무선 비디오-EEG 시스템 사용으로 측면 유체-타악기 유도 외상성 뇌 손상 다음 간질 방전 모니터링

요약

여기서 우리는 성인, 수컷 위스타 래트에서 측면 유체 타악기 손상(FPI) 모델을 사용하여 심한 TBI를 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 연속적인 비디오 EEG 기록을 수집하고 외상 후 간질 발생과 일치하는 간질 방전을 모니터링하기 위해 무선 원격 측정 시스템의 사용을 입증합니다.

초록

측측액 타악기 상해 (FPI) 모형은 잘 설치되고 TBI 및 외상 후 간질 (PTE)를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 그러나, 상당한 가변성은 이 모형을 채택한 다른 연구 결과에서 사용된 특정 매개변수를 위해 보고되었습니다, 실험실 사이 결과를 조화하고 해석하는 것을 어렵게 만들기. 예를 들어, 가변성은 두개골 절제술의 크기와 위치, Luer 잠금 허브가 두개골 절제술에 비해 배치되는 방법, 경도에 가해지는 대기압 및 압력 펄스의 지속 기간에 대해 보고되었습니다. 이러한 각 매개 변수는 PTE발생률과 직접적인 상관관계가 있는 부상 심각도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 보고된 경련 성 포착의 반사 시간 및 부각을 바로 시키는, 사망률의 넓은 범위로 명시되었습니다. 여기에서 우리는 우리가 연구 사이 조화를 촉진하는 것을 돕기 위하여 이용된 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 무선 EEG 원격 측정 시스템과 함께 FPI를 사용하여 지속적으로 전기 학적 변화를 모니터링하고 발작 활동을 감지했습니다.  FPI는 브레그마와 람다 사이, 왼쪽 반구에 5 mm 두개골 절제술을 생성하고 측면 능선에 인접하여 유도된다. 루어 잠금 허브는 두개골 절제술을 통해 두개골에 고정됩니다. 이 허브는 FPI 장치에 연결되며, 트위스트 록 커넥터를 통해 허브에 연결된 압력 튜브를 통해 20밀리초 압력 펄스가 손상되지 않은 듀라로 직접 전달됩니다. 회복 후, 쥐는 허브를 제거하기 위해 다시 마취된다. 5 개의 0.5 mm, 스테인레스 스틸 EEG 전극 나사는 두개골을 통해 듀라와 접촉하고 4 개의 기록 전극과 하나의 기준 전극역할을합니다. 전극 와이어는 뼈 시멘트와 장소에 고정 받침대 커넥터로 수집됩니다. 연속 비디오/EEG 녹화는 TBI 후 최대 4주 동안 수집됩니다.

서문

2015년 의회에 제출한 보고서에서 질병통제센터는 연간 약 250만 명이 미국에서 외상성 뇌 손상(TBI)을 앓고 있다고 보고했습니다. TBI는 증상 간질의 20 %와 모든 간질의 5 %를 일으키는것으로 추정됩니다 2,^3,4. 추가, TBI 환자의 대략 20%는 외상 후간질을 개발5. 중요한 것은, TBI의 결과로 발생하는 만성, 재발성 발작은 종종 약전성이 있으며, 질병의 부담을 증가시다^6. 외상 후 간질 (PTE)로 이끌어 내는 정확한 기계장치는 불분명하게 남아 있습니다. 그러나, 몇몇 중요한 역학 연구 결과는 외상 후 간질 (PTE)^개발의부각 그리고 잠재적인 리스크를 검토했습니다 2,^{4,7,8,9 ,10,11}. 이 역학 연구는 각각 간질 발생의 리스크와 상해 엄격의 상관관계를 강화했습니다.

새로운 항 간질 치료를 확인하기 위하여 광범위하게 이용된 현재 방법은 간질을 유도하기 위하여 화학 경련제 또는 전기 불을 사용하는 모형에 무겁게 의존했습니다^12. TBI 환자에 의해 이 모형에서 개발된 약에 약의 높은 부각을 감안할 때, 우리는 TBI 유도한 포착이 화학convulsant 또는 점화 유도한 포착과 다를 수 있고 다른 통로 또는 프로세스를 관련시킬 수 있다는 것을 가설합니다 간질 발생. 따라서, TBI 모델은 외상 후 간질 발생을 예방하는 데 더 효과적인 치료법의 개발에 더 적합할 수 있다.

TBI의 유체 타악기 손상 (FPI) 모델은 수십 년 동안 사용되어 왔으며 TBI 및 PTE^13,14,^{15,16,17 을 모두 조사하는 잘 확립 된 방법입니다. 18}. 그러나, 그러나, 우리가 최근에 검토한 바와 같이, 실험실^19,20에걸쳐 보고된 FPI 방법에 있는 가변성의 높은 정도가 있습니다 . 실험실 사이 일관성의이 부족은 전임상 사실 인정의 재현성을 방지하고 결과의 해석을 도전하게 합니다. 그 결과, 이러한 유형의 연구에 대한 더 큰 조화를 수립하기위한 관심과 노력이 21,^22,23,24로적용되었다.

