초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

요약

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브 를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

초기 초파리 배아는 전통적인 및 배아 특이적 소기관의 광대 한 배열을 포함하는 큰 세포입니다. 배아 발생의 처음 세 시간 동안,이 소기관은 액틴 기반 세포질 스트리밍 및 미세 소관을 따라 모터 구동 밀매에 의해 구동되는 극적인 움직임을 겪습니다. 다수의 작은 소기관 특이적 형광 프로브(FP)의 개발은 모든 유전자형에서 광범위한 상이한 지질 함유 구조를 시각화할 수 있게 해주며, 유전적으로 인코딩된 형광단을 필요로 하지 않고도 라이브 이미징을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 살아있는 이미징에 의해 특정 소기관의 밀매를 모니터링하기 위해 Drosophila 배아에 중요한 염료와 분자 프로브를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 지질 방울 (LD)을 라벨링하고 입자 이미지 속도 측정 (PIV)에 의한 벌크 이동을 따름으로써 입증됩니다. 이 프로토콜은 리소좀, 미토콘드리아, 노른자 소포 및 ER을 포함한 다른 소기관의 연구에 적합한 전략을 제공하고 미세 소관을 따라 개별 LD의 움직임을 추적합니다. 상업적으로 이용 가능한 염료를 사용하면 스펙트럼의 보라색 / 청색 및 원적색 영역으로 분리의 이점을 얻을 수 있습니다. 미세주사를 통해 소기관 및/또는 세포골격 요소의 멀티플렉스 공동 표지에 의해, 초파리 의 모든 유전 자원은 형광 태그가 붙은 단백질을 도입할 필요 없이 밀매 연구에 사용할 수 있다. 낮은 양자 수율과 표백제를 쉽게 갖는 유전적으로 인코딩 된 형광단과는 달리, 사용 가능한 염료 중 많은 부분이 높은 광자 수율로 여러 채널을 신속하고 동시에 캡처 할 수 있습니다.

서문

중요한 염료와 분자 프로브는 특정 세포 구조와 소기관을 이미지화하는 강력한 도구입니다. 초파리 배아에서 많은 다른 소기관은 세포 골격 주도 국소화 1,2,3,4를 나타내지 만^, 달걀 껍질이 많은 사람들에게 침투 할 수 없기 때문에 이러한 작은 분자의 적용은 어렵습니다. 이 프로토콜은 소기관의 대규모 밀매를 검출하기 위해 미세주입을 통해 살아있는 배아에서 형광 프로브(FPs)를 사용하는 방법을 기술한다. 이 절차는 주사 용액의 준비, 난자 수집 및 배아 준비, 미세 주사, 이미징 및 이미지 분석을 다룹니다.

소기관의 극적인 공간 재배열은 많은 동물 난모세포, 난자 및 배아에서 흔히 볼 수 있는데, 부분적으로는 이러한 세포의 크기가 크기 때문입니다. 초파리 배아에서, 예를 들어, 지질 방울 (LDs) 및 노른자 소포는 세포화 직전에 배아 중심을 향해 이동한다⁵. 이 움직임은 미세 소관에 의존하며 두 소기관의 고갈 된 배아의 주변부 주위에 ~ 40 μm 영역을 남깁니다. 초기 절단 단계 동안, 많은 소기관은 배아 표면(⁶)에서 액틴-미오신-기반 수축에 의해 구동되는 세포질 흐름에 의해 수송된다. 많은 종의 배아가 유사한 재배열을 나타내지 만, 초파리 배아는 표준 실험실 '실온'에서 외부에서 발달하고, 상대적으로 투명하고, 대부분의 현미경 설정에 적합 할만큼 충분히 작으며, 강력한 유전 도구를 사용하여 조작 할 수 있기 때문에 이미징을 통해 이러한 과정을 따르는 데 특히 적합합니다.

일부 소기관의 경우, 이러한 구조를 특이적으로 표지하는 형광 태그가 붙은 단백질이 이용가능하다. 예를 들어, LSD-2 (dPLIN2라고도 함)는 배아에서 LDs⁷을 특이적으로 표적으로 하는 단백질이다. 플라이 라인은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 LSD-2⁸ 사이의 융합을 코딩하는 유도성 전이유전자 또는 황색 형광 단백질 (YFP)이 내인성 LSD-2 유전자 ^9,10의 코딩 영역에 삽입되는 유전자 트랩을 운반하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 접근법은 이러한 융합 단백질이 낮은 양자 수율을 가지며 쉽게 표백하는 경향이 있다는 것을 포함하여 한계가 있다. 또한 여러 개의 서로 다른 구조를 동시에 표지하는 것은 어려울 수 있습니다 : 많은 소기관의 경우 현재 한 가지 유형의 형광 태그 (종종 GFP 또는 mCherry) 만 사용할 수 있으므로 동시에 두 개의 소기관을 이미징하려면 새로운 전이유전자 또는 삽입이 필요할 수 있습니다. 또한 호환 가능한 태그를 사용할 수 있더라도 단일 변형에 태그를 도입하려면 시간이 많이 걸리는 크로스가 필요할 수 있습니다. 또한 많은 강력한 유전 자원을 덜 편리하게 사용할 수 있습니다 (예 : 두 개의 소기관 마커, Gal4 드라이버 및 유도성 RNAi 구축물이 모두 동일한 어머니에 존재해야하는 경우).

원칙적으로, 이러한 제한은 필수 염료 (예를 들어, 리소좀을 표시하는 LysoTracker), 분자 프로브 (예를 들어, 미세소관을 표지하는 SiR-튜불린), 및 형광 표지된 생물학적 분자 (예를 들어, 지방산 대사를 프로브하는 C12 BODIPY¹¹)를 포함하는 FPs의 사용으로 극복될 수 있다. 배양 된 세포에서의 사용으로부터, 그들은 일반적으로 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구로 잘 검증됩니다. FP는 다재다능하고 우수한 사진 특성을 가지며 형광 단백질과 호환됩니다. 여러 염료를 동시에 혼합하고 적용 할 수 있으며, 종종 스펙트럼의 보라색 / 파란색 및 원적색 영역으로 분리되고 작은 Stokes 이동이 가능하여 채널 출혈을 방지합니다. 작은 스토크스 시프트를 통해 여러 이미징 채널을 동시에 캡처할 수 있으므로 여러 소기관을 한 번에 추적할 수 있습니다. 마지막으로, 그들은 다른 초파리 종의 배아 또는 형광으로 태그 된 단백질을 사용할 수없는 다른 곤충의 소기관을 표지하는 데 똑같이 적용될 수 있습니다.

그러나 이러한 FP의 대부분은 초파리 배아의 정교한 달걀 껍질을 통과 할 수 없습니다. 그것은 다섯 개의 층으로 구성된다: 기계적 손상을 방지하는 세 개의 외부 융모층(chorion)과 화학적 배리어(¹²)를 생성하는 비텔린 멤브레인을 둘러싸는 왁스 층. 단순화를 위해, 왁시 층과 비텔린 막의 조합은 아래의 "비텔린 막"으로 지칭될 것이다. 달걀 껍질을 우회하기 위해이 프로토콜은 초파리 배아에 FP를 도입하기 위해 확립 된 배아 미세 주입 접근법 을 채택합니다 . 이 프로토콜은 절단 단계 배아에서 LDs의 세포질 흐름을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 주사 바늘과 계란 수집 케이지의 준비, 계란 수집 과정 및 chorion의 기계적 제거가 포함됩니다. 배아를 미세 주입하고 이미지화하는 방법과 입자 이미지 속도 측정 (PIV,⁶에서 적응)을 사용하여 LD의 벌크 흐름을 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 배아 생존을 보장하고 이미징을위한 최상의 시스템을 만들기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공합니다. 또한 프로토콜이 LDs 및 미세소관을 동시에 이미지화하거나 리소좀, 미토콘드리아, 노른자 소포 및 소포체 (ER)를 포함한 다른 소기관의 연구에 적용되도록 변형 될 수있는 방법이 논의됩니다.

