인간의 다형성 핵 백혈구에 대한 황색포도상구균의 세포독성 정량화

요약

이 프로토콜은 이러한 중요한 선천적 면역 세포에 대한 황색포도상구균의 세포 독성을 정량화하는 전 인간 혈액및 2개의 명백한 분석법에서 다형성 핵 백혈구의 정제를 위한 방법을 기술한다.

초록

황색포도상구균은 다형성 핵 백혈구 (PMN 또는 호중구)의 막 무결성을 표적으로 하고 방해하는 백혈구의 넓은 범위를 은닉할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 PMN의 정제와 세 가지 다른 섹션에서 PMN에 대한 S. 아우레우스 세포 독성의 정량화를 모두 설명합니다. 섹션 1은 밀도 원심분리를 사용하여 인간의 혈액으로부터 PMN과 혈청의 분리를 자세히 설명합니다. 섹션 2는 S. 아우레우스가 정제된 인간 PMN에 대해 생산한 세포외 단백질의 세포 독성을 시험합니다. 섹션 3은 살아있는 S. 아우레우스의식균증에 따라 인간 PMN에 대한 세포 독성을 측정합니다. 이러한 절차는 세포막 불투과성 인 프로피듐 요오드화물로 처리 된 PMN의 유세포 분석 분석을 사용하여 S. 아우레우스 류코시딘에 의한 PMN 혈장 막 무결성의 중단을 측정합니다. 집합적으로, 이들 방법은 1차 인간 PMN에 대하여 S. 아우레우스 세포 독성을 빠르게 테스트하는 장점이 있으며 호스트 병원체 상호작용의 다른 측면을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다.

서문

황색포도상구균은 인간에 있는 질병의 넓은 스펙트럼을 일으키는 원인이 되는 그람 양성 박테리아입니다. 이 저명한 병원체는 감염의 다른 양상에 기여하는 수많은 독성 요인을 일으킵니다. 이들은 S. 아우레우스가 숙주 조직^1의다른 모형에 고착하는 것을 허용하는 표면 분자, 호스트 면역 반응을 방해하는 세포외 단백질^2,및 호스트 세포의 다른 모형을 표적으로 하는 분비된 독소의 배열^3을포함합니다. 이 보고에서는, 우리는 인간 다형성 핵 백혈구 (PMN 또는 호중구)에 대하여 S. 아우레우스에 의해 생성된 세포외 단백질의 세포 독성을 정량화하는 방법을 기술합니다, 호스트 타고난 면역 반응의 1 차이펙터 세포.

PMN은 포유류에서 가장 풍부한 백혈구입니다. 이 순환하는 면역 세포는 상주 세포에 의해 또는 침입 하는 미생물에 고유한 화합물에 의해 생성 된 위험 신호에 대 한 응답에서 호스트 조직 모욕의 사이트에 신속 하 게 모집. 이러한 분자로부터의 세포외 입력은 외의 접촉에서 활성화된 상주 숙주 세포와의 직접적인 접촉에서^4,5로알려진 공정에서 PMN의 활성화 상태를 증가시다. 고민 조직에 도달 한 Primed PMN 다음 감염의 설립을 방지 하도록 설계 된 중요 한 타고난 면역 반응을 실행. 이들은 강력한 항균 화합물의 배터리에 의해 미생물 파괴에서 누적되는 세포내 사건의 연속을 유발하는 침입 미생물의 결합 및 내화, 또는 식균증을 포함한다^5.

PMN은 침입 병원균으로부터 인간을 보호하는 데 필수적인 역할을 하며 S. 아우레우스 감염 예방에 특히 중요합니다^4. 그러나, 이 박테리아는 다른 PMN 기능을 방해 하는 독성 유전자의 넓은 범위를 생산. 이들은 신호 분자의 인식을 차단하는 세포외 단백질을 포함, 숙주 조직에 접착을 방지, 항균 화합물의 생산을 억제, 혈장 막 무결성을 손상^4. S. 아우레우스는 특정 환경 단서를 인식하는 다중 2 성분 감각 시스템에서 집합적인 입력을 통해 이 독성 유전자의 시간적 표현을 조율합니다. SaeR/S 2-성분 시스템은 감염 시 S. 아우레우스 독성 유전자 전사의 주요 업 레귤레이터인^{6,7,8,9,10,11이다.} 특히, 이러한 2성분 시스템은 인간 PMN^12를특이하게 표적으로 하는 이중 성분 류코시딘의 생산에 중요한 것으로 나타났다.

이 프로토콜은 세 가지 섹션으로 나뉩니다. 제 1 항은 Bøyum¹³ 및 Nauseef^14에의해 확립된 방법으로부터 적응된 프로토콜을 사용하여 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간의 혈액으로부터 PMN의 정제를 설명한다. 두 번째와 세 번째 섹션은 S. 아우레우스 세포 독성을 검사하는 두 가지 다른 기술을 자세히 설명합니다. 하나는 S. 아우레우스에 의해 생성 된 세포 외 단백질PMN을 취하게하고 다른 하나는 식세포증 다음 PMN을 손상시키는 살아있는 박테리아의 능력을 검사합니다. 이 절차는 S. 아우레우스 기공 형성 독소에 기인한 PMN 혈장 막 무결성의 손실을 측정하기 위하여 프로피듐 요오드화물을 이용합니다. 프로피듐 요오드화물은 일반적으로 세포막 불투과성이지만 S. 아우레우스 독소에 의해 중단 된 혈장 막을 교차 할 수있는 DNA 결합 형광파입니다. 유세포 분석 분석은 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 신속한 정량화를 통해 S. 아우레우스 균주의 상대적인 세포 독성을 측정할 수 있게 한다. 맥박필드 겔 전기영동유형 USA300 및 saeR/S의 이원성 결실 돌연변이체로 확인된 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 이러한 시술이 인간에 대한 세포독성을 정량화하는 방법을 입증하는 모델로 사용되어 왔다.

프로토콜

건강한 기증자로부터 분리 된 정맥 혈액은 몬태나 주립 대학의 인간 과목에 대한 기관 검토 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수집되었습니다. 모든 기부자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했습니다.

1. 인간 다형성 핵 백혈구의 정화 및 인간 혈청의 분리

참고: 모든 시약은 시판되는 내독소 검출 키트를 사용하여 내독소의 존재를 정기적으로 확인해야 하며 PMN의 원치 않는 프라이밍을 방지하기 위해 <25.0 pg/mL 내독소가 포함되어야 합니다.

1. 50 mL의 3% dextran-0.9% NaCl (w/v), 35 mL 의 0.9% NaCl (w/v), 20 mL 의 1.8% NaCl (w/v), 12 mL의 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 솔루션, 그리고 20 mL의 주입-관개-실내 온도 온도.
2. 인간 혈청을 분리하기 위해, 37°C에서 항응고제 없이 30분 동안 15 mL 유리 관에서 갓 뽑은 인간 혈액의 4 mL을 배양하였다. 배양 후, 원심분리기 샘플을 실온에서 10분 동안 2,000-3,000 × g로 시료합니다. 상부 혈청 층을 신선한 15 mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
3. 25 mL의 갓 그려진 헤파린화 (1000 단위 / mL) 전체 인간의 혈액과 실온 3 % dextran-0.9 % NaCl (1 : 1 비율)을 두 개의 복제 50 mL 원추 형 원심 분리튜브 (튜브 당 총 부피 50 mL)에 결합하십시오. 각 50 mL 원두 튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.
4. 실온에서 배양 한 후 두 개의 별도의 층이 나타납니다. 각 덱스란-혈액 혼합물의 최상층을 새로운 50mL 원추형 튜브와 원심분리기를 450 x g에서 10분 동안 저온 또는 무브레이크로 실온에서 옮깁니다.
5. 조심스럽게 두 상피제를 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기하십시오. 실온 0.9% NaCl의 2 mL에서 각 세포 펠릿을 부드럽게 재중단하고, 단일 50 mL 원엽 튜브에 재부유 된 펠릿을 결합한 다음 나머지 0.9 % NaCl (최종 부피 35 mL)을 추가하십시오.
6. 핸드 파이펫을 사용하여 셀 현탁액 아래에 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 용액의 실온 10 mL을 조심스럽게 언더레이합니다. 브레이크가 낮거나 없는 실온에서 450 x g에서 30분 동안 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 부드럽게 흡인합니다. 상급제는 앞서 설명한 바와 같이 수집될 수 있는 말초 혈액 단핵 세포를 함유할 것이다^14.
7. 실온의 20 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 적혈구를 용해시. 튜브를 30s로 흔들어 부드럽게 섞습니다. 적혈구의 포만은 탁도의 뚜렷한 감소를 동반할 것입니다.
8. 즉시 실온에서 10 분 동안 450 × g에서 1.8 % NaCl (실온 [RT])의 20 mL를 추가하고 원심 분리기 샘플을 추가하십시오.
   참고: PMN 수율을 최대화하고 PMN 용해 및/또는 활성화를 방지하기 위해 적혈구 용해 후 PMN이 물에 만 남는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
9. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 흡인. RT RPMI 1640 배지의 2 mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 얼음 위에 놓습니다.
10. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 얼음으로 차가운 RPMI로 1 x 10⁷ 셀/mL의 농도로 정제된 PMN을 다시 일시 중단하고 얼음위에 보관하십시오.
11. 100 μL의 정제된 PMN(1 x 10⁶ 세포)과 300 μL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS)를 결합하여 2개의 복제 유동 세포 분석 튜브에 1 μL의 프로피듐 요오드하드 얼룩을 함유합니다. 플라즈마 멤브레인 손상에 대한 긍정적 인 제어를 위해, 0.5 % 트리톤 X-100 용액의 40 μL을 유세포 분석 튜브 중 하나에 넣고 철저히 혼합하십시오.
12. 유세포분석기를 사용하여 정제된 세포의 순방향 산란, 측면 산란 및 프로피듐 요오드화 염색(535/617 nm에서 여기/방출 최대값)을측정합니다(그림 1).
    참고 : 전방 및 측면 산란 분석은 림프구와 단핵구의 원치 않는 인구를 식별합니다. 프로피듐 요오드화는 손상된 혈장 막과 프로피듐 요오드화 양성 세포의 발음 인구를 가지고 정제 된 PMN으로 만 얼룩세포를 사용해서는 안됩니다. 이러한 연구에서, 정제된 PMN은 정제된 세포의 >98%와 프로피듐 요오드화에 대해 5% 염색된 양성으로 구성된 경우에만 사용되었습니다.
13. DPBS로 희석된 20% 절연 인간 혈청의 100 μL로 이 분석에서 사용될 개별 우물을 코팅하여 PMN 세포 독성 분석술에 대한 96 웰 플레이트를 준비합니다.
    참고: 플라스틱이나 유리에 직접 PMN을 도금하면 세포가 활성화됩니다. 0.05% Triton X-100을 수신할 미디어와 적어도 하나의 포지티브 컨트롤웰만 수신하는 적어도 하나의 네거티브 컨트롤을 포함해야 합니다.
14. 37 °C에서 30 분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 코팅된 우물을 얼음으로 차가운 DPBS로 두 번 씻어 여분의 혈청을 제거합니다. 접시를 거꾸로 가볍게 두드려 잔여 DPBS를 제거하고 얼음 위에 놓습니다.
15. 1 x 10⁷ 셀/mL에서 정제된 인간 PMN 100 μL을 코팅된 각 코팅(1 x 10⁶ PMN/well)에 부드럽게 추가합니다. PMN이 적어도 5 분 동안 얼음에 접시를 배양하여 우물에 정착 할 수 있도록. 각 우물에서 세포의 균일 한 분포를 허용하고 PMN의 원치 않는 활성화를 방지하기 위해 얼음에 두고 플레이트 수준을 유지합니다.

2. 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 S. 아우레우스 세포 외 단백질의 세포 독성 분석

1. 배양 S. 아우레우스를 37°C에서 설정된 교반 인큐베이터를 사용하여 트립틱 콩 국물(TSB)에서 하룻밤 동안. 이러한 연구를 위해, 별도의 150 mL Erlenmeyer 플라스크에서 TSB의 20 mL은 S. 아우레우스 균주 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S의 냉동 배양물로 접종하고 250 rpm에서 흔들림으로 약 14시간 동안 성장시켰다.
2. 하위 배양 S. 아우레우스는 신선한 배지로 하룻밤 세균 배양의 1:100 희석을 수행함으로써. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 37°C에서 배양합니다.
   참고: 이러한 실험의 경우, 150 mL 에를렌마이어 플라스크에서 20 mL의 트립틱 대두 국물을 200 μL의 하룻밤 배양 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S로 접종하고 37°C에서 5시간 동안 250 rpm에서 흔들면서 배양하였다.
3. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달하면, 1mL의 배양 된 S. 아우레우스를 실온에서 5 분 동안 5,000 × g에서 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리지로 옮긴다.
4. 원심 분리 후, 상급체를 3 mL 주사기로 옮긴다. 0.22 μm 필터를 통해 얼음에 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 초자연자를 전달합니다.
5. 배양S아우레우스에사용되는 얼음 차가운 매체로 초월제의 연쇄 희석을 수행한다.
   참고: 표시된 실험의 경우, USA300 및 USA300ΔsaeR/S의 초자연자는 얼음으로 차가운 TSB로 4회 연속 1/2 로그 희석을 거쳤습니다.
6. 1.15단계에서 얼음에 PMN이 함유된 96웰 플레이트의 개별 우물에 상수 샘플 또는 미디어만(음수 및 양성 대조군)을 부드럽게 추가합니다. 이러한 실험을 위해, USA300 또는 USA300ΔsaeR/S 상급 샘플의 10 μL을 각 웰에 첨가하였다. 부드럽게 바위 플레이트는 우물에 초자연적 인 물질을 분배하고 37 ° C에서 배양합니다.
7. 원하는 시간에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음에 배치합니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다.
8. 시료를 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 300 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다.
9. 유세포분석(그림2A)를사용하여 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율을 측정하였다. DNA에 결합하면, 프로피듐 요오드화물은 535/617 nm에서 여기 /방출이 있습니다.

3. S. 식세포증 다음 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 아우레우스 세포 독성 분석

참고: 600 nm (OD_600)에서광학 밀도에 의해 정의된 성장 곡선 및 박테리아의 농도는 이 분석실험을 시작하기 전에 시험될 S. 아우레우스 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이러한 실험의 성공은 하위 배양 박테리아의 OD_600을 사용하여 중간 기하수성장 단계에서 시험된 각 S. 아우레우스 균주의 동일한 농도의 일관된 수확을 요구한다.

1. 단계 2.1.1 및 2.1.2에 기재된 바와 같이 S. 아우레우스 균주 및 하위 배양 박테리아의 하룻밤 배양을 시작한다.
2. 수확 하위 배양 S. 아우레우스는 1mL의 배양 박테리아를 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 5분 동안 5분 동안 원심분리를 하여 중간 기하급수적 성장에 도달하였다.
   참고 : 우리의 성장 조건하에서, USA300 및 USA300ΔsaeR /S는 약 135 분 의 인큐베이션⁶후 중간 기하급수적 성장 단계에 도달했습니다.
3. 상급자를 흡입하고, DPBS 의 1 mL에서 펠릿 박테리아를 재중단하고, 30초 동안 샘플을 소용돌이치며, 실온에서 5분 동안 5,000 ×g에서 원심분리를 하여 원심분리를 세척합니다.
4. DPBS로 희석한 20% 인간 혈청의 1 mL에서 세균 펠릿을 재중단하고 37°C에서 교반하여 15분 동안 배양함으로써 S. 아우레우스를 Opsonize.
5. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5,000 x g에서 박테리아를 불협화시켰다. 상급자를 흡입하여 원심 분리 후 S. 아우레우스를 세척하고, 1 mL DPBS에서 펠릿 박테리아를 다시 일시 중단한 다음, 세균 펠릿이 완전히 분해될 때까지 샘플을 소용돌이치며 추가 30초가 추가로 추가로 증빙합니다. 실온에서 5 분 동안 5,000 × g의 원심 분리기 박테리아.
6. 1 mL RPMI에서 opsonized S. 아우레우스 균주를 다시 일시 중단하고, 세균 펠릿이 완전히 분해 될 때까지 샘플을 소용돌이치며, 추가로 30 초를 얼음에 박테리아를 놓습니다.
7. 얼음 차가운 RPMI로 원하는 농도로 opsonized S. 아우레우스 균주를 희석. 30 초 동안 소용돌이와 얼음에 배치합니다.
8. 트립틱 콩 한천에 박테리아의 1:10 직렬 희석을 도금하여 opsonized S. 아우레우스의 농도를 확인합니다.
   참고: 이 분석실험에 사용된 박테리아의 농도 차이는 후속 PMN 혈장 막 투과성에 큰 영향을 미칠 수 있기때문에(그림 3A),테스트된 각 균주의 농도가 모든 실험에 대해 결정되고 균주 간에 동등한 것이 매우 중요합니다.
9. 1.14단계에서 얼음 위에 있는 96웰 플레이트의 PMN에 각 S. 아우레우스 균주 또는 RPMI(양성 및 음성 대조물)의 100 μL/well을 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 판은 우물에 S. 아우레우스를 배포합니다.
10. 4 °C^15에서8 분 동안 500 × g에서 플레이트를 원심 분리하여 식세포증을 동기화합니다. 원심분리 직후 37°C에서 배양 플레이트(T = 0).
11. 원하는 시간에 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다.
12. 샘플을 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 200 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다.
13. 2.9단계에서 설명한 바와 같이 유세포분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 염색시 샘플을 분석합니다.

결과

우리는 상기서술한 절차가 MRSA PFGE 형 USA300 및 이 균주에서 saeR/S의 이소원성 결실 돌연변이를 사용하여 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스의 세포독성을 상대적으로 정량화하는 데 사용될 수 있는 방법을 입증하였다(USA300ΔsaeR/S)는이전 연구에서 생성된^6. 이 프로토콜의 섹션 1에 기재된 절차를 사용하여 단리된 PMN은 프로피듐 요오드화물로 염색하고 유세포측정을 사용하여 검사했다. 전진 및 측 산란플롯은 단핵구 또는 림프구에 의한 정제된 PMN의 오염을 예시하기 위해 사용되었고(도1A, B)및 PMN 무결성은 프로피듐 요오드화 염색을 사용하여 결정하였다(도1C). 인간 PMN 정제의 설명된 방법은 일관되게 0.5 x 10^{7 내지} 1 x 10⁸ PMN을 생성할 수 있으며 이는 >98% 순수하고 >95% 프로피듐 요오드화물 음성이다.

USA300 및 USA300ΔsaeR/S에 의해 생성된 세포외 단백질의 세포독성은 이 프로토콜의 섹션 2에 기재된 절차에 따라 정제된 PMN에 대해 시험되었다(그림2). 이러한 실험은 USA300에 의해 생성된 세포외 단백질을 30분 간 취한 후 정제된 PMN의 프로피듐 요오드화물 염색의 농도 의존적 증가를 입증한다(도2B). 이전 연구는 SaeR/S 2 성분 시스템이 인간 PMN^{6,10,11,16을}대상으로 하는 수많은 이중 성분 류코시딘의 발현에 중요하다는 것을 입증했다. 이러한 이전 발견과 일치, 아주 소수의 프로피듐 요오드화 양성 PMNUSA300ΔsaeR/S에 의해 생성 된 세포 외 단백질에 노출 다음 검출 되었다(그림 2B). 추가 실험은 약 30 분 후에 고원 된 USA300 세포 외 단백질에 의한 중독 다음 lysed PMN의 비율이 꾸준히 증가한다는 것을 입증했습니다(그림 2C). 인간 PMN의 최소 용해는 USA300ΔsaeR/S에의해 생성된 세포외 단백질에 노출된 후 모든 시점에서 지적되었다. 이러한 결과는 인간 PMN에 대한 세포외 S. 아우레우스 단백질에 의한 세포독성의 상대적 정량화에 대한 이 분석의 유용성을 보여준다.

우리는 이 프로토콜의 섹션 3에 기재된 식세포증 다음의 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스 세포 독성 분석실험을 사용하여 USA300 및 USA300ΔsaeR/S를 시험하였다(그림3). 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 농도 의존적 증가는 USA300의 식세포증 후 90분 후에 관찰되었다(도3A). USA300ΔsaeR/S의 식세포증에 이어 요오드화 양성으로 프로피듐 요오드화 양성이었던 PMN의 비율이 현저한 감소로 관찰되었으며, SaeR/S 2 성분 시스템을 나타내는 다른 결과를 뒷받침하는 것은 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스의 세포독성에중요하다(도2)^7,11. 앞서 언급하고 그림 3A에서입증된 바와 같이, S. 아우레우스 농도의 차이는 식세포증 다음 PMN 용해에 뚜렷한 영향을 미친다. 이러한 각 실험에서 사용된 USA300 및 USA300ΔsaeR/S 접종의 열거는 이들 균주 들 사이의 세포독성의 대조가 사용된 박테리아의 농도차이 에 기인하지 않음을 입증하였다(도3B). 이 사실 인정은 식세포증 다음 인간 PMN에 대하여 S. 아우레우스 세포독성 분석이 어떻게 인간 PMN 혈장 막 무결성을 타협하기 위하여 다른 S. 아우레우스 긴장의 능력을 평가하기 위하여 이용될 수 있는지 보여줍니다.

그림 1: 정제된 PMN의 유세포 분석. 대표적인 유세포측정도도(A)정제된 인간 PMN 및(B)PMN은 말초 혈액 단핵세포로 의도적으로 오염되었다. (C)대표적인 유동 세포분석 히스토그램 [최소 프로피듐 요오드화 염색](<1%) 0.05% 트리톤 X-100(음영처리된 빨간색)으로 처리된 PMN과 비교하여 정제된 PMN(음영 회색)을 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: S. 아우레우스에의해 생성된 세포외 단백질로 취한 PMN의 유세포 분석 분석. (A)PMN의 대표적인 유동 세포분석 히스토그램은 30분 후 인큐베이션 후 프로피듐 요오드화물로 염색되고, 최종 농도에서 USA300 상급자를 1:110(음영 회색) 또는 0.05% 트리톤 X-100(음영 적색)으로 여과하였다. (B)프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율은 30분 후 인큐베이션 후 USA300 또는 USA300의 상이한 농도로saeR/S 주산제의 상이한 농도를 가진. (C)1:110의 최종 농도에서 USA300 또는 USA300의saeR/S 상층과 함께 인큐베이션후 시간이 지남에 따라 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율. 데이터는 * p ≤ 0.05 및 ** p ≤ 0.005를 가진 적어도 3개의 개별 실험의 평균 ± SEM으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: S. 아우레우스의식균증 다음 PMN의 유세포 분석. (a)프로피듐 양성 PMN의 비율은 90분 후 다른 농도의 식세포증 후 USA300 또는 USA300±saeR/S. (B)패널 A. 에 나타난 실험에 사용되는 opsonized S. 아우레우스 균주의 농도는 * p≤ 0.2로 결정된 4개의 개별 실험의 평균 ±SEM으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 인간 혈액에서 PMN의 정제를 설명하고 이러한 중요한 선천적 면역 세포에 대한 S. 아우레우스의 세포 독성을 정량화하기 위해 프로피듐 요오드화물을 사용하는 두 가지 뚜렷한 분석. 이 절차의 성공은 정제된 PMN의 질 및 이 병원체에 의해 생성된 S. 아우레우스 및 세포외 단백질의 적당한 준비에 달려 있습니다. PMN의 격리를 위해, 내독소 오염이 없는 시약을 사용하고, 세포 제제를 부드럽게 치료하고, 세포를 적절한 온도로 유지함으로써 정화 중 및 정화 후 PMN 활성화를 최소화하는 것이 중요합니다. PMN의 활성화를 나타내는 표시는 정화 도중 세포의 응집 및 때 5% 이상 은엽모화물을 위한 단송된 세포의 얼룩을 포함합니다. PMN의 상대적으로 짧은 수명 때문에, 이 세포는 인간적인 혈액에서 격리되고 같은 날에 시험되어야 합니다. PMN은 정화 후 3 시간 이상 얼음에 방치하면 자발적인 사멸의 징후를 나타내기 시작합니다. 앞서 언급했듯이, 모든 PMN 제제는 분리된 세포의 순도와 무결성을 보장하기 위해 전방 및 측면 산란뿐만 아니라 프로피듐 요오드화물 염색의 유세포 분석 분석을 사용하여 신중하게 평가되는 것이 매우 중요합니다.

S. 아우레우스에 의한 이중 성분 류코시딘의 발현은 이 프로토콜에 기재된 분석방법을 사용하여 관찰되는 손상된 PMN 혈장 막 무결성의 대부분에 대한 책임이 있다. 이러한 독 소와 다른 기공 형성 펩 티 드의 발현의 변화, 페놀 수용성 모듈 린 등, S. 아우레우스의 균주 사이 인간 PMN에 대 한 세포 독성에 차이 생산할 것 이다. S. 아우레우스 균주 사이 생체 외 성장 중 상당한 편차 또한 pore 형성 독 소와 후속 세포 독성의 발현에 영향을 미칠 것 이다. 또한, 식세포분석에서 S. 아우레우스와 PMN의 비율은 후속 PMN 혈장막 투과성에 큰 영향을 미치며(도3A)이러한 실험은 하위 배양 박테리아의 OD_600을 사용하여 중간 기하급수성장 단계에서 시험된 각 S. 아우레우스 균주의 동일한 농도의 일관된 수확을 필요로 한다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세포 독성 검사를 시작하기 전에 검사 될 모든 균주에 대한 성장 곡선을 정의하는 것이 매우 중요합니다. 우리는 시험관에서 중요한 성장 차이를 나타내는 균주를 가진 S. 아우레우스 세포 독성을 분석하기위한 이 방법을 추천하지 않습니다.

USA300은 인간 PMN^15에 대하여 매우 세포독성이 있는 것으로 알려져 있는 악성 MRSA 분리종소이며, 이 균주에서 SaeR/S의 손실은 인간 PMN^6,12를표적으로 하는 수많은 이중 성분 백혈구의 전사를 극적으로 감소시키며, 이러한 균주는 세포독성을 비교하여 세포독성을 비교하는 이상적인 모델을 만드는 것으로 설명된다. 그러나, 다른 S. 아우레우스 격리 사이 광대한 유전 변이가 있고 이 프로토콜에 상세한 매개변수는 그밖 S. 아우레우스 긴장을 시험할 때 인간 PMN에 대하여 세포 독성에 있는 실질적인 변경 귀착되지 않을 수 있습니다. 성장 조건을 맞추는, 추가된 상피제의 부피, 또는 PMN에 박테리아의 비율은 S. 아우레우스의그밖 긴장을 사용하여 이 방법을 가진 성공을 위해 요구될 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container	Baxter	2B1323Q	PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps	VWR	89000-044	Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	S5150	PMN purification
12x75mm Culture tubes	VWR	60818-430	Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	PMN purification
3125 Hand Tally Counter	Traceable Products	3125CC	For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes	VWR	89039-656	For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	FischerScientific	211823	For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV	Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets	FischerScientific	13-678-11E	For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Millipore Sigma	M0687	Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters	Omicron Scientific	SFPV13R	For filtering supernatants
Propidium iodide	ThermoFisher Scientific	P3566	Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks	Cole-Parmer	EW-34503-24	For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red	Corning	17-105-CV	Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP	Baxter	2F7113	PMN purification
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	For aspirating liquid
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Membrane integrity positive control