외상 후 간질 발생을 연구하는 데 초점을 맞춘 실험실 간의 일관성과 조화를 더욱 높이기 위한 노력의 일환으로, 우리는 여기에 우리의 접근 방식에 대한 자세한 방법론을 제공합니다. 우리는 이전에 가혹한 TBI 20 후에 6 주 안에 경련성포착의 60% 부각을 보고했습니다. 우리는 지금 부상의 날을 시작하는 쥐를 감시하고 지속적으로 최대 4 주 동안 하루 24 시간을 따르기 위하여 이 접근을 이용합니다. 우리는 몇 가지 장점을 제공하는 무선 원격 분석 시스템을 사용하기로 결정했습니다. 첫째, 쥐는 케이지 를 자유롭게 움직일 수 있으므로 스트레스를 줄일 수 있습니다. 두 번째는 쥐가 지면역할을 함에 따라 신호 잡음의 감소. 또한, 우리의 현재 시스템은 세 비행기 (X, Y 및 Z)에서 빠른 움직임을 감지하고 경련 발작 이벤트를 식별하는 데 도움이 될 수있는 가속도계를 사용합니다. 마지막으로, 무선 원격 측정 시스템은 보조 식염수 주사와 같은 쥐의 관리를 쉽게 할 수 있습니다, 무게와 신경 심각도 점수를 실시, 쥐가 밧줄에 부착 될 때 복잡. 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 최대 8마리의 쥐를 동시에 기록하는 시스템의 초기 비용은 $60,000 범위에 있을 수 있습니다. 둘째, 전원은 배터리 소스에 의해 제한됩니다. 이를 위해서는 매일 배터리를 모니터링하고 교체해야 합니다. 배터리 교체 사이에 필요한 시간은 샘플링 속도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 그러나 1000Hz 샘플링 속도의 경우 배터리는 일반적으로 일주일에 한 번 변경됩니다. 제한된 전원 공급 장치는 또한 4개의 EEG 신호에서만 시스템을 기록하도록 제한합니다. 마지막으로 신호 드롭아웃은 제한적이지만 가끔 씩씩하게 발생합니다. 그러나, 이 접근법은 외상 후 간질 발생을 모니터링하는 일관되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고 새로운 치료 치료법의 식별에 도움을 수 있다.

프로토콜

모든 절차는 버팔로 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 대학의 지침에 의해 승인및 따랐다.

