회전 가속도에 따라 쥐에 확산 축 차 뇌 손상의 유도

요약

이 프로토콜은 두개골 골절이나 타박상없이 광범위한 백색 물질 손상을 유도하는 뇌 확산 축축한 손상 (DAI)의 신뢰할 수 있고 수행하기 쉽고 재현 가능한 설치류 모델을 검증합니다.

초록

외상성 뇌 손상 (TBI)은 사망과 장애의 주요 원인입니다. 확산 축축손상(DAI)은 입원을 요구하는 TBI 환자의 상당수에서 부상의 우세한 메커니즘이다. DAI는 흔들림, 회전 또는 폭발 부상으로 인한 광범위한 축색 손상을 수반하여 기능 회복에 오래 지속되는 영향과 관련된 급속한 축축성 스트레치 부상 및 보조 축색 변화를 초래합니다. 역사적으로, 초점 부상없이 DAI의 실험 모델은 설계하기 어려웠다. 여기에서 우리는 두개골 골절이나 타박상없이 광범위한 백색 물질 손상을 일으키는 DAI의 간단하고 재현 가능하며 신뢰할 수있는 설치류 모델을 검증합니다.

서문

외상성 뇌 손상 (TBI)은 미국에서 사망과 장애의 주요 원인입니다. TBT는 모든 상해 관련 죽음의 대략 30%에^{기여합니다1,2}. TBI의 주요 원인은 연령대별로 다르며 낙상, 스포츠 중 고속 충돌, 의도적 인 자해, 자동차 충돌 및 폭행^1,,2,,3을포함합니다.

뇌 확산 축축손상(DAI)은 부상 후 순식간에 무제한 적인 머리 움직임으로 인한 뇌의 회전 가속, 흔들림 또는 폭발 에 의해 유도된 TBI의 특정 유형인^{4,5,,66,57,,8.} DAI는 나쁜 결과, 부담스러운 건강 관리 비용 및 33-64% 사망률^{1,,2,,4,,55,9,,10,,11와}관련되었던 오래 지속되는 신경 손상으로 이끌어 내는 광범위한 축색 손상을 관련시킵니다. DAI의 병인에 대한 중요한 최근 연구에도 불구하고, 최상의 치료 옵션^{11,,12,,13,,14에}대한 합의가 없었다.

지난 수십 년 동안, 수많은 실험 모델은 DAI^{11,,12,,15,,16의}다양한 측면을 정확하게 복제하려고 시도했습니다. 그러나, 이 모형은 그밖 초점 상해에 비교된 DAI의 유일한 프리젠테이션을 주어 한계가 있습니다. 이 이전 모형은 백색 물질 지구에 있는 축축한 상해를 일으키는 원인이 될 뿐 아니라 또한 초점 대뇌 상해 귀착됩니다. 임상적으로, DAI는 백색 물질에 손상의 중요한 원인을 구성할 수 있는 미세 출혈을 동반합니다.

단지 2개의 동물 모형은 DAI의 중요한 임상 특징을 복제하기 위하여 보였습니다. Gennarelli 및 동료는 비인간 영장류 모델^15에서DAI와 혼수 상태를 유도하기 위해 비충격 헤드 회전 가속을 사용하여 1982년에 최초의 측면 헤드 회전 장치를 생산했습니다. 이 영장류 모델은 10-20 ms 내에서 60 °를 통해 머리를 대체하기 위해 가속 및 감속을위한 제어 단일 회전을 채택했다. 그러나 영장류 모델은 매우⁴비싸다^4,11,,16. 이전 모델에 기초하여, 회전 가속 뇌 손상의 돼지 모델은 유사한 결과^14와1994 (Ross et al.)에 설계되었습니다.

이 2개의 동물 모형은, 전형적인 병리학의 다른 프리젠테이션을 일으켰더라도, DAI 병인의 개념에 크게 추가했습니다. 신속한 헤드 회전은 일반적으로 DAI를 유도하는 가장 좋은 방법으로 받아들여지고, 설치류는 신속한 헤드 회전 연구^11,,16에대해 더 저렴한 모델을 제공한다. 여기에서는 두개골 골절이나 타박상없이 광범위한 백색 물질 손상을 유발하는 DAI의 간단하고 재현 가능하며 신뢰할 수있는 설치류 모델을 검증합니다. 이 현재 모형은 DAI의 병리생리학의 더 나은 이해 및 더 효과적인 처리의 발달을 가능하게 할 것입니다.

프로토콜

실험은 헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험 동물 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 네게브의 벤 구리온 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

1. 실험 절차에 대한 쥐 준비

참고 : 300-350g의 무게 성인 남성 스프라그 - Dawley 쥐를 선택합니다.

1. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 이러한 실험을 수행하기위한 승인을 얻으세요.
2. 쥐를 실온에서 22±1°C, 12시간 빛및 12시간의 암흑 주기로 유지한다. 쥐 차우와 물 광고 리비텀을 제공합니다.
3. 오전 6:00에서 오후 12:00 사이에 모든 실험을 수행합니다.
4. 마취를 유도하기 위해 지속적인 이소플루란 투여 시스템을 사용한다. 기화기 시스템이 이소플루란으로 채워져 있는지 확인하십시오.
   1. 2% 이소플루란으로 쥐를 마취시다.
   2. 쥐가 외부 자극에 반응하여 움직임이나 페달 반사의 부족을 관찰하여 완전히 마취되어 있는지 확인합니다.

2. 확산 축축한 부상의 유도

참고 : 장치는 다음과 같은 구성 요소로 구성되어 있습니다 : 1) 투명 플라스틱 실린더, 2) 철 분비 (1308g), 3) 원통형 튜브로 구성된 회전 메커니즘, 축이 회전하는 두 개의 베어링 및 헤드 고정 (귀 핀용); 4) 두 개의 베어링을 고정하는 수평 플랫폼.

1. 장치를 무겁고 안정적인 실험실 테이블에 놓습니다.
2. 높이가 120cm인 끈에 무게를 붙입니다.
3. 자유롭게 떨어지는 무게가 볼트에 닿도록 하여 회전 메커니즘을 활성화합니다. 측면 헤드 회전 장치를 사용하여 설치류의 머리가 0에서 90 °로 빠르게 회전됩니다.
4. 확산 축축한 뇌 손상의 유도 후, 회복실에 쥐를 전송.

3. 회전 운동학 / 생체 역학 매개 변수의 측정.

1. 다음과 같이 회전 운동학/생체 역학 파라미터를 측정합니다.
   
   
   
   여기서 F_O - 동물 머리 (kg)에 인가 된 힘; M – 힘의 순간; K – 운동 에너지; m – 떨어지는 무게의 질량; g - 중력 가속도; h – 높이 (cm); D – 귀 핀(cm) 사이의 거리.
   참고 : 동물의 머리 (F_o)에가해지는 힘을 계산하려면 떨어지는 무게의 질량, 무게가 떨어지는 높이 및 귀 핀 사이의 거리를 알아야합니다. 다른 매개 변수는 변경되지 않습니다.

4. 48 시간 후에 신경학상 엄격 점수의 평가

참고: 신경학적 결핍은^,앞서 설명한^{17,,18,19에서}설명한 바와 같이 신경학적 심각도 점수를 사용하여 평가되고 등급이 매겨졌습니다. 운동 기능 및 행동의 변화는 24의 최대 점수가 가혹한 신경 기능 장애를 나타내기 위하여 포인트 시스템에 의해 평가됩니다. 점수가 0이면 손상되지 않은 신경 상태를 나타냅니다. 다음 행동 기능이 평가됩니다.

1. 쥐가 중앙에 남을 때 원(직경 50cm)에서 빠져나갈 수 없음을 평가한다. 30분, 60분, 60분 이상 지속되는 3개의 개별 세션에 대해 이 작업을 수행합니다.
2. 20 분, 40 분, 60 분 이상 지속되는 세 세션에서 오른쪽 반사의 손실에 대한 쥐를 테스트합니다.
3. 편마비에 대한 테스트를 수행, 위치에 강제 변화에 저항하는 쥐의 무능력.
4. 꼬리로 쥐를 들어 올려 뒷다리의 굴곡을 테스트합니다.
5. 쥐를 바닥에 놓고 똑바로 걸을 수 있는 능력을 시험합니다.
6. 세 개의 별도 반사에 대 한 테스트: 피나 반사, 각막 반사, 그리고 깜짝 반사.
7. 추구 하는 행동 및 prostration의 손실에 따라 임상 등급으로 쥐를 평가.
8. 배치에 대한 사지 반사를 테스트합니다. 왼쪽 및 오른쪽 앞다리에서 테스트를 수행한 다음 왼쪽 및 오른쪽 뒷다리로 테스트를 수행합니다.
9. 빔 밸런싱 작업을 통해 기능 테스트를 수행합니다. 빔은 폭 1.5 cm를 측정해야합니다. 20s, 40s 및 60s 이상의 세션에 대한 테스트를 실행합니다.
10. 너비 8.5cm, 너비 5cm, 너비 2.5cm의 세 가지 폭의 빔으로 쥐에 빔 보 걷기 테스트를 수행합니다.

