 조건으로 설정합니다.
  3. 가장 높은 해상도의 비디오 파일을 얻으려면 카메라를 가능한 한 마우스에 가깝게 놓습니다(마우스에서 약 40cm).
  4. 셀로판 접착 테이프(꼬리 끝에서 의 거리는 1cm)를 사용하여 수평 막대(하단에서 30cm)에서 마우스를 단단히 일시 중단합니다. 다른 스트레스 원을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 마우스에 테이프를 적용하는 과정을 완료하십시오.
  5. 마우스가 서스펜션 박스 중간에 놓이면 기록을 시작하고 6분 동안 지속적으로 행동 변화를 관찰합니다.
    참고: 마우스가 꼬리를 오르려고 하면 스틱이나 오르막을 이용해 서 두십시오.
  6. 실험이 끝나면 마우스를 홈 케이지로 옮기고 꼬리에서 테이프를 조심스럽게 제거합니다.
  7. 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 모바일 기간의 누적 시간을 분석합니다.
    참고: 부동 기간은 가장 중요한 CIS 매개 변수입니다. 이는 소프트웨어의 레벨 필터링 장치에 포함된 모션 임계값의 관점에서 정의된 움직이지 않는 기간의 누적 시간으로 계산될 수 있다.

5. ELISA에 의해 혈액에서 코르티코스테론 수준을 측정

참고 : 행동 테스트 후 하루, 마우스는 혈액 수집을 위해 희생된다.

  1. 마취될 때까지 유도 챔버에서 5 % 이소플루란으로 마우스를 마취시다. 마우스가 수술 중 깨어나지 않도록 유도 챔버 (적어도 2 분)에 충분한 시간을 가지고 있는지 확인하십시오.
  2. 1 mL 주사기를 사용하여 심장에서 혈액을 수집하고 K3EDTA가 들어있는 혈관에 혈액을 얼음에 저장합니다 (오전 9시)
  3. 4 °C에서 15 분 동안 1,000 × g에서 원심 분리에 의해 플라즈마를 분리합니다.
  4. 제조업체의 프로토콜에 따라 코르티코스테론 ELISA 키트를 사용하여 플라즈마 코르티코스테론 수준을 정량화합니다(재료 표참조).

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결과

대표적인 실험에서, 모든 데이터는 그룹당 6-8마리의 마우스로부터 획득하였다. 대표물질과 마우스를 제자내로 자발적으로 삽입하는 방법은 도1에 도시되어 있다.

CIS 유도 후 행동 시험 및 혈액 샘플링을 수행하기 위해, 마우스는 도 2A에요약된 바와 같이 실험 절차를 실시하였다. 도 2 및 도

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토론

MDD의 두뇌와 이질성의 복잡성은 조건을 완전히 재현하는 동물 모형을 만드는 것을 어렵게 만듭니다. 많은 연구자들은 안구토니아 (보람있는 자극에 대한 관심의 부족)와 절망이 동물 모델에서 진화적으로 보존되고 정량화 가능한 행동으로 간주되는 내시경 형 기반 접근법32를사용하여이 어려움을 극복했습니다. 이는 또한 우울증 환자에서 볼 수 있습니다33. 본...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 교육부(NRF-2015R1A5A5A2008833 및 NRF-2016R1D1D1D1A33934279)의 지원을 받아 국립과학연구재단(NRF)을 통해 지원되었다. 경상대학교 GNU-2016-02)

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml disposable syringesSungshim MedicalP000CFDO
BalanceA&D CompanyFX-2000i
Ball nozzleJeung Do B&PJD-C-88
CCTV cameraKOCOMKCB-381
Corticosterone ELISA kitsCayman Chemical
Digital lux meterTESTES-1330A
Ethovision XT 7.1Noldus Information Technology
IsofluraneHANA PHARM CO., LTD.Ifran solution
MiceKoatechC57BL/6 strain
RestrainerDae-jong Instrument IndustryDJ-428
Saccharose (sucrose)DAEJUNG7501-4400
Small animal isoflurane anaesthetic systemSummit
Acrylic barThe apparatus was made in the lab for TST test
Tail suspension boxThe apparatus was made in the lab
TimerElectronics TomorrowTL-2530
Water bottleJeung Do B&PJD-C-79

참고문헌

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