프로토콜

1. 필요한 자료 준비

참고 : 이러한 준비는 며칠 또는 몇 주 전에 수행하는 것이 가장 좋습니다.

1. 주사 바늘을 준비하십시오.
   참고 : 바늘은 덮인 용기에 무기한 보관할 수 있습니다. 바늘은 ~ 700 fL을 전달할만큼 충분히 미세해야하며 vitelline 멤브레인을 관통 할만큼 강해야합니다.
   1. 모세관을 바늘 풀러의 모세관 홀더에 놓습니다. 윙넛으로 모세관을 고정하십시오. 모세관의 중심을 발열체와 정렬하여 두 개의 대칭 바늘이 생성되도록 합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러에서 적절한 설정을 선택하십시오.
   3. 해부 범위를 사용하여 품질 관리를 수행합니다.
      참고 : 바늘 팁은 가능한 한 미세해야합니다. 금이 가거나, 들쭉날쭉하거나, 큰 보어 바늘 팁은 버려집니다.
   4. 한 번에 10 개의 바늘 (5 개의 모세 혈관 상당)의 배치를 준비하십시오.
   5. 뚜껑이있는 용기 바닥의 중앙에 실린더로 말린 변형 가능한 퍼티를 놓습니다. 바늘을 퍼티에 조심스럽게 눌러 바늘 끝이 공기 중에 안전하게 매달려 손상을 방지하도록 수평으로 고정시킵니다. 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 보관하십시오.
2. 계란 수집 접시를 준비하십시오. 4°C에서 보관한다.
   참고 : 계란 수집 접시는 알을 낳는 것을 장려하기 위해 과일 주스로 보충 된 작은 한천 접시입니다. 이들을 준비하는 방법은^{도 13}을 포함한 많은 프로토콜에 기술되어 있다.
3. 헵탄 접착제를 준비하십시오.
   참고 :이 접착제는 양면 테이프에서 추출되어 배아를 커버 슬립에 단단히 부착하는 데 사용됩니다. 그것은 주입 및 이미징 중에 배아가 초점에서 벗어나는 것을 막습니다. 접착제는 며칠 또는 몇 주 전에 미리 준비 할 수 있습니다.
   1. 양면 테이프를 골프공보다 큰 크기로 볼업하고 단단히 밀봉된 뚜껑이 있는 ~50mL 유리 용기의 바닥에 놓습니다. 충분한 접착제가 존재할 수 있도록 테이프를 단단히 포장하십시오.
   2. 흄 후드에서 유리 용기를 헵탄으로 채워 모든 테이프를 덮으십시오. 사용하지 않을 때는 용기를 단단히 닫아 두십시오.
      주의: 헵탄은 액체와 증기로서 가연성입니다. 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 호흡 증기는 졸음, 현기증 및 폐 손상을 일으킬 수 있습니다. 헵탄을 발화원으로부터 멀리하고 가연성 물질을 위해 통풍이 잘되는 곳에 보관하고 호환되지 않는 물질로부터 멀리하십시오.
   3. 헵탄 접착제를 하룻밤 또는 더 오래 앉히십시오. 최상의 결과를 얻으려면 용기를 셰이커 또는 다른 교반기에 밤새 올려 놓아 접착제를 용해시킵니다.
      참고: 테이프 자체는 그대로 유지되지만 접착제는 헵탄에 용해됩니다. 단계 5.1.2에서, 접착제는 커버슬립에 도포되고; 헵탄은 증발하여 접착제를 남겨 둡니다.
   4. 유리 슬라이드에 한 방울을 놓고 헵탄이 증발하면 끈적 끈적한 잔류 물이 남아 있는지 확인하여 헵탄 접착제 준비를 테스트하십시오. 나중에 접착제 잔류 물이 보이지 않으면 유리 용기에 테이프를 더 추가하고 이전 단계를 반복하십시오.
      참고 : 일단 준비되면 접착제를 몇 달 또는 몇 년 동안 사용할 수 있습니다.
4. 상업적으로 얻은 제제를 순수한 무수 DMSO로 희석하여 1 mg/mL (3.8 mM) BODIPY493/503 원액을 제조하였다. 빛과 물로부터 보호하기 위해 덮어 두십시오. -20°C에서 무기한으로 보관하거나 4°C에서 단기간에 보관하십시오.

2. 계란 수집 케이지 준비

참고 : 계획된 주사 전에 적어도 하루 (바람직하게는 2 ~ 3 일) 전에하십시오.

1. 효모 페이스트를 준비하십시오.
   참고 : 효모 페이스트는 사과 주스 접시에 제공되지 않은 단백질 및 기타 필수 영양소를 보충합니다. 그것은 계란 생산과 알을 낳는 것을 촉진합니다.
   1. 건조 베이커 효모 2-10g을 넣은 다음 작은 비이커에 수돗물 1mL를 넣으십시오. 주걱을 사용하여 혼합하십시오.
   2. 원하는 치약과 같은 일관성에 도달 할 때까지 수돗물을 1mL 단위로 계속 첨가하십시오.
   3. 혼합물을 덮고 4°C에서 저장한다.
2. 계란 수집을위한 플라이 케이지를 설정하십시오.
   참고 : 원하는 유전자형의 수컷과 암컷 파리가 필요합니다 : 2 주 미만의 암컷 10-50 마리와 비슷한 수의 수컷. 플라이 케이지에 대한 다양한 옵션을 사용할 수 있으며, 여기에는 수제 옵션^14,13이 포함됩니다. 사과 주스 접시의 크기가 플라이 케이지의 크기와 일치하는 것이 중요합니다.
   1. 사과 주스 접시에 효모 페이스트의 작은 얼룩을 놓습니다. 파리가 너무 추울 경우 접시에 알을 낳지 않기 때문에 덮고 실온에 이르게하십시오.
   2. 파리를 배아 수집 케이지로 옮기고, 효모 사과 주스 플레이트로 밀봉하고, 플레이트를 배아 수집 케이지에 고정시킵니다.
   3. 새로 옮긴 파리가 1-2 일 동안 새장에 적응하도록 허용하고 접시를 매일 신선한 것으로 교체하십시오. 모든 효모가 다음 날까지 먹은 경우, 향후 수집을 위해 효모 페이스트의 양을 늘리십시오.
      참고 : 이것은 잘 먹은 암컷이 더 많은 알을 낳을 때 계란 수확량을 증가시키는 중요한 단계입니다.

3. 주사 당일에 주사 용액을 준비하고 바늘에 적재하십시오.

1. BODIPY 493/503 (DMSO 중 3.8 mM)의 원액을 주사액으로 사용한다.
2. 바늘 로딩 팁을 사용하여 1 μL의 주사 용액으로 단일 바늘을로드하십시오.
   참고 : 기포를 가두지 않고 액체를 끝까지 끝까지 가져 오도록 노력하십시오. 우발적 인 파손의 경우로드 된 바늘을 신속하게 교체 할 준비를하십시오.
   1. 로딩 팁을 마이크로피펫에 부착하고 1 μL의 주사 용액을 팁에 그린다. 장갑을 사용하여 바늘을 한 손으로 잡고 팁을 가리켜 파손 위험을 최소화하십시오.
   2. 조심스럽게 로딩 팁을 바늘에 넣고 바늘 팁 가까이로 밀어 넣으십시오. 바늘 끝 근처에 액체를 분배하십시오. 피펫을 제거한 후 액체가 팁으로 흐를 때까지 바늘을 팁으로 수직으로 잡으십시오.
3. 적재 된 바늘을 위와 같이 퍼티가있는 별도의 용기에 보관하십시오 (1.1.5 단계 참조).
   참고 : 바늘은 주사 전 (최대 몇 시간)에 준비해야하지만 하루 이상 후에는 사용해서는 안됩니다.
4. 염료의 표백을 방지하기 위해 바늘을 주변 빛에서 벗어나십시오. 바늘 끝을 손상시키지 않고 알루미늄 호일로 보관 용기를 덮으십시오. 모든 조명이 가려져 있는지 확인합니다.

4. 주사를 위한 배아 수집

참고 : 수집시기는 주사가 수행되어야하는 배아의 단계에 따라 다릅니다. 아래의 타이밍 체계에 따라, 주사 준비시의 배아는 0-90 분 된 것이며, 이는 절단 단계¹⁵에 해당합니다.

1. 주사 당일에 2.2.1 단계와 같이 효모로 사과 주스 플레이트를 준비하십시오. N 라운드의 주사가 계획되면 N + 2 플레이트를 준비하십시오. 이 플레이트를 실온에서 보관하십시오.
   참고 : 주사를 위해 배아를 수집하기위한 N 플레이트 외에도 한 플레이트는 사전 수집 플레이트로, 다른 플레이트는 수집이 완료되면 케이지의 파리를 먹이기 위해 필요합니다.
2. 케이지의 플레이트를 신선한 효모 플레이트 (사전 수집 플레이트)로 교체하고 1-2 시간 동안 케이지에 두십시오.
3. 케이지의 플레이트를 새 플레이트 (수집 플레이트)로 교체하십시오. 사전 수집 플레이트는 원하는 것보다 오래된 배아를 포함하므로 폐기하십시오. 그런 다음 파리가 1.5 시간 동안 알을 낳게하십시오.
   참고 : 잘 먹은 파리는 일반적으로 알이 수정 된 직후에 알을 낳기 때문에 1.5 시간의 수집 시간은 수집이 끝나면 접시에있는 대부분의 배아가 0-90 분, 즉 절단 단계에 있음을 보장합니다. 전날부터 신선한 효모를 먹지 않은 암컷 파리는 누워 있기 전에 확정되지 않은 시간 동안 수정 된 알을 유지하는 경향이 있습니다. 따라서, 사전 수집 플레이트는 수집 시작 전에 수정 된 배아를 가질 수 있으며, 따라서 60 분보다 오래되고, 때로는 훨씬 오래되었습니다.
4. 케이지의 접시를 신선한 효모 플레이트로 교체하십시오. 길 잃은 파리가 알을 낳지 않도록 수집 접시를 덮으십시오.

5. 미세 주사를위한 배아 준비

1. 필요한 재료를 조립하십시오.
   1. 양면 테이프 조각을 유리 슬라이드에 부착합니다. 끈적임을 줄이기 때문에 손가락으로 테이프를 만지지 마십시오.
      참고: 이 슬라이드는 이미징이 아닌 chorion을 제거하는 데 사용됩니다.
   2. 전사 피펫 또는 마이크로피펫(p200 또는 p1000)을 사용하여 직사각형 커버슬립(60 x 25mm)의 중앙에 대략 헵탄 글루의 작은 방울(200μL 이하)을 놓습니다. 헵탄이 증발하도록 허용하십시오 (이것은 분 미만 소요).
      참고 :이 커버 슬립은 주사 및 이미징을 위해 배아를 장착하는 데 사용됩니다. 치수는 공초점 현미경의 조정 가능한 금속 홀더에 맞게 선택됩니다.
   3. 건조 챔버, 건조성 비드를 함유하는 밀봉된 챔버 (예를 들어, 터퍼웨어 샌드위치 박스)를 조립한다. 수분을 공급하지 않은 건조 비드 만 사용하십시오.
      참고 : 배아가 주사 용액을 차지하도록하려면 배아를 약간 건조시켜 내부 압력을 줄여야합니다. 이것은 데코리온화되고 공기에 노출 된 배아가있는 커버 슬립을 건조 챔버에 배치함으로써 수행됩니다.
2. 기계적으로 chorion을 제거하십시오.
   1. 적절하게 숙성된 배아 플레이트를 Halocarbon Oil 27의 얇은 층으로 덮어 달걀 껍질을 투명하게 바꿉니다.
      참고 : 배아는 수십 초 이내에 반투명^{해집니다 15}. 이 단계가 효율적으로 발생하지 않으면 사과 주스 접시가 너무 젖어서 사용하기 전에 말려야 할 수도 있습니다.
   2. 플레이트를 트랜스 일루미네이션 (즉, 플레이트를 통해 아이피스로 들어가는 빛)으로 해부 범위 아래에서보고 배아의 단계를 확인하십시오.
   3. 절단 단계에서 배아를 선택하십시오.
      참고 : 절단 단계 배아는 완전히 불투명합니다. 후속적인 배반배엽 단계는 불투명 중심(¹⁵) 주위의 투명한 세포질 밴드에 의해 인식될 수 있다. 다양한 배아 단계를 인식하는 방법에 대한 좋은 소개는 발달 생물학 학회가 관리하는 웹 사이트 (참고 문헌¹⁶)에서 구할 수 있습니다.
   4. 미세한 핀셋을 사용하여 등쪽 부속기로 원하는 단계의 배아를 잡고 양면 테이프 조각으로 덮인 준비된 유리 슬라이드로 옮깁니다. 배아를 테이프에 놓습니다. 오일의 전달을 최소화하십시오.
   5. 가능한 한 부드럽게 핀셋 끝의 측면으로 배아를 부드럽게 밀어 테이프 표면을 가로 질러 배아를 굴립니다. 날카로운 핀셋 팁으로 배아를 직접 찌르지 마십시오.
      참고 : 가해지는 힘이 너무 낮 으면 배아가 굴러 가지 않습니다. 너무 높으면 파열됩니다. 적절한 중간 힘을 찾으려면 경험이 필요하며,이 단계는 사전에 연습되어야합니다.
   6. chorion이 일시적으로 테이프와 균열에 부착 될 때까지 배아를 계속 굴립니다.
   7. 일단 chorion이 균열되면, chorion이 테이프에 붙어있는 채로 남아 있기 때문에 chorion에서 배아 (여전히 vitelline 막 내부)를 분리하기 위해 계속 굴러갑니다.
   8. 쵸 리온이 배아에서 등쪽 부속기의 손실을 관찰하여 완전히 제거되었는지 확인하십시오.
   9. 배아를 테이프보다 접착력이 떨어지는 chorion에 다시 굴립니다. 전달을 위해 핀셋에 부착 될 때까지 핀셋으로 배아를 부드럽게 문지릅니다.
   10. 배아를 헵탄 접착제로 커버 슬립으로 옮기고 접착제와 접촉하게하십시오.이 접착제는 일반적으로 핀셋에서 분리됩니다.
   11. 커버 슬립에서 배아의 방향을 조정하십시오.
       1. 배아의 측면 표면을 접착제에 삽입하십시오.
          참고 : 접착제에 내장 된 배아의 표면은 이미지화 될 것입니다. 측면 표면을 임베딩하는 것이 가장 간단하지만 개인적인 취향이나 대답 할 생물학적 질문에 따라 조정할 수 있습니다.
       2. 배아의 긴 축을 커버슬립의 긴 축에 수직으로 맞춥니다.
       3. 배아가 바람직한 방향으로 놓여 있지 않다면, 핀셋을 청소하여 접착제에서 배아를 분리 할 오일을 제거하십시오. 그런 다음 배아를 부드럽게 롤 할 수 있습니다.
   12. 상기에서 설명된 방식으로 주사를 위해 원하는 수의 배아를 준비한다.
       참고 : chorion을 제거한 후 시간이 지남에 따라 주변 공기가 배아를 건조시키기 시작하므로 5.3 단계의 효과는 다른 시간에 데코리온화 된 커버 슬립의 배아에 대해 고르지 않을 것입니다. 일반적으로 1-3 개의 배아가 가장 관리하기 쉽습니다.
3. 건조된 배아.
   1. 배아가있는 커버 슬립을 준비된 건조 챔버에 넣고 밀봉하십시오.
   2. 배아가 5-12 분 동안 건조되도록하십시오.
      참고: 이 단계의 타이밍은 주변 온도 및 습도에 따라 다르므로 경험적으로 결정해야 합니다.
   3. 챔버에서 커버슬립을 제거하고 Halocarbon Oil 700 한 방울을 그 위에 올려 놓고 배아를 완전히 덮어 추가 건조를 방지합니다.
   4. 적절한 건조를 판단하기 위해 해부 범위에서 배아를 검사하십시오.
   5. 배아가 단지 약간 분쇄되었지만 팽창되지 않으면, 미세 주사로 진행하십시오 (단계 6).
   6. 배아가 충분히 또는 과도하게 건조되지 않은 경우, 단계 5.2로 돌아가서 Halocarbon Oil 700을 제거할 수 없으므로 새로운 배아 배치를 준비하십시오. 배아가 지나치게 건조되면 다음 배아 배치에 대한 건조 시간을 3 분 단축하십시오. 건조가 부족하면 건조 시간을 3 분 정도 늘리십시오.

6. 미세 주입 배아

참고: 미세주입 설정에는 거꾸로 된 현미경, 주사 바늘을 잡고 위치시키는 미세 조작기, 제어된 부피를 전달하는 상업용 미세 인젝터가 포함되어 있는지 확인하십시오.

1. 마이크로 인젝터의 전원을 켜고 원하는 설정을 입력합니다.
   참고: 이 프로토콜의 경우 선형 동작 출력과 빠른 설정을 사용하는 것이 좋지만 다른 많은 프로토콜이 작동합니다. 운영자는 개인 취향을 결정해야합니다.
2. 바늘을 미세 조작기에 적재하십시오. 배아가 들어있는 커버슬립을 적재하는 동안 바늘이 손상되는 것을 방지하려면 바늘을 안전한 위치로 옮기십시오.
3. 커버 슬립을 무대 위에, 배아를 위에, 바늘 쪽으로 놓습니다. 그런 다음 바늘을 주사 할 위치로 조심스럽게 옮기고 팁은 여전히 무대 위에 있습니다.
4. 4x 목표를 조명 경로에 넣습니다. 현미경의 초점 손잡이를 사용하여 배아에 초점을 맞 춥니 다.
   참고: 이것은 사출에 사용되는 초점 평면이며 앞으로 최소한으로 조정됩니다.
5. 스테이지 컨트롤을 사용하여 배아를 시야각의 중앙으로 수평으로 이동합니다.
   1. 배아에서 멀리 떨어져서 바늘을 낮추기 위해 시야의 가장자리에 보관하십시오. 바늘이 올바른 위치로 낮아지도록 동일한 초점 평면에 머물러 있습니다.
6. 바늘 끝을 올바른 초점면으로 내리고 배아와 함께 시야에서 볼 수 있도록하십시오.
   1. 마이크로 매니퓰레이터 컨트롤을 사용하고 위에서 바라 보면서 (아직 아이피스를 통하지 않음) 바늘 끝을 천천히 오일에 떨어 뜨려 목표가 가리키는 영역을 목표로합니다. 기름은 매우 점성이 있으므로 바늘이 손상되지 않도록 천천히 가십시오.
   2. 바늘이 아이피스를 통해 보이면 바늘 팁이 초점이 맞춰지고 시야의 중심에 올 때까지 미세 조작기 컨트롤을 계속 사용하십시오.
   3. 무대를 움직여서 배아를 시야의 중심으로 되돌려 놓으십시오. 스테이지 컨트롤, 미세 조작기 컨트롤 및 초점 노브를 사용하여 둘 다 초점을 맞추는 동안 배아와 바늘 끝의 위치를 서로 미세 조정하십시오. 커버 슬립에 최대한 가깝게 주사를 수행하는 것을 목표로하십시오.
7. 바늘 품질 관리를 수행하십시오.
   1. 바늘이 기능적인지 확인하기 위해, 오일에 거품으로 보이는 배아를 둘러싸고 있는 Halocarbon Oil 700에 주사액 중 일부를 분배하십시오.
   2. 바늘에서 아무 것도 흘러 나오지 않으면 점차적으로 인젝터의 압력을 증가시킵니다. 이것이 작동하지 않으면 새로운 바늘을 얻으십시오.
8. 배아를 주입하십시오.
   참고: 허용되는 주입 부피의 범위는 ~0.06-1 pL입니다. 하한은 배아에 들어가는 것을 시각화 할 수있는 것에 의해 설정됩니다. 상한은 주사가 배아에 가하는 외상에 의해 설정됩니다.
   1. 배아의 측면 가장자리를 따라 주입하면 이것이 가장 침습성이 적기 때문입니다.
   2. 단계 조절을 사용하여 후자가 배아를 부드럽게 구멍을 뚫고 들어갈 때까지 배아를 바늘 끝쪽으로 움직입니다.
   3. 동시에, 주사 용액의 흐름을 시작하고 바늘 끝 부위에 일시적인 명확한 반점이 나타나는지 관찰하십시오.이 반점은 액체가 배아로 성공적으로 전달되었음을 나타냅니다.
   4. 배아를 모니터링하십시오. 배아가 바늘에 저항하고 진입시 파열 (세포질이 분출)되면 5 단계로 돌아가서 건조 시간을 늘리십시오. 배아가 커버슬립에 대해 평평하고 주사 중에 플로피가 나타나면 5 단계로 돌아가서 건조 시간을 단축하십시오.
   5. 배아에 색소가 들어가지 않은 경우, 단계 6.7에서와 같이 염료가 여전히 바늘로부터 자유롭게 흐를 수 있음을 확인한다. 염료가 흐르지 않으면 바늘을 교체하십시오. 염료가 흐르면 새로운 배아를 주입하고 바늘이 배아에 구멍을 뚫기 직전에 염료를 방출하기 시작하십시오.
      참고 : 동일한 배아의 반복 주사는 이전 상처 / 주사 부위를 파열시키기 때문에 권장하지 않습니다.
9. 모든 배아가 주입 될 때까지 반복하십시오.