5. 48 시간 후 조직학적 검사를위한 뇌 수집

1. 부상 후 48 시간에서, 20 % O₂/ 80 %_CO2로영감 가스 혼합물을 대체하여 쥐를 안락사. _CO2가 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 소정의 속도로 전달되도록 합니다.
   1. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 사망 확인을 보장합니다.
2. 트랜스 심장 온도 4 °C에서 0.9 % 헤파린 화 식염수로 쥐를 침전, 0.1 M 인산완충 식염수 (pH 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드의 500 mL.
3. 관류 후, 기요틴으로 참수하십시오.
4. 뇌 조직 손상을 피하기 위해 뼈 절단 집게로 calvarias를 제거하여 뇌 수집을 수행합니다.
5. 즉시 뇌를 제거하고 4°C에서 48시간 동안 4% 버퍼링된 포름알데히드 용액으로 고쳐.
6. 후각 전구 얼굴에서 시각 피질과 이등분 소뇌와 뇌 줄기에 5mm 관상 섹션으로 뇌를 차단합니다.
7. 파라핀 을 삽입한 후, 마이크로토메 절편으로 시상에서 코로나와 시상 절편(5 μm)을 잘라냅니다.

6. 면역 화학 염색 및 검사

1. 부드러운 브러쉬로 슬라이스를 슬라이드당 1슬라이스로 유리 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
2. βAPP의 면역 화학 적 염색을 생성합니다.
   1. 자일렌으로 슬라이스를 분리하고 실온에서 에탄올 농도를 점진적으로 감소시면 재수화합니다: 100% 에탄올에서 3분, 에탄올 2회, 에탄올 95% 3분, 에탄올 70% 에탄올 3분, DDW 3분.
   2. 내인성 과산화아제 활성을 차단하기 위해 실온에서 15분 동안 3% H₂O_2로 분리 및 재수화 된 뇌 섹션을 치료하십시오.
   3. 항원 회수를 위해 98°C에서 0.01 M 구연산염(pH 6.0)으로 배양한다.
   4. 슬라이드를 완충제에 20분간 실온에서 보관하여 식힙니다.
   5. 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 섹션을 5 분 동안 두 번 씻으하십시오.
   6. 상온에서 1시간 동안 2.5% 정상 말 혈청으로 단면을 차단하고 차단 혈청에서 희석된 1차 토끼 안티-APP(1:4000)에서 4°C에서 밤새 배양한다.
   7. 1 차 항체에서 배양 후, 실온에서 PBS에서 섹션을 세척하십시오.
   8. 적절하게 희석된 생체티닐화된 이차 항체에 15분 동안 배양하고 실온에서 3분 동안 PBS로 세척한다.
   9. 스트렙타비딘-과산화를 15분 동안 배양하고 실온에서 3분 동안 PBS에서 다시 세척합니다.
   10. 과산화수소와 3,3-디아미노벤지딘 크로모겐 용액을 함유한 완충기 용액(pH 7.5)으로 섹션을 인큐베이팅하고 색상이 개발될 때까지 빛으로부터 보호합니다.
   11. 반응을 멈추기 위해 실온에서 DDW로 슬라이드를 5 분 동안 인큐베이션합니다.
   12. 허마톡실린으로 반점 섹션을 실온에서 3분 동안, 흐르는 수돗물로 5분 동안 씻으릅니다.
   13. 실온에서 에탄올 농도가 점진적으로 증가하여 슬라이드를 탈수: DDW에서 2분, 70% 에탄올2분, 에탄올 90% 2분, 에탄올 95%, 에탄올 2분, 에탄올 100% 2분, 자일렌 3회.
   14. 마운팅 매체를 장착하여 건조및 마운트합니다.
3. 현미경을 사용하여 20mm 대물 렌즈로 200x의 현미경 배율로 슬라이스를 검사합니다.

결과

표 1은 프로토콜 타임라인을 보여 줍니다. DAI의 이 모형에 있는 사망률은 0%이었다. Mann-Whitney 시험은 개입 후 48시간 동안 15마리의 SHAM 쥐에 비해 15마리의 DAI 쥐에 대해 신경학적 적자가 현저히 크다는 것을 나타냈다(Mdn = 1 대 0), U = 22.5, p< 0.001, r=0.78 (표 2참조). 데이터는 개수로 측정되며 중앙값 및 25-75 백분위수 범위로 표시됩니다.

뇌 조직의 탈라믹 ?...

토론

이 프로토콜은 DAI의 설치류 모델을 설명합니다. DAI에서, 두뇌에 회전 가속은 진보적인 프로세스에 있는 축색기능의 손실로 이끌어 내는 축축및 생화확적인 변경을 일으키는 원인이 되는 전단 효력을 일으키는 원인이 됩니다. 이차 축색 변화는 급속한 축색 스트레칭 부상에 의해 생성되며 그 정도와^{심각도4,,5,,10에}가변적이다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M sodium citrate	SIGMA - ALDRICH
2.5% normal horse serum	SIGMA - ALDRICH	H0146	Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit	SIGMA - ALDRICH	Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody	Vector	BA-1000-1.5	10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine	vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 %	ROMICAL		Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin	SIGMA - ALDRICH	H3136-25G
Hydrogen peroxide solution	Millipore	88597-100ML-F
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope	Olympus
paraffine	paraplast plus leica biosystem		Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS)	SIGMA - ALDRICH	P5368-10PAK	Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP	ABCAM	ab64269	Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene