콜라겐의 표면 고정화(Surface Immobilization) 및 콜라겐 결합 분석(Collagen Binding Assay)을 위한 최적화된 방법

요약

이 연구는 유형 I 및 III 콜라겐을 마이크로플레이트에 재현성 있게 고정시키고 정량화하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시한 다음, 시간 분해 형광 방법을 사용하여 콜라겐-화합물 상호 작용을 연구하기 위한 개선된 체외 결합 분석 프로토콜을 제시합니다. 후속 단계별 데이터 분석 및 데이터 해석이 제공됩니다.

초록

섬유증은 부상이나 손상에 대한 회복 반응으로 다양한 조직에서 발생합니다. 그러나 섬유증이 과도하게 발생하면 조직 흉터와 장기 부전으로 이어질 수 있으며, 이는 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 콜라겐은 섬유증의 핵심 원인이며, I형 및 III형 콜라겐은 많은 섬유화 질환과 관련된 주요 유형입니다. 다른 단백질(예: 엘라스틴, 알부민, 피브로넥틴 등)을 고정시키는 데 사용되는 기존 프로토콜과 달리, 안정적인 코팅을 생성하기 위해 다양한 유형의 콜라겐을 재현성 있게 고정시키는 포괄적인 프로토콜은 쉽게 사용할 수 없습니다. 콜라겐을 고정시키는 것은 콜라겐의 유형, pH, 온도 및 사용된 마이크로플레이트의 유형을 포함한 여러 실험 조건이 고정의 효율성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 놀라울 정도로 어렵습니다. 여기에서는 유형 I 및 III 콜라겐을 재현성 있게 고정하고 정량화하여 안정적이고 재현 가능한 겔/필름을 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 또한 이 연구는 콜라겐과 후보 콜라겐 결합 화합물(예: 유로퓸[Eu(III)]을 운반하는 금속 킬레이트에 접합된 펩타이드) 간의 상호 작용을 조사하기 위해 체외 시간 분해 형광 결합 연구를 수행, 분석 및 해석하는 방법을 보여줍니다. 이러한 접근 방식은 표적 이미징 프로브를 개발하기 위한 분자 이미징 분야, 약물 개발, 세포 독성 연구, 세포 증식 연구 및 면역 분석을 포함한 다양한 생물 의학 응용 분야에 보편적으로 적용될 수 있습니다.

서문

조직 손상 후 자연적인 상처 치유 과정의 일부로 섬유성 결합 조직이 축적되는 것을 섬유증이라고 합니다. 그러나 섬유조직의 침착이 종결되지 않고 조직 복구에 필요한 수준을 넘어서 계속되면 섬유증이 과도하게 됩니다 ^1,2. 과도한 섬유증은 장기 생리와 기능을 손상시키고 장기 손상과 잠재적인 장기 부전을 유발할 수 있다 ^3,4,5. 섬유증의 두 가지 주요 원인은 세포외 기질(ECM) 단백질인 콜라겐 I형과^III형입니다 6. 콜라겐은 인체 총 단백질 함량의 약 1/3을 구성하는 다양한 장기에서 발견되는 구조 단백질입니다¹. 인간 게놈 염기서열 분석으로 확인된 콜라겐에는 28가지 유형이 있으며, 그 중 가장 풍부한 콜라겐은 섬유소 콜라겐입니다⁷. 1차 섬유질 콜라겐은 I형 콜라겐으로, ECM에 인장 강도와 변형에 대한 저항성을 제공합니다

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프로토콜

참고: 이 작업에 사용된 모든 제품 정보는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 콜라겐 고정화

참고: 결합 분석 중에 사용된 마이크로플레이트의 각 웰에 교차 형광을 피하기 위해 인접한 웰이 비어 있는지 확인합니다. 프로토콜의 이 부분을 얼음 위에서 수행하십시오.콜라겐은 온도와 pH 수준이 상승하면 스스로 조립되기 때문입니다. 조직 배양 후드와 멸균 조건에서 이 절차를 수행하는데, 이는 마이크로플레이트가 이후에 조직 배양(TC) 인큐베이터에서 배양되기 때문입니다.

1. 96-well 마이크로플레이트에서 I형 콜라겐의 고정화(그림 2)
   1일차
   1. 얼음이 든 실리콘 트레이를 준비합니다. I형 콜라겐이 들어 있는 바이알, 차가운 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 및 마이크로플레이트를 얼음 위에 놓고 모든 것에 70% 에탄올을 뿌립니다. TC 후드 아래에 재료를 놓습니다.
   2. 동일한 부피의 I형 콜라겐과 10x PBS(pH 7.4)를 사용하여 콜라겐....

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결과

겔/필름에 고정된 I형 및 III형 콜라겐의 안정성 및 농도 평가
웰 당 고정화된 콜라겐 농도의 정량화는 세 가지 다른 조건을 사용하여 수행되었습니다: a) 단백질을 고정시킨 후 PBS로 세척하지 않고 웰에서(세척 없음); b) 코팅되지 않은 단백질을 제거하기 위해 고정화 후 세척 단계(PBS로 2회)가 있는 웰에서; c) 1 시간 동안 PBS로 배양 한 후 웰에서 (PBS 모방 실험.......

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토론

이 연구는 I형 및 III형 콜라겐을 고정시키기 위한 재현 가능한 방법을 제시합니다. 또한 in vitro Eu(III) TRF 결합 데이터를 획득, 분석 및 해석하여 유형 I 및 III 콜라겐에 대한 후보 리간드의 결합 특성을 특성화하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에 제시된 I형 및 III형 콜라겐을 고정시키기 위한 프로토콜은 시험관 내 I형 및 III형 콜라겐 섬유형성에 대해 이전에 .......

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Gibco	14200075	Use this to make 1x PBS by diluting in water (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	Use this to make 1x PBS by diluting in water (1:10)
2M HCL			Made in house and details are in the supporting document
2M HCL			Made in house and details are in the supporting document
2M Sodium hydroxide +2M Glycine			Made in house and details are in the supporting document
2M Sodium hydroxide +2M Glycine			Made in house and details are in the supporting document
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
Ice
Ice
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader	TECAN
Non-binding (NBS) 96 well microplates	Corning	3641
Non-binding (NBS) 96 well microplates	Corning	3641
pH electrode Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH electrode Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH meter (sevenCompact)	Mettler Toledo
pH meter (sevenCompact)	Mettler Toledo
Pierce BCA protein assay kit	Thermofisher	23227
Pierce BCA protein assay kit	Thermofisher	23227
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Type I bovine collagen, 3 mg/mL	Corning	354231
Type III human placenta collagen, 0.99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021