화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

요약

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

초록

자극된 라만 산란(SRS) 및 일관된 스토크스 라만 산란(CARS) 현미경은 가장 널리 사용되는 일관된 라만 산란 영상 기술입니다. 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징은 모든 픽셀에서 라만 스펙트럼 정보를 제공하므로 다양한 화학 성분을 더 잘 분리할 수 있습니다. 두 기술 모두 두 개의 여기 레이저가 필요하지만 신호 감지 체계와 스펙트럼 특성은 상당히 다릅니다. 이 프로토콜의 목표는 단일 플랫폼에서 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징을 모두 수행하고 서로 다른 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 두 현미경 기술을 비교하는 것입니다. 스펙트럼 초점 방법은 펨토초 레이저를 사용하여 스펙트럼 정보를 획득하기 위해 사용된다. 표준 화학 샘플을 사용함으로써, 동일한 여기 조건(즉, 샘플에서의 전력, 픽셀 체류 시간, 대물 렌즈, 펄스 에너지)에서 SRS 및 CARS의 감도, 공간 분해능 및 스펙트럼 분해능을 비교한다. 생물학적 샘플에 대한 CARS 및 SRS의 이미징 콘트라스트는 병치되고 비교됩니다. CARS와 SRS 성능을 직접 비교하면 화학 이미징을위한 양식을 최적으로 선택할 수 있습니다.

서문

라만 산란 현상은 1928년 C. V. 라만¹에 의해 처음 관찰되었다. 입사 광자가 샘플과 상호 작용할 때, 비탄성 산란 사건이 자발적으로 발생할 수 있으며, 여기서 광자의 에너지 변화는 분석 된 화학 종의 진동 전이와 일치합니다. 이 공정은 화학 태그를 사용할 필요가 없으므로 시료 교란을 최소화하면서 화학 분석을위한 다용도의 라벨이없는 도구입니다. 장점에도 불구하고, 자발적인 라만 산란은 낮은 산란 단면 (일반적으로 적외선 [IR] 흡수 단면보다^10,11 낮음)을 앓고 있으며, 이는 분석²를 위해 긴 획득 시간을 필요로합니다. 따라서, 라만 산란 공정의 감도를 증가시키기 위한 탐구는 실시간 이미징을 위한 라만 기술을 추진하는데 필수적이다.

라만 산란의 감도를 크게 향상시키는 한 가지 효과적인 방법은 일관된 라만 산란 (CRS) 프로세스를 사용하는 것이며, 일반적으로 두 개의 레이저 펄스가 분자 진동 전이 ^3,4를 자극하는 데 사용됩니다. 두 레이저 사이의 광자 에너지 차이가 샘플 분자의 진동 모....

프로토콜

1. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미징을 위한 도구 설정

참고: CRS 신호를 생성하려면 고전력(즉, 클래스 3B 또는 클래스 4) 레이저를 사용해야 합니다. 안전 프로토콜을 해결해야 하며 이러한 높은 피크 전력에서 작업할 때 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 실험하기 전에 적절한 문서를 참조하십시오. 이 프로토콜은 빔 경로 설계, 펨토초 펄스 치핑, 이미징 조건 최적화에 중점을 둡니다. 이 하이퍼스펙트럼 CRS 현미경의 일반적인 광학 레이아웃은 그림 1에 나와 있습니다. 여기에 표시된 구성은 CRS 현미경을 위한 많은 기존 구성 중 하나입니다. 이 프로토콜에 사용되는 CRS 현미경 시스템은 이중 출력 펨토초 레이저 소스와 레이저 스캐닝 현미경을 기반으로 구축되었습니다.

1. 레이저 소스가 스토크스 빔으로 사용되는 1,045nm의 고정 파장과 펌프 빔으로 사용되는 680 ~ 1,300nm의 조정 가능한 파장을 포함하여 80MHz의 반복률을 갖는 두 개의 펨토초 펄스 트레인(120 fs 폭)을 제공하는지 확인하십시오. 출력 펄스를 광 지연 차이와 동기화합니다. 현미경 프레임을 사용하여 이미징 플랫폼을 구축하십시오.

결과

스펙트럼 해상도의 비교
도 2는 DMSO 샘플을 이용한 하이퍼스펙트럼 SRS(도 2A) 및 CARS(도 2B) 현미경의 스펙트럼 분해능을 비교한다. SRS 스펙트럼의 경우, 스펙트럼에 맞게 두 개의 로렌치안 함수(프로토콜 단계 2.3 참조)를 적용하고, 2,913cm-1 피크를 사용하여 14.6cm-1의 분해능을 얻었다. CARS의 경우, 가우?.......

토론

여기에 제시된 프로토콜은 다중 모드 CRS 현미경의 구축과 CARS와 SRS 이미징 간의 직접적인 비교를 설명합니다. 현미경 제작의 중요한 단계는 공간 및 시간적 빔 중첩 및 빔 크기 최적화입니다. SNR을 최적화하고 라만 이동을 교정하기 위해 생물학적 이미징 전에 DMSO와 같은 표준 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. CARS와 SRS 이미지를 직접 비교하면 CARS가 더 나은 공간 해상도를 갖는 반면, SRS는 더 나은 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25x36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110