7. 이미지 배아

참고: 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용합니다.

1. 공초점 현미경의 금속 홀더에 커버 슬립을 배치하여 배아가 커버 슬립을 통해 아래에서 직접 이미지화되도록하십시오. 커버 슬립 위에는 기름 만 있고 다른 장벽은 없습니다.
2. 품질 관리 단계로서, 먼저 공초점 현미경 상의 후피형광 기능을 이용하여 40x 목적을 갖는 이미지. 진행하기 전에 형광단이 배아에서 보이는지 확인하십시오.
3. 원하는 이미징 평면이 주사 부위와 다른 경우 염료가 대상 영역으로 확산 될 수있는 충분한 시간을 허용하십시오.
   참고: BOPIPY 493/503의 경우 이 시간은 일반적으로 30-60분 사이입니다. 확산 시간은 염료에 크게 의존하기 때문에 다른 염료는 주입 부위 및 대기 시간을 최적화해야 할 수도 있습니다.
4. 서로 다른 스케일로 이미징하기 위해 다양한 목표를 사용하십시오. 40x 목표를 사용하여 모든 배아를 이미지화하고 63x 목표를 사용하여 더 작은 스케일의 하위 섹션을 이미지화합니다.
5. 셀룰러라이제이션 전 동기화 단계 동안의 라이브 이미징의 경우 512 x 512 픽셀의 이미지 크기, 3의 라인 평균, 초당 0.1프레임의 프레임 속도(즉, 10초마다 획득한 1프레임)로 시작하는 조건을 사용합니다. 사용 된 현미경의 기능에 따라 조건을 조정하십시오.
   참고: 이러한 조건을 통해 BOPIPY 493/503에서 ~500개 이상의 이미지를 획득하고 대부분의 동작을 캡처할 수 있습니다.

8. 먼저 FIJI를 사용하여 일련의 이미지를 준비한 다음 PIV 분석을위한 파이썬을 사용하여 LD 흐름을 분석하십시오.

1. 이미지 획득을 최적화합니다.
   1. 적절한 단계에서 원하는 염료의 주사를 수행하십시오. 일상적인 변동이 무시할 수 있을 때까지 이 단계를 반복합니다.
   2. 배율, 확대/축소, 해상도 및 프레임 속도를 포함한 이미지 수집 설정을 최적화합니다.
      참고: 고품질 이미지(해상도 + 라인 평균화)와 획득 속도(프레임 속도) 사이에는 절충점이 있습니다.
2. FIJI에서 데이터를 준비합니다.
   1. 분석할 고품질 시계열을 가져옵니다.
   2. 시계열의 한 프레임을 열어 FIJI가 있는 마스크를 생성합니다. 이미지를 복제합니다. 이미지의 유형을 8비트로 변환합니다.
   3. 다각형 또는 자유형 선택 도구를 사용하여 배아의 경계를 정의합니다. 외부 지우기를 사용하여 선택 영역 외부의 픽셀 값을 0으로 설정합니다. 선택 영역 내에서 지우기를 한 다음 반전하여 선택 영역 내의 픽셀 값을 최대값(255)으로 설정합니다.
   4. 선택을 취소한 다음 히스토그램 명령을 사용하여 0과 255의 픽셀 값만 존재하는지 확인합니다.
   5. 이 새 이미지 마스크를 특정 시계열에 대해 저장합니다.
   6. 관심 있는 시계열을 엽니다. 관심 시간을 가장 잘 포착하는 열 개의 프레임을 선택하십시오 (예 : 피질 수축이 시작될 때의 핵 사이클 9). 관심 있는 열 프레임을 복제하여 서브스택을 형성합니다.
   7. 이미지에 스택 기능을 사용하여 PIV로 분석할 10개의 이미지를 생성합니다.
   8. 순서를 유지하는 방식으로 개별 파일을 저장합니다 (SeriesX_1, SeriesX_2 SeriesX_3 ...).
3. PIV 분석을 위해 준비된 마스크와 개별 프레임을 사용하여 제공된 샘플 파이썬 스크립트 (보충 데이터) 또는 사용자가 생성 한 사용자 정의 스크립트를 사용합니다.
   참고 : 제공된 스크립트는 OpenPIV¹⁷의 파이썬 응용 프로그램을 기반으로합니다. 픽셀 너비와 프레임 속도를 사용하여 변환 할 수있는 거리를 픽셀 단위로 출력하여 속도 또는 속도를 생성합니다.
4. 추가 배아에 대한 이전 단계를 완료하고 출력 값을 컴파일하여 반복실험을 생성합니다.

결과

주사 후, 염료는 바늘 팁이 삽입된 부위에서만 국소화될 것이다. 염료는 확산 특성에 따라 주사 부위에서 멀리 확산됩니다. 그림 1은 BODIPY 493/503의 주입을 보여주며, 주사 직후(패널 A)와 24분 후(패널 B)를 보여줍니다. 24 분 후, 염료는 배아의 긴 축의 중간 지점까지 대략 만들었습니다.

소기관 운동성 분석은 염료 주입 및 타임랩스 이미징을 통해 달성될 수 있다. 도 2에서, 배아를 BODIPY 493/503 (도 2A) 및 LysoTracker Red (도 2B)과 공동 주사하고, 각각 488 및 596 nm에서의 레이저 여기를 사용하여 이미지화하였다. 이 배아를 이어서 타임랩스 영상화하였다(30분 동안 30초마다 한 프레임씩 분석). 그런 다음 시계열은 PIV 분석을 통해 실행되었으며, 출력은 그림 2A, B의 유선형을 통해 표시됩니다. 유선형은 개별 입자의 궤적을 나타내는 것은 아니지만 세포질 흐름은 세포질의 해당 영역에있는 모든 입자를 분석함으로써 추론됩니다. PIV 분석은 두 개의 독립적 인 세포 구조 (LD 및 산성 소기관)의 표지를 통해 유사한 흐름을 발견하며, 두 라벨 모두 세포질이 배아의 내부로 유입되는 배아의 중앙 영역에 수렴합니다⁶.

현재 이용 가능한 FP는 많은 다른 소기관 및 세포 구조의 라벨링을 허용한다. 그림 3 은 ER 추적기 Green을 통한 ER의 라벨링을 보여줍니다. ER 추적기는 핵 외피의 좋은 해상도를 제공하여 주요 세포 주기 단계를 시각화할 수 있습니다. ER 트래커 그린은 488nm 여기를 사용하여 이미지화됩니다.

미토콘드리아의 라벨링은 시험된 대부분의 염료가 그들이 들어가는 첫 번째 미토콘드리온에 갇혀있는 것처럼 보이기 때문에 까다롭습니다. 한편, 염료 독성의 징후가 검출되지 않았고, 세포화 및 외배엽 핵 사이클 15를 통해 표지된 미토콘드리아를 따를 수 있게 되었다. 도 4 는 Mitoview 633 (여기 파장 633 nm)으로 주사 후 몇 시간 후에 외배엽 세포를 도시한다.

BODIPY, Lysotracker 및 LipidSpot은 견고하며 512 x 512, 라인 평균 3, 프레임 속도 1/s ~ 0.1/s에서 ~ 500 + 이미지를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. ER 트래커 Green, SiR-tubulin 및 언급 된 미토콘드리아 염료는 덜 견고하며 동일한 조건에서 ~ 50-200 개의 이미지를 생성합니다.

blastoderm 단계에서 시작하여 LD는 반대 극성 모터 kinesin-1 및 세포질 dynein⁵에 의해 구동되는 미세 소관을 따라 양방향으로 움직입니다. 이 움직임은 BODIPY 493/503 및 SiR-Tubulin을 모두 주입하여 LD와 미세 소관을 공동 라벨링하여 시각화할 수 있습니다(그림 5). LD가 자주 이동 방향을 역전시키기 때문에(키네신-1과 세포질 다이닌 사이를 전환할 때), 획득 중에 프레임 속도가 높을수록 LD 운동성에 대한 중요한 세부 사항을 더 잘 포착할 수 있습니다.

자가 형광 노른자 소포의 라이브 이미징은 어떤 형태의 염료 주입 없이도 가능합니다 (그림 6). 그러나, 자가형광은 희미하고, 여기 레이저는 광독성이다. 따라서, 자가형광 노른자의 라이브 이미징은 염료 주입에 비해 불량한 신호 대 잡음비를 갖는다.

그림 1: 배아를 통한 BODIPY 493/503의 확산. 염료는 전방 말단 (오른쪽 상단)을 향한 측면 가장자리를 따라 주사되었고,이 주사 부위에서 배아로 확산되어 LDs를 표지합니다. (A) 염료는 주사 부위에 인접한 배아의 일부를 통해 확산되었습니다. (B) 대략 24분/2회의 핵 사이클 후에, 염료는 배아의 중간점을 지나서 확산되었다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: LD 및 산성 소기관에 대한 입자 이미지 속도측정(PIV) 배아에 BODIPY 493/503 및 LysoTracker Red를 모두 주사하였다. (A) 보디피 채널. (B) 리소트래커 레드 채널. (A', B') A와 B에 표시된 것을 포함하여 10개의 순차적 프레임에서 생성된 두 채널의 PIV 분석에 의해 생성된 간소화된 다이어그램. A'는 LD의 흐름에 해당하고, B'는 산성 소기관의 흐름에 해당한다. A'와 B' 모두 배아 내용물이 시야에서 배아의 중앙으로 흘러 나오는 왼쪽 중심 합류를 보여줍니다. 또한 BODIPY는 다른 염료가 다른 확산 특성을 가지고 있기 때문에 LysoTracker보다 더 많이 확산되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: ER 추적기는 동기화 핵 분열을 라벨로 표시합니다. 세포융합 배반엽 배아를 ER 추적기로 미세 주입하고 그 표면의 일부를 시간이 지남에 따라 영상화하였다. (A) 핵 분할 중 스핀들 조립. (B) 동일한 분할 동안 핵 봉투의 압수. (c) 후속 인터페이즈. (D) 다음 분할의 시작은 중심 모양 (화살촉으로 표시된 원형 ER 프리 영역의 발생)으로 표시됩니다. 점진적인 염료 표백에 유의하십시오. 여기 파장: 488 nm. 스케일 바: 5 μm. A: 초기 프레임, B: 3분 경과 , C: 10분 경과 및 D: 13분 경과 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 미토콘드리아의 Mitoview 633 표지. 배아를 세포질 배반배엽 단계 동안 Mitoview 633과 함께 주사하고, 세포화 후 4시간 후에 영상화하였다. 이미지는 배아 밴드 확장에서 배아의 신경 외배엽 세포를 보여줍니다. 스케일 바: 5 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: LDs 및 미세소관의 공동 표지. 세포화 배아에 BODIPY 493/503 (황색 A, B, C) 및 SiR 투불린 (마젠타 A', B', C')의 혼합물을 주입하였다. A'', B'', C'' 는 병합된 채널을 표시합니다. 패널 A, A' 및 A'''는 초기 프레임을 표시하고, 패널 B, B' 및 B'''는 5초 후에 프레임을 표시하고, 패널 C, C' 및 C ''는 10초 후에 프레임을 표시합니다. 스케일 바: 5 μm. 512 x 512 프레임(라인 평균 3)은 2.5초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 동기화 절단 단계 동안 노른자 소포 자기 형광 이미징 . (A) 획득 시작시. (B) 8분 후 (C) 16분 후 여기 파장: 405 nm. 낮은 여기 강도는 배아를 살아 있게 하기 위해 사용되었다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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토론

초파리 배아는 세포 및 유기체 생물학의 근본적인 질문을 연구 할 수있는 강력하고 편리한 모델입니다. 상대적으로 단순하고 강력한 유전학 및 크기가 작기 때문에 세포 과정과 발달을 이미징하는 데 탁월한 시스템입니다. 여기서, 표준 미세주입 프로토콜은 배아에서 FP 사용을 가능하게 하도록 적응된다. 이 접근법은 유전적으로 인코딩 된 형광단을 필요로하지 않고 특정 세포 구조의 형광 이미징을 허용하여 이미징에 많은 유전 적 배경을 열어줍니다. 여러 염료와 전략적으로 선택된 형광 태그가 지정된 단백질을 결합하면 가시광선의 전체 스펙트럼에 걸친 다중 채널 라이브 이미징을 열 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계:
이 프로토콜은 BODIPY 493/503을 사용하여 LD에 라벨을 붙입니다. 이 접근법은 다른 세포 구조를 표시하도록 쉽게 적응될 수 있다. 후속 이미지 분석을 위해, 가장 중요한 인자 중 하나는 신호 대 잡음비, 즉 배경 신호와 비교된 염료의 밝기이다. 리소좀은 도 2, 도 3, 도 4, 도 5에 도시된 바와 같이, 미토콘드리아(Mitoview 633, 200 μM), ER(ER 트래커 그린, 10 μM), 및 미세소관(DMSO 중의 SiR 튜불린, 200 nM)뿐만 아니라 성공적으로 이미지화되었다(LysoTracker Red, 1 mM), 뿐만 아니라 ER(ER 트래커 그린, 10 μM), 및 미세소관(DMSO 중의 SiR 튜불린, 200 nM)도 5에 도시된 바와 같다. 또한, 노른자 소포는 자가 형광성이며 UV 여기 시 청색광을 발산한다(여기 파장으로 405nm를 사용하는 이미지(그림 6)). 다른 염료의 경우, 염료 농도가 배양된 세포를 염색하는 데 필요한 것의 100-1,000x가 되는 것을 목표로 한다. 이것은 세포 배양 배지로 희석될 원액의 농도와 유사하다. 이 프로토콜은 100 fL의 주사를 요구하고 초파리 배아는 부피¹⁸에서 대략 9 nL이기 때문에, 이들 염료 농도는 세포 배양 배지에 존재하는 것의 1/100 미만의 내부 배아 농도로 평균화될 것이다. 일시적으로, 국소 농도는 주사 부위에서 더 높을 것이며, 이는 잘 확산되지 않는 FP (즉, 미토콘드리아 염료 및 SiR-튜불린)와 가장 관련이 있습니다. 이러한 FP의 경우 권장 고농도에서 시작하십시오. 예기치 않은 사망이 관찰되면 생존과 신호 강도 사이의 수용 가능한 타협에 도달 할 때까지 연속적으로 두 배로 희석하십시오.

여러 염료를 공동 주입 할 때 두 염료 모두 동일한 용매에 있거나 용매와 염료 모두 혼합물과 호환되어야합니다 (~ 10 %를 초과하는 알코올 농도는 권장되지 않음).

바늘의 품질은 팁이 가능한 한 미세해야하기 때문에이 절차의 성공에 필수적입니다. 그렇지 않으면, 주사 상처로부터의 손상은 배아의 후속 발달을 손상시킬 수 있습니다. 상업용 바늘 풀러가 다르기 때문에 제조업체의 제안을 따르고 원하는 모양이 달성 될 때까지 여러 당김 매개 변수를 시도하는 것이 중요합니다. 금이 가거나 들쭉날쭉하거나 큰 보어 바늘 팁으로 작업하면 성공적인 주입이 더 어렵거나 불가능해질 수 있으므로 품질 관리 단계 1.1.3을 수행하는 것이 중요합니다.

배아는 주사 중에 추가 부피의 액체가 첨가 될 수 있도록 부분적으로 건조되어야합니다. 배아가 건조되지 않으면 바늘이 쉽게 들어 가지 않으며 바늘이 침투하거나 용액이 주입 될 때 세포질이 분출됩니다. 배아가 과도하게 건조되면 수축 된 것처럼 보이고 제대로 발달하지 않습니다. 정확한 건조 시간은 공기 습도와 같은 지역 조건에 따라 다르며 날마다 바뀔 수 있습니다. 각 세션에 대해 경험적으로 결정되어야합니다.

미세 주사 후 배아가 생존 할 수있는 능력은 바늘의 품질, 적절한 건조 및 주사 부피를 1pL (이상적으로는 100 fL) 미만으로 제한하는 데 결정적으로 달려 있습니다. 이러한 파라미터가 최적화되는 한, 기술된 염료가 권장 농도로 주입될 때 유의한 독성은 명백하지 않다. 배아가 건조 및 주사 단계에서 생존하는 경우, 그들은 전형적으로 세균 밴드 확장으로 성공적으로 잘 발달하며, 예외는 높은 수준에서 세포화 결함을 일으킨 미세 소관 및 ER 프로브입니다 (각각의 스톡 농도의 100 fL 주입). 테스트 결과 DMSO, 물 및 두 혼합물이 권장 부피로 주입되었을 때 명백한 발달 결함이 발견되지 않았으며 배아 생존율은 ~ 75 % 이상의 생식 밴드 확장을 통해 발견되었습니다. 1 pL 이상의 주입 부피는 결함을 일으켰고 ~ 4 pL 부피로 주입 된 배아는 1 시간 미만 동안 개발되었습니다. 따라서 주입량을 낮게 유지해야 하며, 이는 염료 농도가 높아야 함을 의미합니다.

일반적으로 배아의 측면 가장자리를 따라 주사하는 것이 가장 적은 손상을 초래하므로 권장됩니다. 그러나, 주입 부위는 채용된 FP들의 확산 특성에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다. BODIPY 493/503 및 LysoTracker는 Lipid Spot 610 (LD를 표시하는 또 다른 염료)보다 전체 배아에 걸쳐 더 빠르게 확산되는 반면, SiR-Tubulin 및 Mitoview 633은 배아 전체에 완전히 확산되지 않습니다 (주사 후 7 시간 늦게 이미징). 따라서, 관심 부위 내 또는 그 근처에서 주사가 필요할 수 있다. 전방 또는 후부 부위에 주사 할 때 특히 미세한 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.

이미지 수집은 공초점 현미경에 의존하여 광학적으로 단면화하고 작은 소기관과 모든 세포 골격 성분을 해결합니다. 많은 이미지들(예를 들어, STORM 또는 PALM)의 분석을 필요로 하는 기술들은 배아 내용물이 움직이고 형광단이 광스위칭에 최적화되어 있지 않기 때문에 작동하지 않을 것이다. Epifluorescence 현미경 검사는 대부분의 소기관과 더 작은 세포 구조를 만들기 위해 측면 및 축 방향 분해능이 부족합니다. 이러한 이유로 공초점 현미경을 사용하거나 라이트 시트 기술을 사용하는 것이 좋습니다.

이미지 분석의 재현성은 일관된 이미징 데이터에 크게 의존합니다. 가장 큰 성공 기회를 위해서는 사출 기술의 최적화와 이미지 획득이 필요합니다. 관심있는 염료(들), 주사 부위, 배아의 나이, 주사량, 및 획득 설정이 모두 일관되는 기술을 확립하고 실천하는 것은 이미지 분석을 위한 가장 강력한 데이터를 생성할 것이다.

방법의 수정 및 문제 해결
이 프로토콜은 입자 이미지 속도법을 사용하여 절단 단계 배아에서 LDs의 벌크 유동을 분석하는 방법을 시연한다. 동일한 접근법이 다른 소기관, 다른 발달 단계 및 기타 분석 방법에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 도 2 는 BODIPY 493/503 및 LysoTracker Red를 공동 주입하여 시각화된 배아 발생의 동기화 단계에서 흐르는 LDs 및 산성 소기관의 분석을 보여준다. 수정 후 최대 7 시간까지 배아에서 LD 운동의 성공적인 이미징이 달성되었습니다. 이 배아는 주사 상처를 유지하지만 몇 시간 동안 발달 할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여 수집된 데이터는 입자 이미지 속도측정에 사용되었지만 다른 많은 분석 기술을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ImageJ, Imaris 또는 수동 추적에서 발견되는 것과 같은 입자 추적 프로그램을 사용하여 이동 구조물의 속도와 방향을 얻을 수 있습니다. 대부분의 이러한 추적 소프트웨어는 평면 세포 배양 시스템의 데이터로 작동하도록 제작되었으며 Drosophila 배아와 같은 3D 구조에 항상 잘 적응하지는 않습니다. 또한, 최고 품질의 입자 추적 데이터를 생성하려면 여러 Z 평면을 이미지화해야 합니다. 이것은 이미지 스택 획득 시간이 ~ 2 초 미만인 경우 실현 가능해야합니다. 이 벤치 마크는 회전 디스크 공초점, 격자 라이트 시트 및 최근 레이저 스캐닝 공초점 시스템에서 도달 할 수 있어야합니다. 그러나, LDs, 미토콘드리아, 및 리소좀과 같은 풍부한 소기관에 대한 입자 추적의 실현 가능성은 현재의 추적 방법에 비해 시야에서 양성 신호의 양이 너무 높기 때문에 낮다. 핵 또는 노른자 소포와 같은 덜 풍부한 구조의 추적이 가능할 수 있습니다. 유동 분석을위한 PIV는 두 소기관이 자유롭게 움직이기 때문에 절단 단계에서 LD 및 산성 소기관에 잘 작동합니다. 핵, ER 및 미토콘드리아와 같은 소기관은 다른 세포 구조에 묶여 있으므로 자유롭게 움직이지 않으며 자유 운동을 가정하는 소프트웨어 분석에 적합하지 않습니다. 조사관은 관심있는 소기관에 가장 적합한 기술을 선택해야합니다.

세포융합 및 세포 배반배엽 단계 동안, LDs(뿐만 아니라 일부 다른 소기관)는 방사상 배향된 미세소관⁽⁵)을 따라 움직인다. 따라서 단일 미세소관이 장거리에 초점이 맞춰져 있는 단면도( 그림 5와 같이)를 찾을 수 있으므로 2D에서 입자 추적이 가능합니다. 이러한 광평면은 배아 내 깊숙이 있기 때문에 전체 신호 강도가 감소하고 신호 대 잡음비가 감소합니다.

추적 분석의 경우, 가능한 한 빨리 이미징하면 운동성 기계의 움직임과 그에 따른 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 지질-액적 운동은 두 개의 운동성 상태, 즉 느린 짧은 움직임(~200nm/s; 평균 이동 거리 ~100nm)과 빠른 긴 운동(~450nm/s; 평균 이동 거리 ~1,000nm)¹⁹의 혼합물이다. 따라서 이미지가 매초마다 또는 덜 자주 촬영되면 느린 짧은 상태를 감지 할 수 없게됩니다. 그러나 빈번한 이미징은 형광단 표백 및 광독성을 유도합니다. 따라서 이미징 조건은 해결해야 할 정확한 질문에 따라 조정되어야 합니다.

방법의 제한 사항
원하는 염료에 따라, 상기 방법은 염료 용해도와 주사 용액의 독성 사이의 상용성에 의해 제한될 수 있다. 이소프로판올과 에탄올과 같은 알코올은 점도가 낮기 때문에 바늘 내에서 다루기가 어렵고 세포 성분을 손상시키고 배아를 죽이는 것처럼 보입니다.

이 방법은 또한 주사를 위해 배아를 준비하는 데 30 분 이상 걸리기 때문에 배아 발생의 초기 단계를 시각화하는 데 적합하지 않습니다. 실온에서 배아의 초기 세포주기는 각각 ~ 10 분 길이입니다. 따라서 5.2.3 단계에서 새로 수정 된 난자를 선택하더라도 배아가 이미징 할 준비가되면 처음 몇 개의 세포주기가 이미 완료 될 것입니다.

UV/청색 범위의 빛을 사용한 조명은 장파장보다 훨씬 더 광독성이 높습니다. 이러한 조건 하에서(예를 들어, 자가형광성 노른자 소포를 따르기 위해; 그림 6), 이미징 시간을 제한하거나(시계열 단축으로 이어짐) 레이저 전력을 더 낮게 사용해야 합니다(신호 대 잡음비 감소).

세포화 후, 특정 위치에 주입 된 염료는 많은 세포막을 통과해야하기 때문에 잘 확산되지 않는 경향이 있습니다. 이것은 후기 발달 단계에서 관찰 영역을 제한합니다.

기존 / 대체 방법과 관련된 방법의 중요성
초기 배아에서 LDs 및 다른 지질 함유 소기관의 움직임은 유전적으로 인코딩된 형광단, 라벨-프리 기술, 및 FPs의 도입에 의해 시각화될 수 있다. 후자는 비텔린 멤브레인(¹² )의 투과화 또는 여기에서 논의된 미세주입 접근법에 의해 달성될 수 있다.

유전적으로 코딩된 형광단은 다목적 마커이며, 그의 수준은 전형적으로 배아에서 배아로 고도로 재현가능하다. 그러나 FP보다 양자 수율이 낮고 표백제가 더 쉽습니다. 일반적으로 하나 또는 두 개의 태그가 지정된 버전(예: GFP 또는 mCherry)에서만 사용할 수 있으므로 어떤 구조를 동시에 이미징할 수 있는지 선택할 수 있습니다. 반면에 FP는 종종 다양한 형태로 존재합니다. 예를 들어, UV/청색 스펙트럼의 오토닷(Autodot)에서 원적색 스펙트럼의 지질톡스 및 LipidSpot 610에 이르는 방출 스펙트럼과 함께 다양한 지질-액적 특이적 염료를 사용할 수 있다. FPs는 또한 관심있는 임의의 균주에 직접 적용될 수 있으며, 따라서 예를 들어 원하는 소기관 마커를 관심있는 돌연변이 균주 내로 도입하기 위한 균주 구축을 필요로 하지 않는다. 이 장점은 여러 구조체를 동시에 레이블 지정해야 할 때 특히 두드러집니다. 여러 세대에 걸친 시간이 많이 걸리는 십자가 대신에, 이것은 관련 염료를 혼합하고 동시에 도입함으로써 하루 만에 달성 될 수 있습니다. 마지막으로, 세포 과정이 약리학 적 억제로 프로브되는 경우, 약물과 염료가 함께 도입 될 수 있습니다.

라벨이 없는 방법은 특정 세포 구조를 검출하기 위한 매우 강력한 접근법이다. 예를 들어, LDs는 세 번째 고조파 생성 현미경(²⁰ ) 또는 펨토초 자극된 라만 손실 현미경(²¹)에 의해 초기 배아에서 특이적으로 검출될 수 있다. FP와 마찬가지로 이러한 접근법은 모든 유전 적 배경에 적용될 수 있으며 표백을 일으키지 않기 때문에 잠재적으로 더 빠른 이미지 수집을 가능하게합니다. 그러나, 이들은 전형적으로 특정 소기관으로 제한되며, 따라서 그 자체로 멀티플렉스 이미징을 지원하지 않는다; 그들은 또한 전문 현미경이 필요합니다.

배아에 소분자를 도입하기위한 두 가지 일반적인 전략이 있습니다. 하나는 여기에 사용 된 미세 주입 접근법입니다. 다른 하나는 비텔린 막을 투과시키는 화학적(terpene) 처리이다. 후자의 접근법¹² 는 미세 주사보다 덜 관여하지만, 배아에서 배아까지 더 가변적입니다. 또한, 투과 후, 비텔린 막에 의해 제공되는 보호가 손상되고 배아가 외부 배지에 적절하게 접근 할 수있어 생존을 유지하는 것이 더 어려워집니다. 미세 주입은 투과보다 배아 발달을 탈선시킬 가능성이 훨씬 적습니다. 그러나 많은 배아를 동시에 모니터링해야하는 경우 (예 : 약물 스크리닝 목적으로) 투과가 권장됩니다. 세포 구조의 움직임을 추적하고 이미지 분석에 적합한 재현 가능한 이미지 시리즈를 얻기 위해 미세 주입이 선택 방법입니다.

특정 연구 분야에서이 방법의 중요성과 잠재적 인 적용
초파리 배아는 많은 세포 생물학적 및 발달 과정 ^1,5,6을 연구하기위한 중요한 모델 시스템입니다. 형광 단백질로 소기관을 태깅하는 것은 초기 배아가 어떻게 발달하는지, 다양한 소기관이 어떻게 교통되는지, 그리고 그러한 밀매가 발달 및 유 전적으로 어떻게 조절되는지에 대한 이해에 큰 기여를했습니다. 그러나 표백제에 대한 성향과 여러 소기관이 다른 색상으로 표시된 균주를 생성하는 어려움은이 접근법의 적용을 제한합니다. 미세 주입에 의해 도입 된 FP의 사용은 이러한 많은 문제를 해결하고 형광 태그가 지정된 단백질과 결합 될 수도 있습니다. 이 기술은 모든 유전 적 배경에서 여러 소기관, 세포 구조 및 세포 골격 구성 요소의 이미징을 허용합니다. 결과적으로 라이브 이미징을 통해 여러 유전자형을 비교할 수 있으므로 돌연변이가 여러 소기관의 밀매에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 초파리 멜라노가스터의 배아에 대한 FP 주입 접근법을 보여 주지만, 원칙적으로이 접근법은 초파리 (Drosophila), 귀뚜라미²² 및 진딧물²³의 다른 종을 포함하여 미세 주사 기술이 확립 된 모든 곤충 알에 적용됩니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue