우리는이 원고들의주의 읽기위한 해럴드 허터과 헬레나 데커 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 전문 지식에 대한 Leica Microsystems에서 등록 Sidhu 감사합니다. 이 연구는 국립 과학 및 캐나다 공학 협의회, 수상 # 327100-06, 과학의 사이몬 프레 이저 대학의 학부에 의해 지원되었다.

1 부 : Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 뉴런의 Transfection 장비 설정 : 쥐 또는 마우스 hippocampal 뉴런은 Kaech와 뱅커, 2006에 따라 양식은 [4]. transfections에 사용되는 전형적인 세포 밀도는 250,000 cells/6-cm 요리입니다. 필요한 시약 및 장비 50 MM kynurenic 산성, 일반 benchtop 튜브 홀더, benchtop 쿨러를 (최고 Lipofectamine 시약의 추위를 유지하는) 포함 Lipofectamine 시약, 멤, microfuge 튜브, micropipetters 및 멸균 포셉. 절차 : <ol><li> 각 transfection 레이블을위한 두 1.5 ML 튜브, 플라스미드 DNA의 transfection 시약을 포함 한를 포함 하나. 다음 incubations은 실온에서 진행할 수 있습니다. <ol><li> 한 튜브 100 μL 멤와 플라스미드 DNA를 1.0 μg을 결합 (모든 종류의 보충없이, 멤은 equilibrated 산도의 온도가 필요하지 않습니다.) </li><li> 다른 1.5 ML 튜브 100 μL 멤와 6.0 μL Lipofectamine을 결합합니다. <ol><li> DNA 비율이 같은 경우에 halved됩니다 이중 transfections에 대한 조정은 Lipofectamine이 경우에도 필요하지 않습니다. Lipofectamine의 비율 : DNA는 제조 업체의 제안 이내에 아직도있다. 최적의 표현을위한 각각의 플라스미드에 대한 0.5-1.0 μg을 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> Lipofectamine 시약의 수명을 유지하려면, 그것은 가능 한한 짧은 시간 동안 냉장고에서 제거되어야하며 사용하지 않을 때는 benchtop 쿨러에 배치. 냉장고에서 꺼내 총 시간은 최소로 보관해야합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상온에서 5 분 튜브를 품어. </li><li> 지질 관에 DNA 인 멤 솔루션을 전송하고, 부드럽게 실온에서 30 분 부화 후, 피펫과 함께 섞는다. </li><li> 25분 후 틀지 coverslips 전에 교양 뉴런의 접시에 excitoxic 피해를 최소화하기 위해 50 MM kynurenic 산 60 μL를 추가합니다. <ol><li> 조심스럽게 플립 coverslips는 피트 쪽 접속 살균 집게를 사용하여, 그들이 중복되지 않도록 조정. coverslip의 신경 세포 - 표면 코팅 또는 접시의 glia - 코팅 표면을 긁어하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 6 cm 요리에서 매체의 약 0.5 ML를 타고 부드럽게 튜브의 DNA와 혼합, 매체의 표면에 균일하게 떨어지는 접시에 다시 DNA 솔루션을 전송할 수 있습니다. </li><li> 아니 소용돌이지만, 부드럽게 한 방향으로 앞뒤로 요리를 슬라이드를 나서 중지하고 골고루 DNA - Lipofectamine의 단지를 배포하는 수직 방향으로 반복합니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)에 90 분간 품어. </li><li> 그들이 중복되지 않도록 뒤집기 coverslips는 피트 사이드 다운, 그리고 준비. 표현식이 48 시간 일반적으로 하룻밤, 원하는 시간에 진행하도록 허용합니다. </li></ol> 2 부 : 교양 hippocampal 뉴런에 GFP - 태그 고밀도 코어 vesicles의 라이브 영상 장비 설정 : <ol><li> 라이브 세포 영상은 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 요구, 우리는 Leica 변수, 형광등 장착된 Leica DMI 6000B 거꾸로 현미경을 사용합니다. 또한 온도 컨트롤러와 객관적인 히터와 영상 챔버가 필요합니다. 우리는 워너 인스 트루먼 트의 RC - 21BR이 (cat. # TC324B) 플랫폼 히터 이외에 18 mm coverslip에 대한 수정 (cat. # PH2) 및 온도 컨트롤러 사용합니다. 챔버는 열려있는 포트, 챔버 주문시 포함될 수있는 수정을 포함하지 않습니다. 객관적인 히터는 높은 coverslip의 온도를 유지하고 온도 변동에 의한 초점의 변화를 최소화하는 것이 좋습니다. 이미지 수집의 &#39;스트리밍&#39;모드 드롭 포함한 Metamorph (분자 장치) 소프트웨어를 사용하여 하마 오카 - ER과 함께 찾았습니다. 참고 - 우리는 전체 현미경을 encloses 기후 챔버를 사용하지 마십시오. 이것은 또한 비용과 여기에서 설명한 단기 이미지가 필요하지 않습니다. </li><li> 기타 장비 및 시약은 신선한 라이브 영상 매체 (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES), 추가 18 mm 유리 coverslips, 살균 포셉, 비 멸균 포셉, Kimwipes, 진공 그리스를 포함 , 그리고 그리스를 적용하는있는 주사기 (바늘없이 또는 수정 넓은 구멍 바늘로). </li></ol> 절차 : <ol><li> (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES) 신선한 라이브 영상 매체를 준비합니다. 사용하지 않을 때 우리는 일반적으로 4 O C에서 시간과 가게에서 50mls 준비합니다. 한 번에 한 병 이상은 안된다 주일 동안 충분한 준비를하는 것이 좋습니다. 약 50-10 ML은 뉴런의 요리마다 사용됩니다. </li><li> 현미경, 카메라, 형광 램프 및 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 또한 챔버 플랫폼과 객관적인 히터에 전원을 켭니다. </li><li> 상상 준비g 챔버. <ol><li> 워너 챔버는 coverslips의 장착을위한 테플론 삽입을 포함합니다. 영구 마커로 삽입 &quot;최고&quot;의 조작, 라벨 한쪽의 용이성을 위해. </li><li> &quot;맨&quot;이라는 챔버의 측면에있는 구멍을 둘러싼 홈으로 그리스의 반지를 적용합니다. 그것은 챔버를 입력하고 관찰할 수있는 영역을 줄일 수로 초과 사용을 피하십시오. </li><li> 포셉 사용, 챔버의 &quot;최상위&quot;쪽으로 깨끗하고, 사용하지 않은 18 cm coverslip을 첨부 챔버의 recessed 홈 안에 단단히 밀봉을 만들 수의 가장자리에있는 coverslip에 부드러운 압력을 적용합니다. </li><li> 챔버 뒤집어과 챔버의 반대 (아래쪽) 측면에있는 홈에 기름과 비슷한 반지를 적용합니다. </li><li> 이상적인 챔버 소유자가 50 - ML 튜브의 뚜껑까지 -에 대한 준비 챔버 바닥 사이드를 놓습니다. </li><li> 실로 영상 매체의 750 μL를 추가합니다. 이것은 과도한 금액이지만, 그리스를 통해 밝혀 지던에서 매체를 방지해야하며 초과가 휴대 대상 coverslip이 적용되었을 때 갇혀에서 거품을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 필요한까지 조직 문화 인큐베이터에서 준비 챔버를 유지합니다. 영상 매체 증발과 조성의 변화하므로 장기간 incubations는 ~ 1 시간은 피해야한다. </li></ol></li><li> 최종 챔버 어셈블리 및 라이브 셀 이미징을 수행합니다. <ol><li> 조직 문화 후드로 인큐베이터에서 준비 챔버와 transfected coverslips의 요리를 이동합니다. </li><li> 최종 챔버 어셈블리는 세포가 중간에서 ° C 연속적으로 37 포장되어 유지하기 위해 신속하게 수행하여야한다. </li><li> 멸균 집게를 사용하면, 조심스럽게 transfected 접시에서 한 coverslip을 제거, 성장 매체를 떼어 놓으 Kimwipe로 coverslip의 가장자리를 만져. </li><li> 준비 챔버에 신경 쪽 다운 coverslip를 놓습니다. 먼저 그리스에 coverslip의 한쪽을 터치하고 트래핑 거품없이 평면 coverslip을 가져 가장자리 주변에 압력을 적용합니다. 초과 영상 매체는 예상대로 밖으로 유출됩니다. </li><li> 초과 이미징 매체를 닦아지만, 위치에서 벗어나 coverslips을 슬라이드하지 않도록주의합니다. </li><li> 사전 온수 플랫폼 히터로 챔버를 이동과 장소에 챔버를 고정. </li><li> 무대에 챔버를 전송합니다. </li><li> photobleaching 및 photoxicity을 줄이기 위해, transfected 세포를 찾기 위해 필요한 강도의 최소 금액에 램프를 조정합니다. </li><li> 낮은 배율 오일 목적 (40X)와 관심의 세포를 찾아보십시오. 그것은 최대한의 coverslip 보험을 보장하고 오른쪽에있는 작업을 아래로 중복 이미지 인수, coverslip의 예를 들어, 왼쪽 위, 최대 스캔 및 방지 계획의 검색 패턴에 충실하기 위해 유용합니다. </li><li> 원하는 필드가 위치되고 나면 높은 배율 오일 목표 (60 - 100x)로 전환합니다. </li><li> 찬란 - 표시 단백질 역학의 동영상을 기록하려면 &quot;스트림 인수&quot;또는 이미징 소프트웨어의 비교 기능을 사용하십시오. </li><li> 나중에 분석 및 프리젠 테이션을위한 단계 이미지와 다른 이미지를 동반 (예 : 가용성식이 GFP) 가져가라. </li><li> 더욱 coverslip을 탐구하고 다음 비디오를 녹화하기 전에 모든 이미지를 저장합니다. </li><li> 통상 coverslip 3-5 동영상이 성공적으로 간주됩니다. 교통이 손상된 세포의 감소로 Phototoxicity와 일반 세포의 건강은 염두에 보관해야합니다. 세포 건강 위상 현미경을 사용하여 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 녹음이 coverslip 당 약 30 분 동안 수행됩니다. </li></ol></li></ol> 파트 3 : 대표 결과 : 라이브 셀 이미징 관찰은 일반적으로 뷰 (그림 1A)의 분야 내에서 찬란 - 태그 organelles의 움직임을 보여주 비디오 (또한, 이미지의 &quot;스택&quot;으로 함)로 이루어져 있습니다. 각각의 동영상을 동반하는 것은 종종 단백질 발현 및 / 또는 세포의 건강의 세포 기관, 레벨에 관한 전망 분야의 방향을 보여주는 이미지를 지원하고 있습니다. 교통 동영상 kymographs (그림 1B)로 변환하여 정량 분석​​을 받게 될 수 있습니다. Kymographs는 각 시점이 kymograph의 열에 의해 표현 라인 스캔 juxtaposing하여 입자의 움직임을 보여주는 이미지입니다. 그림 2는 반대 방향으로 이동이 입자가 kymograph로 표현하는 방법을 보여줍니다. kymographs의 자세한 분석은 입자 유량, 속도, 실행 길이, reversals, 그리고 고정 입자에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> 그림 1. 대표 라이브 셀 이미징었습니다. mCherry - 태그 티슈 Plasminogen 활성제 (TPA) 교통의 동영상 (A)을 선택 프레임. anterograde 이사 개별 입자 (녹색 화살표)와에 역행 (빨간색 화살표) 방향이 표시됩니다. (B) 해설 Kymographs은 TPA - mCherry 운동축삭. 대각선 라인은 세포 본체에서 (긍정적인 경사) 또는 (음수 경사) 방향으로 멀어 organelles를 대표하면서 kymographs의 수평 라인, 고정된 개체를 나타냅니다. 긴 녹색과 빨간색 화살표는가 (A)의 입자에 해당하는 실행 보여줍니다. 미세 소관 depolymerizing 시약, nocodazole로 인해 교통의 변화는 또한 kymograph와 그림입니다. 대각선 라인의 부재에 의해 움직이는 organelles의 감소에 유의하십시오.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

라이브 셀 이미징은 교양 뉴런의 organelle 운송의 직접 관찰하기 위해 도전하지만, 강력한 기술입니다. 어려움 문화 합병증으로 인해 가난한 사람의 신경 세포 건강과 절차의 상류 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 건강 (예제 심판을 참조하십시오. 4) 성장 매체의 조직 문화 라이트 현미경을 사용하는 동안 coverslips을 준수하여 transfection 이전과 이후 평가해야합니다. 전송의 과정을 신경 세포를 포?...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

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David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

관찰하고 역동적인 세포 과정을 특성화하는 것은 정적인 이미지에서 얻은 수없는 세포 활동에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 바이탈 형광 프로브, 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)은 특정 세포내 구획과 세포 구조를 분류하는 능력에서 형태소 분석 세포 생물학 혁명을했습니다. 예를 들어, GFP (및 그 변종 스펙트럼) chimeras의 라이브 영상이 생물과 세포 유형 [1-3]는 수많은에 cytoskeleton, organelle 전송 및 멤브레인 역학의 동적 분석을 위해 사용할 수있다. 라이브 영상이 널리 사용되고 있지만,이 방법은 여전히​​ 특히 기본 교양 뉴런에서 많은 기술적인 도전, 포즈. 하나의 문제는 사후 mitotic의 뉴런에 GFP - 태그 단백질의 표현이며, 다른 하나는 photobleaching, 일반 세포의 건강을 유지, phototoxicity을 최소화하면서 형광 이미지를 캡처하는 능력입니다. 여기 우리는 그러나 완전히 양극 뉴런의 이미징에 이상적입니다, 상대적으로 낮은 transfection 속도 (~ 0.5 %) 산출 지질 기반 transfection 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 단일 axons과 dendrites가 anterograde 대 역행 교통, 즉의 방향을 확인하는 세포 기관에 자신의 방향으로 특성화 할 수 있도록 낮은 transfection 속도가 필수적이다. 뉴런을 표현하는 영상 GFP에 대한 우리의 접근 방식은 CCD 카메라, 이미지 캡처 소프트웨어 및 온수 영상 챔버와 복 표준 넓은 필드 형광 현미경에 의존합니다. 우리는 특별한 광학이나 형광등 광원 이외의 여기 조건없이 예를 들어, 고밀도 코어 vesicles, mitochondria, 성장 콘, 그리고 굴지 organelles 또는 구조의 다양한 몇 군데 있습니다. 또한 spectrally - 별개의, 찬란 표시된 단백질, 예를 들면, GFP 및 dsRed - 태그 단백질은, 공동 운송 또는 다른 조정 세포 이벤트를 특성화 동시에 가까운 시각하실 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 접근 이미징 어플 리케이션의 다양한 유연하고 상대적으로 작은 비용 실험실 채택 수있는 것은 현미경을 사용할 수있는 제공됩니다.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  Simon Fraser University. organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

비디오: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Hippocampal 뉴런의 유전자 총을 Transfection

연구

생물학

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

P0 신생아 쥐에서 Hippocampal 신경의 주요 문화

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

교양있는 세포 기관 전송<em&gt; 초파리</em&gt; 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...