1. 유체 타악기 부상

1. 실험실 코트 나 수술 가운, 수술 용 마스크, 수술 장갑 및 머리 덮개를 착용하고 수술 부위에 접촉하는 모든 도구와 재료를 살균하십시오.
2. 10-12 주 된, 남성, Wistar 쥐 (350-400 g) 3% 이소플루란과 1 L/min 산소 쥐에 대 한 적절 한 크기의 유도 챔버에 마 취. 유도 챔버에서 쥐를 제거하고 의식이 일단 준비 영역으로 이동합니다. 멸균 안과 연고를 두 눈에 넣습니다.
3. 쥐의 머리에 #40 블레이드로 쥐의 머리에 머리카락을 면도하여 눈 바로 위에서 귀의 꼬리 기지까지 충분한 수술 장을 생성합니다. 사이트에서 느슨하고 잘린 머리카락을 제거합니다.
4. 면도한 두피에 2% 클로로오이시드인 스크럽을 바르고 70% 에탄올을 바르고 수술 부위를 청소합니다. 중심에서 시작하여 절개 부위에서 멀리 떨어진 동심원으로 바깥쪽으로 이동합니다. 이 과정을 3번 반복합니다. 동일한 방식으로 사이트에 Betadine 솔루션을 적용하고 건조 할 수 있습니다.
5. 마취 된 쥐를 입체 적 프레임에 넣고 노코콘을 통해 2-3 % 이소플루란 -1 L / 분 산소에서 마취를 유지하십시오. 쥐가 마취의 외과 비행기에 있는지 확인하기 위해 뒷다리의 철수 반사손실과 팔모구 반사의 손실을 확인하십시오.
6. 수술 내내 호흡속도, 심박수, 체온 및 산소 포화도를 모니터링합니다. 심박수는 300-400 bpm, SpO_2는 90% 이상유지합니다.
   참고 : 후방 발에 부착 된 맥박 산소 측정기를 사용하여 심박수 및 SpO_2에서일정한 판독을 제공 할 수 있습니다. 400 bpm 이상의 심박수는 쥐가 충분히 마취되지 않음을 나타냅니다. 37 °C로 설정된 직장 온도계에 결합된 자가 조절 온난화 패드는 체온을 유지하기 위해 수술 내내 쥐 아래에 배치될 수 있습니다. 광섬유 램프와 함께 광원이 있는 입체 현미경은 절차를 시각화하는 데 유용합니다.
7. 23 g 바늘을 사용하여 절개 부위의 두피에 0.5 % 부피바카인 염산염을 intradermally 주입하여 절개를하기 10 - 15 분 전에 절개를하십시오.
8. #10 메스 블레이드를 사용하여 두피의 피부와 근육을 통해 1.5-2.5 cm 미드 라인 절개를합니다. 두개골을 노출하고 명확한 수술 필드를 제공하기 위해 피부와 근육을 철회. 멸균 면봉으로 뼈에서 떨어진 근막과 지방 조직을 반사합니다.
   참고: 전기 소작 유닛은 빠른 지혈을 달성하는 데 유용합니다.
9. 외과 용 큐렛을 사용하여 왼쪽 정수리 뼈의 측면 능선을 면도하여 여성 - 여성 루어 잠금 허브의 베이스가 두개골과 함께 씻어 낼 수 있도록 매끄러운 평평한 표면을 생성합니다.
10. 멸균 식염수로 2.0 mg/mL 젠타미신 용액으로 두개골 표면과 주변 조직을 관개합니다. 멸균 면봉으로 과잉 용액을 블롯하십시오.
11. 뼈를 건조두개골에 과산화수소 3%를 적용합니다.
    참고 : 뼈가 충분히 건조하지 않은 경우 치과 시멘트가 제대로 부착되지 않고 단단한 씰을 형성합니다.
12. 왼쪽 정수리 뼈를 통해 5mm 직경 의 두개골 부위를 만듭니다.
    참고 : 스테레오틱 프레임에 부착 된 파워 드릴에 배치 트레핀 비트는 두개골 절제술을 시작하는 데 도움이 될 수 있습니다. 직경 5mm의 트레핀이 있는 핸드 드릴을 사용하여 남은 뼈를 통해 두개골 절제술을 천천히 마무리합니다. 두개골 절제술을 완료에 가까운 경우, 기본 경막 미터의 파열을 방지하기 위해 역으로 트레핀을 회전. 디스크 둘레에 두개골이 얇아지고 가볍게 누르면 두개골 플랩이 느슨해집니다.
13. 수술 용 큐렛과 부드러운 조직 집게로 뼈 플랩을 제거하십시오.
    참고 : 일부 출혈이 발생할 수 있지만, 지혈은 멸균 면봉으로 부드러운 압력을 가함으로써 신속하게 달성 될 수 있습니다.
14. 입체 현미경과 조명을 사용하여 파열의 징후가 있는지 경막검사를 시각적으로 검사합니다.  뼈의 얇은 테두리는 두개골 절제술 부위의 둘레에 남아있을 것입니다.  부드러운 조직 집게로 이 림을 부드럽게 제거하여 경막이 파열되지 않도록 주의하십시오.
15. 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 건조하기 위해 70 % 에탄올로 두개골을 면봉하십시오.
16. Luer 잠금 허브의 아래쪽 가장자리 주위에 시아노아크릴레이트 젤 접착제의 얇은 층을 적용하고 개구부를 방해하지 않고 두개골 위에 두개골에 고정. 접착제가 경막과 접촉하지 않도록 주의하십시오. 또한 허브의 외부 베이스 주위에 접착제의 추가 얇은 층으로 Luer 잠금 장치를 밀봉합니다.
17. 치과 시멘트슬러리를 준비합니다. 시멘트를 루어 잠금 허브의 주변과 바닥에 두개골 표면에 적용하여 제자리에 고정시다.
18. 주사기와 바늘을 사용하여 무균 방부제 무료 인공 뇌척수액 (csH 7.4)으로 Luer 잠금 허브를 채우면 식염수의 볼록한 볼루스가 림 상단 위로 보일 수 있습니다.
    참고 : 용액은 치과 시멘트가 건조할 때 내구성을 촉촉하게 유지뿐만 아니라 씰의 무결성을 나타내는 역할을합니다. 솔루션 수준이 전혀 떨어지면 시스템 누출을 나타내며 Luer 잠금을 제거하고 교체해야 합니다.
19. 치과 시멘트가 완전히 경화되면 가스 마취를 중단하고 입체 프레임에서 쥐를 제거하십시오.
20. 쥐를 FPI 장치 옆에 있는 플랫폼에 놓습니다.
21. FPI 장치에는 유체 저장소 끝의 압력 변환기에서 연장되는 곡선 금속 팁이 있습니다. 2cm 수컷 루어 잠금 트위스트 커넥터에서 종료되는 반대쪽 끝으로 12cm 길이의 압력 튜브를 곡면 끝부분에 고정합니다. 쥐의 두개골에 있는 허브의 암컷 끝을 수컷 커넥터에 연결하여 쥐를 FPI 장치에 고정시다.
    참고: 연결이 단단히 고정되어 있고 시스템에서 모든 기포가 제거되었는지 확인합니다.
22. 동물을 흉골 에 놓고 반복적으로 철수 반사의 반환을 확인합니다. 즉시 쥐는 철수 반사를 회복하지만 여전히 진정, 단일 20 ms 압력 펄스를 유발하고 부상을 유도하는 FPI 장치의 진자 해제.
    참고: 동물이 깊은 마취되는 동안 부상을 유도하지 않는 것이 중요합니다이 신경 발생 유도 폐 부종으로 인해 사망률을 증가시키는 경향이있다. 모든 장치는 가변성을 보여줍니다. 그러나, 이 실험에 사용되는 장치에서, 해머의 17° 각도 배치는 2.2 - 2.3 기압 펄스를 생성한다. 부상을 입지 않은 가짜 동물은 부상을 유발하는 실제 유체 펄스를 제외하고 모두 동일한 절차를 거칩니다.
23. 부상 후 즉시 FPI 장치에서 쥐를 분리하고, 흉골 에 배치하고, 자발적인 호흡이 돌아올 때까지 코 콘을 통해 보충 산소 (1 L / 분)를 제공합니다. 무호흡은 부상의 예상 결과입니다. 필요한 경우, 쥐가 자발적으로 스스로 호흡하기 시작할 때까지 백 밸브 마스크를 통해 주기적인 수동 호흡을 제공합니다.
    참고 : 일반적으로 무호흡증은 2 분 미만 지속됩니다. 카테콜아민 파열로 인한 압력 펄스 투여 직후 심박수(>500 bpm)의 일시적인 급격한 상승이 관찰됩니다. 이것은 쥐의 발에 붙어 있는 펄스 oximeter로 감시될 수 있고 가혹한 상해가 일어났다는 가능한 표시기로 봉사할 수 있습니다.
24. 쥐를 지속적으로 모니터링하고 오른쪽 반사의 반환 시간을 기록 (네 개의 사지에 안정적인 앰비언트).
25. 각 쥐에 대한 대기압 펄스의 크기는 ± 0.05 대기권 내에 있어야 합니다. 각 압력 펄스가 일관된 진폭과 지속 시간으로 오실로스코프에서 부드러운 신호를 생성하는지 확인합니다.
    참고: 시끄러운 신호는 시스템의 기포를 나타낼 수 있으며, 이는 부상 펄스를 전달하기 전에 제거해야 합니다. 이 실험에서 심각한 부상을 초래하는 대기압 펄스는 일반적으로 동물의 권리 화 시간을 30-60 분으로 초래합니다. 이 권리 의 범위는 대략 40-50%의 사망률과 연관됩니다.
26. 지원 치료로 미리 따뜻해진 식염수 10 mL을 피하 투여하십시오.
27. 쥐를 홈 케이지로 되돌리고 적어도 4시간 동안 회복할 수 있도록 하십시오.
    참고: 쥐가 마취 하에 즉시 다시 배치될 때 사망률이 증가했습니다.

2. 피질 뇌전극 및 비디오 EEG 기록의 이식

1. 부상 후 4 시간에서, 앞서 설명한 대로 쥐를 마취하고 루어 잠금 허브와 치과 시멘트를 제거하기 위해 입체 프레임에 다시 배치합니다.
   참고 : 허브와 시멘트는 적당한 압력으로 쉽게 스냅됩니다. 허브를 제거할 때 는 경막에 파열이나 손상이 있는지 주의 깊게 확인하십시오. 경막에 손상을 입힌 동물을 즉각적으로 안락사시하십시오.
2. 5개의 파일럿 구멍을 뚫어야 하는 각 위치에서 두개골에 0.5% 부피바카인 염산염의 작은 방울을 적용합니다(그림 1참조).
3. 손으로 잡은 0.1mm 드릴 비트로 두개골을 뚫는 파일럿 구멍.
4. 스테인리스 스틸 전극 나사를 다음 위치의 각 파일럿 구멍에 고정하십시오: 기준 나사는 소뇌 위에 람다에 꼬리를 놓습니다. 기록 전극이 배치됩니다 : 1) 반구 입시 측과 횡선 에 두개골 절제술; 2) 두개골 절제술에 반구 입시 및 꼬리를 통해; 3) 두개골 절제술에 반구 반대 측 및 장대; 4) 반구 상에서 두개골 절제술에 대한 반대측 및 꼬리를 돌기.
5. 뼈 먼지를 제거하기 위해 70 % 에탄올로 두개골을 면봉하십시오.
6. 노출된 경막을 덮기 위해 멸균 된 뼈 왁스의 얇은 층으로 두개골 절제술 부위를 덮습니다.
7. 지정된 스테인리스 스틸 전극 나사 주위에 컬러 코드 전극 와이어의 노출된 끝을 단단히 감싸서 전극 어레이를 5 EEG 전극에 연결합니다.
   참고: 각 전극 와이어의 반대쪽 끝은 받침대 커넥터 내의 특정 지정된 위치에 배치됩니다.
8. 뼈 시멘트의 슬러리를 준비합니다.
9. 전극 와이어를 받침대 아래 의 코일로 수집하고 뼈 시멘트와 장소에 와이어와 받침대를 고정합니다. 뼈 시멘트가 완치 될 때까지 받침대를 제자리에 잡으하십시오.
   참고: 적절한 접착력을 달성하고 송신기의 조기 제거를 방지하기 위해 뼈는 특히 건조하고 잔류 혈액이 없어야 합니다.
10. 무선 송신기를 새 배터리로 받침대에 부착한 후 동물을 입체 프레임에서 제거합니다.
11. 동물을 홈 케이지에 넣고 케이지를 수신기에 근접하고 지정된 비디오 카메라를 볼 수 있도록 배치합니다. 비디오/EEG 녹화를 시작합니다.

3. 비디오 EEG 녹화의 컬렉션

1. EEG 신호를 수집하기 전에, 배경 잡음이 있는 모든 주파수로 EEG 기록의 수집을 방지하기 위해 잠재적인 간섭 주파수를 식별하기 위해 쥐가 EEG 수집을 위해 보관될 방의 주파수 스윕을 수행합니다.
2. 모든 송신기를 간섭이 없는 특정 주파수로 설정합니다.
3. 샘플링 주파수와 각 프로그래밍 가능한 송신기의 입력 범위를 설정합니다.
   참고: 시스템 제조업체에서 제공하는 스마트 도구를 사용하여 수행할 수 있습니다. 송신기는 최대 1000Hz 및 최대 입력 범위 ±10 mV로 샘플링할 수 있습니다. 이 실험에서는 0.5 Hz에서 30 Hz 사이의 EEG 기록을 분석했습니다. 따라서 샘플 속도는 250 Hz에서 설정되었습니다. 일반적으로 1mV 미만의 진폭을 관찰합니다. 따라서, 설정된 입력 범위는 ±2 mV에 있었다.
4. 제조업체에서 제공하는 EEG 수집 소프트웨어를 사용하여 부상 당일부터 각 무선 송신기를 고유 주파수를 통해 특정 수신기에 연결하는 비디오 EEG를 지속적으로 기록합니다.
   참고: 각 송신기 수신기 쌍은 X, Y 및 Z 평면에서 4개의 단극성 EEG 채널과 가속도를 모니터링할 수 있습니다. EEG 데이터는 저장소 서버에 기록될 수 있습니다. 비디오 데이터는 저장소 서버에 연결된 NAS 장치에 저장되어야 합니다. 상기 EEG 분석 소프트웨어는 스토리지 서버가 유지 관리하는 시간에 기초하여 비디오 및 EEG 기록을 동기화한다.
5. 비디오 수집 소프트웨어를 사용하여 30 프레임/s로 녹화하도록 구성된 자체 2MP 해상도 카메라(1920 x 1080)로 각 래트의 비디오를 녹화합니다.
   참고 : 각 카메라에는 밤에 비디오 수집을위한 자체 적외선 조명이 있습니다.
6. 모든 비디오 및 EEG 녹화를 24시간마다 스토리지 서버에 자동으로 저장하도록 시스템을 구성합니다. 비디오는 다소 큰 파일을 생성합니다.

4. 비디오/뇌파 분석

1. 비디오를 1/10s 해상도로 각 EEG 레코딩과 동기화합니다. EEG와 비디오 의 정확한 시간의 스탬프와 메타 파일을 생성 하는 시스템 제조 업체 비디오/EEG 분석 소프트웨어를 사용 하 여이 작업을 수행 합니다.
2. EEG 기록을 통해 수동으로 스크리쳐 발작 활동을 정의하는 인덱스 이벤트를 식별합니다.
3. 비디오/EEG 분석 소프트웨어 및 EEG 이벤트 색인을 사용하여 주요 매개 변수(즉, 특정 주파수 대역의 전력, 총 전력에 대한 주파수 대역 비율, 가속 임계값 등)를 사용하여 특성을 정의하는 구성 파일을 만듭니다. 잠재적 인 발작 이벤트의.
4. EEG 분석 소프트웨어를 실행하여 구성 파일에서 선택한 매개 변수에 따라 자격을 갖춘 EEG 기록의 잠재적 영역을 식별합니다.
   참고: EEG 분석 소프트웨어는 자동 발작 감지를 허용하고 EEG 신호에 관심 있는 영역을 강조하며 신호 전반에 걸쳐 FFT 전력 스펙트럼 분석을 제공합니다.
5. 각 쥐의 각 EEG 기록과 동기화되는 수집 된 비디오 녹화를 사용하여 잠재적 인 경련 성 발작을 확인하십시오.

결과

이 모델로, 우리는 성인, 남성, Wistar 쥐로 심한 TBI를 유도. 우리가 여기에서 기술하는 조건하에서, 우리는 전형적으로 40-50%의 사망률을 관찰하고, 앞에서 설명한 대로 30-60 분의 반사 시간을 바로. 우리는 비디오 / EEG 기록을 수집 할 수 있었다 24 부상의 날에 시작 시간 / 일. 도 1A에 4개의 단극성 EEG 전극 및 단일 기준 전극의 위치를 보여주는 도면이 도시되어있다. 여기에 설명된 조건으로 예상되는 TBI 병변의 위치 및 외관을 보여주는 이미지는 도 1B-D에도시되어 있다. 여기에 설명된 조건하에서, 우리는 TBI 이후 처음 3일 이내에 델타가 지속적으로 둔화되는 것을 관찰합니다. 덜 심하게 다친 쥐는 일방적으로, 간헐적인 델타 둔화를 나타낸다 (그림2C-D). 대조적으로, 연속, 양측 델타 감속은 더 심각한 부상 후에 관찰된다 (그림3C-D). 델타 감속의 어느 정도는 모든 TBI 래트에서 일관되게 관찰되었지만 어떤 sham 조작 (craniectomy 만) 제어 쥐에서 검출되지 않았다 (도2A-B; 3A-B). 광대한 델타 둔화는 대부분의 TBI 쥐에서 부상 후 처음 3일 동안 일관되게 관찰되었다. 흥미롭게도, 쥐는 일반적으로 처음 3 일 후 부상 동안 발음 체중 감소를 보여줍니다. 비 경련성 포착은 때때로 TBI 다음 첫번째 주 안에 관찰됩니다 (그림4 C-D). 임상적 발작은, 사육 및 하강뿐만 아니라 팔뚝 클로너스와 관련된 스파이크 클러스터로서 제시되는 TBI(도5C-D)후 1주일 후에 관찰될 수 있다. 마지막으로 그림 6은 간헐적인 신호 이탈 및 배터리 고장으로 인한 신호 손실의 대표적인 이미지를 제공합니다.

그림 1 . 두개골 절제술, 전극 배치 및 병변의 위치. (A) 브레그마와 람다 사이에 위치한 두개골(왼쪽 반구의 회색 원), 4개의 단극성 전극(검은 점; 1,2,3,4)과 참조 전극(Black dot, R)의 위치와 함께 쥐 두개골의 개략적 도면을 나타낸다. 중간선, 람다 후방에 배치; (B) 적색 원으로 확인된 병변의 위치와 관상 후 T2 MRI 스캔을 나타낸다; (C)는 병변의 위치 및 크기가 식별되는 피질의 2-D 맵을 나타낸다(청색 영역). (D) 병변 박스와 함께 닛슬 스테인드 관상면을 나타내고, 병변은 오른쪽 이미지에서 100배 확대된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 . 중간 TBI의 날에 수집 된 일방적인 간헐적 델타 둔화. (A) 수술 당일 에 있는 가짜 수술, 부상당한 대조군 쥐로부터 의 90s EEG 흔적을 나타낸다. 네 개의 채널이 모두 제공됩니다. 기준선 EEG 패턴을 더 잘 시각화하기 위해 3채널로부터 10s의 긴 트레이스(박스형 영역에서 가져온)를 추출하였다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (B) FFT 분석 2048 ms는 수술 당일 부상당한 샴 수술 동물로부터 EPOC를 선택했다. (C) 90s EEG 트레이스를 나타내며, 이는 부상 당일 중등도의 동물의 간헐적이고 일방적인 델타 감속 패턴을 나타낸다. 10 s 긴 추적 (박스 형 영역에서 가져온) 더 나은 둔화 EEG 패턴을 시각화 하기 위해 3 채널에서 추출 되었다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (D) FFT 분석 2048 ms는 부상 당일 중등도 TBI 동물로부터 EPOC를 선택했다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 위에서 아래로 의 90s EEG 추적은 생체 전위 1, 2, 3, 4, 두개골 절제술 부위 주변의 그들의 위치에 대응하는. 회색 세로 표시는 EEG 추적에서 1s 간격을 정의합니다. 모든 EEG 트레이스는 (±500 μV)의 척도로 도시된다.  FFT 분석 그래프 내에서 전체 분석 주파수 범위는 0.5-30Hz였습니다. 이것은 델타 (노란색, 0.5-4 Hz), 세타 (보라색, 4-8 Hz), 알파 (빨간색, 8-12 Hz), 베타 (녹색, 12-30 Hz)의 4 개의 별도 주파수 대역으로 세분화되었습니다.  FFT 분석 에 표시된 % (전원) 그래프는 분석 된 EPOC의 총 전력의 백분율이 이전에 지정된 각 주파수 대역에서 오는 것을 알려주므로 EEG 파형 패턴의 추가 수학적 특성이 허용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 . 심각한 TBI의 날에 수집 된 양자, 연속 델타 둔화. (A) 수술 당일 에 있는 가짜 수술, 부상당한 대조군 쥐로부터 의 90s EEG 흔적을 나타낸다. 네 개의 채널이 모두 제공됩니다.  기준선 EEG 패턴을 더 잘 시각화하기 위해 3채널로부터 10s의 긴 트레이스(박스형 영역에서 가져온)를 추출하였다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (B) FFT 분석 2048 ms는 수술 당일 부상당한 샴 수술 동물로부터 EPOC를 선택했다. (C)는 90s EEG 트레이스를 나타내며, 이는 부상 당일 심각한 부상을 입은 동물의 연속, 양측 델타 감속 패턴을 나타낸다.  10 s 긴 추적 (박스 형 영역에서 가져온) 더 나은 둔화 EEG 패턴을 시각화 하기 위해 3 채널에서 추출 되었다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (D) 2048 ms의 FFT 분석은 부상 당일 중증 TBI 동물로부터 EPOC를 선택했다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 위에서 아래로 의 90s EEG 추적은 생체 전위 1, 2, 3, 4, 두개골 절제술 부위 주변의 그들의 위치에 대응하는. 회색 세로 표시는 EEG 추적에서 1s 간격을 정의합니다. 모든 EEG 트레이스는 (± 500 μV)의 척도로 도시된다.  FFT 분석 그래프 내에서 전체 분석 주파수 범위는 0.5-30Hz였습니다.  이것은 델타 (노란색, 0.5-4 Hz), 세타 (보라색, 4-8 Hz), 알파 (빨간색, 8-12 Hz), 베타 (녹색, 12-30 Hz)의 4 개의 별도 주파수 대역으로 세분화되었습니다. FFT 분석 에 표시된 % (전원) 그래프는 분석 된 EPOC의 총 전력의 백분율이 이전에 지정된 각 주파수 대역에서 오는 것을 알려주므로 EEG 파형 패턴의 추가 수학적 특성이 허용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 . 비경련성 전기발작은 심한 TBI 후 3일 후에 수집한다. (A) 수술 후 3일^25일 동안 부진 대조군 쥐로부터 90s EEG 흔적을 나타낸다. 네 개의 채널이 모두 제공됩니다. 기준선 EEG 패턴을 더 잘 시각화하기 위해 3채널로부터 10s의 긴 트레이스(박스형 영역에서 가져온)를 추출하였다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (B) FFT 분석 2048 ms는 수술 후^{3 일 25} 일에 부상을 입지 않은 샴 수술 동물로부터 EPOC를 선택했다. (C)는 심한 부상을 입은 ^{후 25일} 후 90s EEG 추적을 나타낸다.  이 쇼 건물, 빠른 스파이크 패턴은 양자 및 모든 4 수집 채널에 걸쳐 제시.  10 s 긴 추적 (박스 형 영역에서 가져온) 더 나은 스파이크 EEG 패턴을 시각화 하기 위해 3 채널에서 추출 되었다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (D) 2048 ms의 FFT 분석은 부상 당일 중증 TBI 동물로부터 EPOC를 선택했다.  도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 위에서 아래로 의 90s EEG 추적은 생체 전위 1, 2, 3, 4, 두개골 절제술 부위 주변의 그들의 위치에 대응하는. 회색 세로 표시는 EEG 추적에서 1s 간격을 정의합니다. 모든 EEG 트레이스는 (± 500 μV)의 척도로 도시된다.  FFT 분석 그래프 내에서 전체 분석 주파수 범위는 0.5-30Hz였습니다.  이것은 델타 (노란색, 0.5-4 Hz), 세타 (보라색, 4-8 Hz), 알파 (빨간색, 8-12 Hz), 베타 (녹색, 12-30 Hz)의 4 개의 별도 주파수 대역으로 세분화되었습니다.  FFT 분석 에 표시된 % (전원) 그래프는 분석 된 EPOC의 총 전력의 백분율이 이전에 지정된 각 주파수 대역에서 오는 것을 알려주므로 EEG 파형 패턴의 추가 수학적 특성이 허용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 . 경련성 전전성 발작은 TBI 후 9일 후 수집. (A) 수술 후 90s EEG 추적을 나타내고, 수술 후 9일 간 부상당한 대조군 쥐를 수술하였다. 네 개의 채널이 모두 제공됩니다. 기준선 EEG 패턴을 더 잘 시각화하기 위해 3채널로부터 10s의 긴 트레이스(박스형 영역에서 가져온)를 추출하였다. 이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (B) FFT 분석 2048 ms는 수술 후 9일째에 부상을 입지 않은 샴 수술 동물로부터 EPOC를 선택했다. (C)는 90s EEG 추적 9일(9)일 후 심각한 부상을 나타낸다. 이 쇼 건물, 빠른 스파이크 패턴은 양자 및 모든 4 수집 채널에 걸쳐 제시. 10 s 긴 추적 (박스 형 영역에서 가져온) 더 나은 스파이크 EEG 패턴을 시각화 하기 위해 3 채널에서 추출 되었다.  이것의 2048 ms EPOC 섹션은 그 후 해당 FFT에서 분석될 수 있도록 선택되었다. (D) FFT 분석 2048 ms는 심한 TBI 동물 9 (9) 일 후 부상으로부터 EPOC를 선택했다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 위에서 아래로 의 90s EEG 추적은 생체 전위 1, 2, 3, 4, 두개골 절제술 부위 주변의 그들의 위치에 대응하는. 회색 세로 표시는 EEG 추적에서 1s 간격을 정의합니다. 모든 EEG 트레이스는 (± 500 μV)의 척도로 도시된다. FFT 분석 그래프 내에서 전체 분석 주파수 범위는 0.5-30Hz였습니다. 이것은 델타 (노란색, 0.5-4 Hz), 세타 (보라색, 4-8 Hz), 알파 (빨간색, 8-12 Hz), 베타 (녹색, 12-30 Hz)의 4 개의 별도 주파수 대역으로 세분화되었습니다.  FFT 분석 에 표시된 %(Power) 그래프는 분석된 EPOC의 총 전력 비율이 이전에 지정된 각 주파수 대역에서 나온 것을 알려주므로 EEG 파형 패턴의 추가 수학적 특성이 허용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6 . 신호가 끊어집니다. 이들은 EEG 기록과 같이 송신기 또는 수신기 문제로 인해 어떤 신호가 떨어지는지에 대한 3개의 개별적인 예입니다. (A) 이것은 기록에서 EEG 신호의 간헐적 드롭아웃의 예이다.  (B) 이는 EEG 추적에서와 같이 연속 무선 원격 분석이 나타나는 동안 배터리 고장으로 인한 드롭아웃의 예입니다.  (C) 동그라미 영역 내에서, 신호의 질(QoS)이 100에서 0으로 떨어질 때, EEG 추적이 평평해지고 0 μV에서 정체되는 것을 알 수 있다.  회색 세로 표시는 EEG 추적에서 1s 간격을 정의합니다. 모든 EEG 트레이스는 (± 500 μV)의 척도로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

FPI TBI 모델 ^{14,26,27,28에}사용되는 특정 파라미터 및 방법에 관한 실험실 간에 상당한 가변성이 보고되었다. 이러한 불일치는 결과가 충돌하고 실험실 간의 노력과 결과를 조화시키기 어렵게 만듭니다. 여기에서, 우리는 외상 후 간질 활동을 위해 감시하기 위하여 비디오/EEG의 장기, 연속적인 기록에 우리의 접근을 기술하는 상세한 방법론을 제시했습니다. 설명된 방법으로 재현 가능한 결과를 생성하는 데 는 여러 단계가 중요합니다.

첫째, 외상 후 간질의 발생률이 부상 심각도와 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때, 가장 심각한 TBI를 초래하는 조건을 적용합니다. 특히, 5mm 의 두개골 절제술을 사용하여 충분히 넓은 경막 부위가 노출되도록하십시오. 또한, 두개골의 표면에 여성 - 여성 루어 잠금 장치를 고정, 개구부는 두개골 절제술 위에 직접 배치. 이것은 더 작은 craniectomy (3 mm) 및/또는 효과적으로 개구 크기를 감소시키는 두개골 안쪽에 수정한 바늘 허브를 두었던 그밖 실험실과 다릅니다. 루어 락을 크레니에절제술 외부에 배치하면 5mm 개구부가 유지됩니다. 이러한 특정 매개변수는 dura에 적용되는 전체 힘에 영향을 미칩니다. dura에 적용되는 대기압은 또한 관찰 된 부상의 심각도에 큰 영향을 미칩니다. 불행히도, 기압은 매우 가변적이며 장치에 의존하는 것으로 보입니다. 일부 실험실은 8 - 10 ms^18의압력 펄스를 적용하는 것으로 보고되었습니다. 대조적으로, 여기에 설명된 방법은 20 ms 압력 펄스를 초래한다. 이것은 더 심각한 부상을 생성하는 것으로 보이는 다른 실험실과 일치14, ²⁸. 상해를 유발하는 압력 펄스는 실험실 간에 상당한 가변성을 보이는 매개 변수이며 경험적으로 정의되어야 합니다. 그러나, 상해 중증도는 사망률(40-50%), 권리 반사 시간(>30 분)^26의조합에 기초하여 결정될 수 있다. 또한 손상되지 않은 경도를 가진 동물만 연구에 포함되는 것이 중요합니다. 또한, 두개골 절제술이 크레니크 절제술 아래 의 경막 일부가 유체 압력 펄스의 전체 힘에 노출되지 않도록 접착제 또는 시멘트에 의해 가려지면 동물은 연구에서 제거해야합니다.  또한 Luer 잠금 장치 아래에 있는 과도한 접착제는 내구성을 부착하고 성공적인 부상 후에도 시멘트 캡으로 제거할 수 있습니다.  마지막으로, 오실로스코프 트레이스에서 압력 펄스 곡선의 매끄러운 형상은 유체 챔버에 기포가 없다는 표시를 제공하고 플런저가 임피던스 없이 움직이고 있음을 나타냅니다.

마취는 통제되어야 하는 또 다른 중요한 요소입니다. Isoflurane 노출은 마취의 외과 비행기를 유지하기 위하여 가능한 가장 낮은 수준으로 유지되어야 합니다. 이소플루란의 상부에 드러내거나 장기간 에 노출된 쥐는 신경발생유발 폐부종을 개발할 가능성이 더 높습니다. 두개골의 준비는 방법의 또 다른 중요한 측면을 나타냅니다. 특히, 두개골을 건조하고 뼈 먼지를 제거하는 것은 쥐가 송신기를 조기에 제거하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.

나사의 배치와 EEG 와이어의 연결은 일관되게 재현 가능한 레코딩을 생성하는 데 매우 중요합니다. 나사는 뇌의 병변을 유발하기 위해 너무 깊이 배치되지 않는 것이 중요합니다. 성인(12주 령)의 두개골 절제술로부터 회수된 뼈 플랩은 일관되게 2 mm 두께이다. 2.5mm 샤프트가 있는 EEG 전극 나사를 사용합니다. 구부러진 모기 지혈 집게의 팁을 스페이서로 사용하여 나사가 뼈의 기저부로만 확장되고 뇌로 돌출되지 않도록하는 것이 좋습니다.

여기에 제시된 접근 방식에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 배터리는 정기적으로 교체해야 합니다. 배터리 교체 빈도는 샘플링 속도에 따라 다릅니다. 배터리는 일반적으로 1000Hz의 샘플링 속도에 대해 일주일에 한 번 변경됩니다. 이 시간 프레임은 샘플링 속도를 줄임으로써 연장될 수 있습니다. 이 시스템은 또한 4개의 모노폴라 EEG 전극으로부터의 기록으로 제한된다. 그러나, 이것은 반구 당 2개의 채널을 제공하고 초점과 일반화한 사건 사이에서 구별할 수 있고 전방과 후방 변경을 구별할 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구하고, 이러한 접근법은 심각한 TBI에 이어 간질 변화의 지속적인 비디오/EEG 모니터링 및 검출을 수행하는 합리적인 방법을 제공한다.

여기에서 기술된 방법은 TBI 다음 1 달 안에 전기질과 경련성 포착 둘 다 귀착됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 심각한 TBI에 이어 간질 발생을 예방하기 위한 잠재적 치료제를 연구하는 합리적인 시간 프레임을 제공한다. 이 접근법은 또한 PTE와 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 방법을 제공하고 PTE 발병 위험이 가장 높은 환자를 식별하는 데 사용될 수 있는 잠재적인 바이오마커의 식별을 유도할 수 있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00 mm Drill Bits	Drill Bit City: New Carbide Tools	05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement	3M , Neuss Germany	38019	Dental Cement
4-0 Suture	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture
5 mm outer diameter trephine	Fine Science Tools	18004-50
Bonewax	Medline Industries, Mendelcin, IL	REF DYNJBW25
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial	Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY	3003706	NDC 42023-179-01
Dumont #6 Forceps	Fine Science Tools	11260-20
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare	Cole-Palmer instrument	SKO#45501-22	Order lot #214271
Foot Power Drill	Grobet USA, Carlstadt, NJ	Model C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution)	Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 Software	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
IsoTech Anesthesia machine	SurgiVet	WWV9000
Lateral FPI device	AmScien	302	curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 Stereomicroscope	Leica Biosystems, Richmond, VA	PN: 10 450 488
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL	Hospira, Lake Forest, IL	CA-3627	50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	11018-12
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-14
PALACOS R+G bone cement with gentamicin	Heraeus,	REF: 5036964	Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin
Physio Suite	Kent Scientific, Terrington, CT
Povidone-iodine solution			Betadine
Puralube Vet Ointment	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Scalpel blade (#10) and holder	Integra Miltex, York, PA	REF: 4-110
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Sickle Knife	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1705 HM	5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches.
Silverstein Micro Mirror	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1706 S8	3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches
Storage NAS	Synology Inc.	DS3615xs
Synology Assistant	Synology Inc.
Thermal Cautery Unit	Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA	Model NO: 150
Vetivex	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP)
Video Cameras	TRENDnet, Torrance, CA	TV-IP314PI	Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral
Video NAS	Synology Inc.	DS916
Wistar IGS rats	Charles River	strain code 003	12 wk old at the time of injury
Wullstein Retractor	Fine Science Tools	17018-11