Chimeric Small Noncoding RNA에 대한 전산 분석 튜토리얼: 표적 RNA 염기서열분석 라이브러리

요약

여기에서는 in vivo RNA:RNA 상호 작용 연구에 사용되는 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터를 분석하기 위한 생물정보학 파이프라인의 설치 및 사용을 보여주는 프로토콜을 제시합니다.

초록

microRNA(miRNA)와 같은 작은 비코딩 RNA(sncRNA)와 표적 RNA의 생체 내 유전자 조절 상호 작용에 대한 이해는 키메라 RNA 및 후속 염기서열 분석 라이브러리의 형성을 통해 sncRNA:표적 RNA 상호 작용을 포착하기 위해 교차 결합 후 결찰을 사용하는 생화학적 접근 방식에 의해 최근 몇 년 동안 발전되었습니다. 키메라 RNA 염기서열 분석의 데이터 세트는 miRNA 예측 소프트웨어보다 게놈 전체에 대한 모호성이 훨씬 적은 입력을 제공하지만, 이 데이터를 의미 있고 실행 가능한 정보로 추출하려면 추가 분석이 필요하며 계산 배경이 부족한 연구자를 설득할 수 있습니다. 이 보고서는 초급 컴퓨터 생물학자가 최신 오픈 소스 소프트웨어 도구인 SCRAP(Small Chimeric RNA Analysis Pipeline)를 설치하고 적용할 수 있도록 지원하는 자습서를 제공합니다. 플랫폼 요구 사항, 업데이트, 파이프라인 단계 및 주요 사용자 입력 변수 조작에 대한 설명이 제공됩니다. 생물학자가 키메라 RNA 염기서열 분석 접근법에서 통찰력을 얻을 수 있는 장벽을 줄이면 여러 생물학적 맥락에서 조절 sncRNA:표적 RNA 상호 작용에 대한 발견 기반 조사를 시작할 수 있습니다.

서문

작은 비코딩 RNA는 분화 및 발달, 신호 처리 및 질병과 같은 다양한 과정에서 유전자 제품군의 발현을 조정하는 전사 후 역할에 대해 고도로 연구되고 있습니다 ^1,2,3. microRNA(miRNA)를 포함한 유전자 조절 소형 비코딩 RNA(sncRNA)의 표적 전사체를 정확하게 결정하는 능력은 기본 및 번역 수준 모두에서 RNA 생물학 연구에 중요합니다. miRNA 시드 서열과 잠재적 표적 사이의 예상되는 상보성을 활용하는 생물정보학 알고리즘은 miRNA:표적 RNA 상호작용의 예측에 자주 사용되어 왔습니다. 이러한 생물정보학 알고리즘은 성공적이었지만 다른 곳에서 검토된 바와 같이 위양성 및 위음성 결과를 모두 보유할 수도 있습니다 ^4,5,6. 최근에, 단일 키메라 RNA 4,5,7,8,9,10을 형성하기 위해 sncRNA를 표적에 물리적으로 부착하기 위한 ligation 단계의 in vivo 교차결합 및 후속 통합에 의한 in vivo sncRNA:target RNA 상호작용의 모호하지 않고 반정량적인 결정을 가능하게 하는 몇 가지 생화학적 접근법이 설계 및 구현되었습니다 . 키메라 RNA로부터 염기서열분석 라이브러리의 후속 준비를 통해 염기서열분석 데이터의 전산 처리를 통해 sncRNA:표적 RNA 상호작용을 평가할 수 있습니다. 이 비디오는 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 sncRNA:표적 RNA 상호 작용의 강력하고 재현 가능한 분석을 허용하도록 설계된 소형 키메라 RNA 분석 파이프라인(SCRAP)이라는 계산 파이프라인을 설치하고 사용하는 방법에 대한 자습서를 제공합니다⁶.

이 튜토리얼의 목표는 sncRNA:표적 RNA 상호 작용의 키메라 분자 판독을 제공하는 생화학적 접근 방식을 통해 생성된 데이터 분석에 대한 장벽을 낮춤으로써 연구자가 순수 예측 생물정보학 알고리즘에 대한 과도한 의존을 피할 수 있도록 지원하는 것입니다. 이 튜토리얼은 하이브리드의 교차결합, 연결 및 염기서열분석(CLASH) 및 내인성 아르고나우트 결합 RNA의 공유 결합 및 면역침전(CLEAR-CLIP^)7,9을 포함한 여러 기존 생화학 프로토콜에 의해 생성될 수 있는 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터를 분석하기 위해 개발된 파이프라인 SCRAP을 사용하여 초급 컴퓨터 과학자를 안내하는 실용적인 단계와 팁을 제공합니다.

SCRAP의 사용은 다른 계산 파이프라인에 비해 키메라 RNA 염기서열 분석 데이터 분석에 몇 가지 이점을 제공한다⁶. 한 가지 두드러진 장점은 파이프라인의 단계에 대해 사용자 지정 및/또는 지원되지 않는 스크립트에 의존하는 대체 파이프라인과 비교하여 파이프라인 내에서 잘 지원되고 정기적으로 업데이트되는 생물정보학 스크립트에 대한 광범위한 주석과 콜아웃의 통합입니다. 이 기능은 SCRAP에 안정성을 부여하여 연구원이 파이프라인에 익숙해지고 워크플로에 사용을 통합하는 데 더 가치가 있습니다. SCRAP는 또한 sncRNA:target RNA 상호 작용의 피크를 호출하는 데 있어 대체 파이프라인을 능가하는 것으로 입증되었으며, 이전 간행물^6에 자세히 설명된 바와 같이 플랫폼 간 기능을 갖는 것으로 입증되었습니다.

이 자습서를 마치면 사용자는 (i) SCRAP에 대한 플랫폼 요구 사항을 파악하고 SCRAP 파이프라인을 설치하고, (ii) 참조 게놈을 설치하고 SCRAP에 대한 명령줄 매개 변수를 설정하고, (iii) 피크 호출 기준을 이해하고 피크 호출 및 피크 주석을 수행할 수 있습니다.

이 비디오는 RNA 생물학을 연구하는 연구원이 염기서열분석 라이브러리 준비에 대한 논의된 생화학적 접근 방식 중 하나를 통해 얻은 키메라 RNA 염기서열분석 데이터에서 전령 RNA와 같은 표적 RNA와의 sncRNA 상호 작용을 분석하기 위해 계산 파이프라인인 SCRAP를 설치하고 최적으로 사용하는 방법을 실용적으로 자세히 설명합니다.

SCRAP는 명령줄 유틸리티입니다. 일반적으로 아래 가이드에 따라 사용자는 (i) SCRAP(https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP)를 다운로드하여 설치하고, (ii) 참조 게놈을 설치하고 SCRAP를 실행하고, (iii) 피크 호출 및 주석을 수행해야 합니다.

이 절차의 계산 단계에 대한 자세한 내용은 https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP 에서 확인할 수 있습니다. 이 기사에서는 초급 수준의 계산 기술을 갖춘 연구자가 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리 데이터 세트에 SCRAP를 설치, 최적화 및 사용할 수 있도록 설정 및 배경 정보를 제공합니다.

프로토콜

참고: 프로토콜은 SCRAP를 사용하여 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리를 분석하는 데 필요한 소프트웨어를 다운로드하고 설치하는 것으로 시작됩니다.

1. 설치

1. SCRAP를 설치하기 전에 분석에 사용할 컴퓨터에 종속성 Git 및 Miniconda를 설치합니다. Git이 이미 설치되어 있을 수 있습니다. 예를 들어 Mac OSX 플랫폼에서 which git을 사용하여 이를 확인하여 " git " 유틸리티가 있고 이 디렉토리에 설치되어 있는지 확인합니다. Miniconda가 어떤 conda를 사용하여 설치되었는지 확인하십시오. 아무 것도 반환되지 않으면 Miniconda를 설치합니다. Miniconda를 설치하려면 400MB의 디스크 공간이 필요합니다.
   1. Miniconda를 설치하는 몇 가지 방법이 있으며 플랫폼에 따라 다릅니다. Windows, MacOS 및 Ubuntu에 설치하기 위한 추가 지침이 있는 Meffert Lab GitHub 리포지토리 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]의 PLATFORM-SETUP 마크다운 파일을 참조하십시오. Linux 사용자의 경우 Linux에는 자체 기본 패키지 관리자(apt)가 있습니다. 이 연구와 관련된 경우 brew install Miniconda 명령을 사용하여 기존 패키지 관리자인 brew를 사용하여 Miniconda 를 설치합니다.
      참고: 'brew'라고 하는 'Homebrew'는 Apple의 운영 체제인 macOS에서 소프트웨어 설치를 단순화하는 오픈 소스 소프트웨어 패키지 관리 시스템입니다.
   2. conda를 처음 설치하는 경우 사용 중인 특정 셸에 대해 conda init 를 실행합니다. 이 예제에서 사용 중인 셸은 zsh입니다. 그런 다음 셸을 닫았다가 다시 엽니다. conda가 성공적으로 설치되면 터미널 세션 내에서 활성화된 기본 환경이 표시됩니다.
2. SCRAP 소스를 다운로드하고 해당 종속성을 설치합니다.
   1. SCRAP 소스를 얻는 기본 방법은 Git을 사용하는 것입니다. git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP 를 실행하여 소스 코드의 최신 복사본을 가져옵니다.
   2. conda에 대한 향상된 패키지 솔버인 mamba를 설치하고 다음 명령을 사용하여 SCRAP_environment.yml에서 자체 conda 환경으로 SCRAP에 대한 모든 종속성을 설치합니다.
      conda 설치 -n base conda-forge :: 맘바
      맘바 환경 생성 -f 스크랩/SCRAP_environment.yml -n 스크랩
3. 그런 다음 SCRAP에 대한 참조 설치를 실행합니다. 참조 설치에 사용된 인수는 sncRNA-mRNA 상호 작용이 분석되는 유기체에 따라 다릅니다.
   bash SCRAP / bin / Reference_Installation.sh -r 전체 / 경로 / SCRAP / -m -g hg38 -s human
   1. 참조 설치를 위해 SCRAP 원본 폴더의 디렉터리를 제공합니다. 그런 다음 fasta 및 annotation 폴더 내의 파일을 사용하여 설치 단계를 수행합니다. 축약형 없이 전체 경로를 나열합니다. 슬래시로 끝납니다.
   2. 올바른 miRbase 종 약어는 README.md 의 표를 참조하십시오. 최신 참조 게놈은 https://genome.ucsc.edu/ 또는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ 에서 찾을 수 있습니다. 이 예에서 hg38 은 마우스 GRCm38 게놈에 사용됩니다.
   3. 현재 주석에 포함된 종은 인간, 생쥐 및 벌레입니다. SCRAP 소스 폴더의 주석 디렉토리에서 해당 species.annotation.bed 파일을 봅니다. 분석을 위해 다른 종을 사용하려는 경우 동일한 명명 체계 species.annotation.bed를 따르는 annotation.bed 파일을 제공합니다.

2. SCRAP 실행

1. 이제 종속성과 SCRAP이 설치되었으므로 스크립트를 실행합니다 SCRAP.sh
   bash SCRAP/bin/SCRAP.sh -d 전체/경로/CLASH_Human/-a 전체/경로/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p no -f 예 -r 전체/경로/to/SCRAP/ -m에는 -g hg38이 있습니다.
   1. 샘플 디렉터리에 대한 전체 경로를 축약형 없이 나열합니다. 그림 1과 같이 샘플 이름과 정확히 일치하는 폴더 이름으로 샘플 디렉터리의 형식을 지정합니다.
   2. 나열된 경로는 개별 샘플 폴더 또는 샘플 파일의 경로가 아니라 모든 샘플 폴더가 포함된 디렉터리의 경로입니다(2.1단계의 명령줄 참조).
   3. 그런 다음 어댑터 파일의 전체 경로를 나열합니다. 어댑터 파일의 샘플 이름이 이전에 언급한 폴더 이름 및 파일 이름과 일치하는지 확인하십시오(2.1단계의 명령행 참조).
   4. 샘플이 paired-end인지 여부와 pre-miRNA 및/또는 tRNA에 대한 필터링을 수행할지 여부를 나타냅니다. 원하는 경우 rRNA 세척을 위한 필터를 추가합니다(2.1단계의 명령줄 참조).
      참고: 사용자는 샘플 유형 및 실험 목표에 따라 이러한 필터를 사용할지 여부를 결정할 수 있습니다. 실험 설계에 따라 pre-miRNA, tRNA 및 rRNA는 실제 sncRNA:target RNA 키메라에 사용 가능한 염기서열분석 깊이를 소비할 수 있으며 사용자는 필터를 사용하여 이를 제외할 수 있습니다. 그러나 사용자는 특정 상황(예: sncRNA 표적을 미토콘드리아 rRNA를 포함하는 미토콘드리아 게놈에 매핑)에서 이러한 필터링을 피하기를 원할 수 있습니다.
   5. 그런 다음 참조 디렉터리의 전체 경로, miRbase 약어 및 참조 게놈 약어를 나열합니다(2.1단계의 명령줄 참조).
      참고: 사용 중인 컴퓨터의 데이터 세트 크기 및 CPU에 따라 스크립트를 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

3. 피크 호출 및 주석

1. SCRAP 실행이 완료되면 출력에 다른 파일 중에서 SAMPLE.aligned.unique.bam 파일이 포함되어 있는지 확인합니다. 이것은 사용자가 제공한 참조 게놈에 대한 표적 RNA의 정렬을 포함하는 바이너리 파일입니다.
2. 이제 Peak_Calling.sh를 실행하여 피크 호출을 수행합니다.
   bash SCRAP / bin / Peak_Calling.sh -d CLASH_Human / -a CLASH_Human / CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r SCRAP / -m에는 -g hg38이 있습니다.
   참고: 피크 콜링은 SCRAP의 기능으로, 연구원이 키메라 RNA 라이브러리 내에서 가장 강력하고 재현 가능한 작은 비코딩 RNA:표적 RNA 상호 작용을 쉽게 평가할 수 있도록 설계되었습니다. 예를 들어 이 기능은 연구원이 추가 조사를 위해 선택할 수 있는 상호 작용을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 아래의 3.2.2 단계는 사용자가 피크가 호출되는 엄격성을 정의하는 데 사용할 기준을 설정하는 방법을 설명합니다 - 여기에는 피크가 호출되기 위해 발생해야 하는 고유한 상호 작용 또는 시퀀싱 읽기의 수와 이 특정 상호 작용이 발생해야 하는 라이브러리의 수가 포함됩니다.
   1. 다시 샘플 폴더 및 어댑터 파일을 포함하는 디렉토리의 전체 경로를 나열하십시오(3.2단계의 명령행 참조).
   2. 다음으로, 피크를 호출하는 데 필요한 최소 시퀀싱 판독 횟수를 설정합니다(3.2단계의 명령줄 참조).
   3. 호출하기 위해 피크를 포함해야 하는 고유한 시퀀싱 라이브러리의 최소 수를 설정합니다(3.2단계의 명령줄 참조).
      참고: 3.2.2 및 3.2.3에 대한 값 선택은 시퀀싱된 샘플의 특성과 샘플 또는 샘플 유형 수에 따라 달라집니다. 여기서 피크를 호출하려면 샘플에서 최소 3개의 키메라 시퀀싱 판독이 필요하며, 피크는 최소 2개의 샘플에 의해 지원되어야 합니다. 예를 들어, 주어진 조건에 대해 많은 염기서열분석 라이브러리 반복실험이 있는 데이터 세트를 평가하는 연구자는 더 많은 수의 표본 염기서열분석 라이브러리에 판독이 존재하도록 결정할 수 있습니다.
   4. 동일한 계열의 sncRNA가 동일한 피크에 기여해야 하는지 여부를 나타냅니다. 예를 들어, 동일한 패밀리의 miRNA가 시드 서열을 공유하기 때문에, 이러한 miRNA는 유전자 표적의 공유 및 중첩 세트와 결합할 수 있습니다. 사용자는 집합적 피크를 평가하여 이러한 목표에 대한 패밀리의 전체 영향을 식별할 수 있습니다(3.2단계의 명령줄 참조).
   5. 그런 다음 참조 디렉터리의 전체 경로, miRBase 약어 및 참조 게놈 약어를 지정합니다(3.2단계의 명령줄 참조).
3. 피크 호출이 완료되면 피크 주석을 실행합니다.
   bash 스크랩 / bin / Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human / peaks.bed -r 스크랩 / -s 인간
   1. 피크 호출에서 결과 peaks.bed(또는 peaks.family.bed ) 파일의 전체 경로, 참조 디렉터리의 전체 경로 및 주석에 사용할 종을 나열합니다.

4. 데이터 시각화

참고: 이제 SCRAP을 사용한 모든 분석 단계가 완료되었습니다. 데이터를 시각화하려면 다음과 같은 몇 가지 방법을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 함께 시각화하려는 모든 .bam(바이너리 SAM 파일) 파일을 병합합니다(samtools 병합).
2. 병합된 결과 .bam 파일을 정렬합니다(samtools 정렬). 파일 내용은 samtools가 색인을 생성할 수 있도록 한 줄씩 정렬됩니다.
3. 정렬된 .bam 파일(samtools 인덱스)을 인덱싱합니다. 통합 유전체학 뷰어(IGV)에서 시각화할 수 있도록 BAI(바이너리 samtools 형식 색인) 파일이 생성됩니다.
4. 마지막으로 IGV에서 정렬된 결과 .bam 및 인덱싱된 .bai 파일을 엽니다.
   참고: SncRNA: 관심 표적 RNA 상호 작용은 여러 가지 조사별 방법으로 후속 조치에 우선 순위를 지정할 수 있습니다. 한 가지 일반적인 초기 접근법은 가장 키메라 염기서열분석 판독에서 피크가 지원되는 상호 작용을 평가하는 것입니다. 관심있는 상호작용은 검출된 상호작용¹¹로부터 sncRNA 및 표적 RNA 둘 다에 대한 서열을 입력함으로써 RNAstructure 패키지로부터 DuplexFold Web Server를 사용하여 또한 시각화될 수 있다. 각 피크에 대해 염색체(첫 번째 열) 및 게놈 좌표(시작: 첫 번째 열 끝: 두 번째 열)는 피크 주석에서 생성된 peaks.bed.species.annotation.txt 파일 내에서 찾을 수 있습니다. 특히 miRNA의 경우, 재현 가능하고 기능적인 상호작용은 광범위한 seed-matched binding이 부족할 수 있지만(예를 들어, 상호작용은 3' compensatory binding을 사용할 수 있음), 그럼에도 불구하고 표적 RNA의 cognate binding motif에 seed-matched site의 존재는 기능적으로 중요한 검출된 상호작용의 검증 특징으로 평가될 수 있습니다 ^4,12. 보조 데이터 처리에는 뚜렷한 생물학적 조건에서 피크 간의 차등 판독 범위 비교와 경로 분석 도구를 사용하여 조절된 유전자를 경로로 클러스터링하는 것을 잠재적으로 평가하는 것이 포함될 수 있습니다.

결과

CLEAR-CLIP⁹ 를 사용하여 준비한 이전에 발표된 염기서열분석 데이터 세트에서 변형된 버전의 SCRAP(rRNA 필터링을 위한 수정을 구현하는 SCRAP 릴리스 2.0)에 의해 검출된 sncRNA:target RNA에 대한 결과는 그림 2 및 표 1에 나와 있습니다. 사용자는 SCRAP에서 피크 호출에 의한 신뢰도 높은 상호 작용의 분리 후에 발생하는 인트론 영역과의 상대적 분획 miRNA ?...

토론

sncRNA:target RNA 상호 작용 분석을 위한 SCRAP 파이프라인 사용에 대한 이 프로토콜은 전산 분석을 시작하는 연구자를 지원하기 위해 설계되었습니다. 이 튜토리얼을 완료하면 초급 이상의 계산 경험이 있는 연구자에게 이 파이프라인과 키메라 RNA 염기서열 분석 라이브러리에서 얻은 데이터를 분석하기 위한 애플리케이션의 설치 및 사용에 필요한 단계를 안내할 수 있을 것으로 예상됩니다. 이 프로?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genomes	UCSC Genome browser	N/A	https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/
Linux	Linux	Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended
Mac	Apple	Mac OSX (>11)
Platform setup	GitHub	N/A	https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]
SCRAP pipeline	GitHub	N/A	https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP
Unix shell	Unix operating system	bash >=5.0
Unix shell	Unix operating system	zsh (5.9 recommended)
Windows	Windows	WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS